Bệnh do sán lá lớn ở gan là bệnh phổ biến ở trâu bò và các động vật khác như dê, cừu. Bệnh có khả năng lây truyền qua người do ăn rau sống mọc dưới nước có chứa nang trùng. Có hai loại sán lá lớn ở gan là Fasciola gigantica và Fasciola hepatica.
LỜI CẢM ƠN Với tất cả lòng thành, đời đời nhớ ơn công lao sinh thành, dưỡng dục và tất cả những gì ba mẹ đã dành cho con để con có được như ngày hôm nay. Với tất cả lòng kính trọng, em xin cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã giảng dạy và truyền thụ kiến thức cho em trong suốt bốn năm học qua. Con xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS. TSKH. Nguyễn Lê Trang - người thầy hết sức tận tâm hướng dẫn, dạy dỗ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho con trong suốt thời gian học tập và làm khóa luận tại Viện Pasteur. Em xin chân thành cảm ơn TSKH. Nguyễn Ngọc Hải - Giảng viên Khoa Chăn Nuôi - Thú Y đã tạo điều kiện và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn Ths. Nguyễn Thị Nguyệt Thu, CN Đỗ Thị Châm, CN Võ Thị Mỹ Duyên, chị Thêm, chị Sim và đặc biệt là CN Dương Ngọc Diễm phòng Miễn Dịch, Viện Pasteur đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và động viên ủng hộ tinh thần cho em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Trong lúc thực hiện đề tài này, chúng tôi có được sự giúp đỡ rất tận tình của GS. BS Trần Vinh Hiển và PGS. TS Trần Thị Kim Dung, Bộ môn Ký Sinh Trùng đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Đốc Viện Pasteur - Thành phố Hồ Chí Minh đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu tại Viện. Tôi xin cảm ơn các bạn lớp DH01SH - Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã gắn bó và giúp đỡ tôi trong suốt bốn năm học qua. SV: Nguyễn Thị Quỳnh Nga. ii iii TĨM TẮT KHĨA LUẬN NGUYỄN THỊ QUỲNH NGA, Đại học Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “THU THẬP DỊCH TIẾT TỪ FASCIOLA GIGANTICA VÀ SỬ DỤNG LÀM KHÁNG NGUN TRONG CHẨN ĐỐN”. Hội đồng hướng dẫn: PGS.TSKH NGUYỄN LÊ TRANG TSKH. NGUYỄN NGỌC HẢI Bệnh sán lá gán lớn ở trâu bò và các động vật nhai lại khác như dê, cừu là một trong những ngun nhân gây tổn thất kinh tế trong ngành cơng nghiệp chăn ni. Ngồi ra, bệnh còn gặp ở người với những triệu chứng lâm sàng khơng rõ ràng nên gây khó khăn trong việc chẩn đốn và điều trị bệnh. Trước những u cầu cấp thiết như vậy, được sự đồng ý của Viện Pasteur TPHCM và trường đại học Nơng Lâm TPHCM, chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài: “Thu thập dịch tiết từ Fasciola gigantica và sử dụng làm kháng ngun trong chẩn đốn” Các kết quả thu được: • Số lượng sán thu thập cho nghiên cứu là 17 con và 80 ml dịch tiết. • Xác định được nồng độ protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn bằng phương pháp Bradford. • Xác định được thành phần protein trong dịch tiết bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 12%. • Dùng phương pháp Ouchterlony, sử dụng protein tiết từ sán làm kháng ngun, phát hiện kháng thể ở huyết thanh bệnh nhân. • Tạo giá sắc ký ái lực Sepharose 4B – protein(s) tiết để tinh chế kháng thể đặc hiệu ở huyết thanh người nhiễm sán Fasciola sp. • Tinh chế kháng thể kháng Fasciola sp từ huyết thanh bệnh nhân nhiễm sán lá gan lớn. • Sử dụng kháng thể tinh chế qua sắc ký ái lực miễn dịch để chế tạo hệ thống thử nghiệm phát hiện kháng ngun. ii iv MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục . v Danh sách các chữ viết tắt vii Danh sách các bảng . viii Danh sách các hình . ix PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục đích của đề tài 2 1.3 Yêu cầu .2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược lịch sử nghiên cứu sán lá gan và bệnh do sán lá gan lớn gây nên .3 2.2 Vòng đời của sán lá gan lớn (Fasciola sp) 3 2.3 Hình thái sinh học của sán lá gan lớn (Fasciola sp) 5 2.4 Tác hại của bệnh do sán lá lớn ở gan 6 2.4.1 Ở gia súc 6 2.4.2 Ở người .7 2.5. Chẩn đoán, phòng ngừa và điều trị bệnh sán lá gan lớn .8 2.5.1 Ở gia súc 8 2.5.2 Ở người .9 2.6 Dịch tiết từ sán lá gan lớn trong thời gian ký sinh có vai trò sinh học 11 2.6.1 Protein tiết và đáp ứng miễn dịch 11 2.6.2 Hoạt động protease 12 PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 3.1 Thời gian và địa điểm .13 3.2 Vật liệu .13 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu .13 3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 13 3.2.2.1 Thiết bị .13 3.2.2.2. Dụng cụ .14 3.2.3 Hóa chất và cách chuẩn bị các dung dịch 14 3.3 Phương pháp .17 3.3.1 Quy trình lấy mẫu .17 3.3.2 Định lượng protein bằng phương pháp đo mật độ quang OD 280 .17 ii v 3.3.3 Xác định nồng độ protein bằng phương pháp Bradford .18 3.3.4 Điện di SDS-PAGE 12% xác định thành phần protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn Fasciola gigantica 21 3.3.5 Phương pháp miễn dịch khuếch tán kép Ouchterlony 26 3.3.6 Quy trình tạo cột sắc ký ái lực miễn dịch để tinh chế kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên tiết của sán lá gan lớn 27 3.3.7 Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh hoặc trong phân bệnh nhân .28 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nồng độ protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn được xác định bằng phương pháp Bradford 31 4.2 Kết quả điện di SDS-PAGE 12% xác định thành phần protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn .31 4.3 Kết quả khuếch tán miễn dịch Ouchterlony kiểm tra độ đặc hiệu của kháng nguyên tiết trong vật liệu tiết của sán lá gan lớn so với kháng nguyên thân của chính nó 33 4.4 Kết quả tinh chế kháng thể kháng Fasciola sp từ huyết thanh bệnh nhân .33 4.5 Giải hấp kháng thể từ cột sắc ký ái lực tạo với kháng nguyên tiết .35 4.6 Kết quả phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân bằng phương pháp ELISA .35 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .37 PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO .38 PHỤ LỤC 41 ii vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ab Antibody Kháng thể Ag Antigen Kháng nguyên BSA Bovine Serum Albumin Albumin huyết thanh bò ELISA Enzyme Linked Immunospecific Assay Thử nghiệm miễndịch cộng hợp enzyme IgG Immunoglobulin G Globulin miễn G MW Molecular Weight Trọng lượng phân tử OD Optical density Mật độ quang OP peroxydase OPD O-phenylenediamine PBS Phosphate Buffer Saline Đệm muối phosphate SDS Sodium Dodecyl Sulfate PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis ii vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.3.3 – Tổ chức thực hiện đường chuẩn protein theo nồng độ BSA . .20 Bảng 3.3.4 – Cách chuẩn bị một gel polyacrylamide 12%T 24 Bảng 3.3.7 – Bố trí hệ thống ELISA để phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân . 29 Bảng 4.6 – Kết quả phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân bằng hệ thống ELISA 35 . ii viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 – Chu kỳ phát triển của sán lá gan lớn (Fasciola sp) 4 Hình 2.2 – Hình thái sinh học của sán lá gan lớn (Fasciola sp) . 6 Hình 2.5.1 – Trứng sán lá gan lớn (Fasciola sp) 8 Hình 2.5.2.1 – Hình chụp CT bệnh nhân bị nhiễm sán lá gan lớn 10 Hình 2.5.2.2 – Hình chụp siêu âm của bệnh nhân nhiễm sán lá lớn ở gan . 10 Hình 3.3.2 – Biểu đồ quang học máy đo quang phổ 250 – 700 nm (UV – VIS) 18 Hình 3.3.3 – Cấu trúc hóa học của Coommassie Brilliant Blue G-250 . 19 Hình 3.3.4.1 – Các thành phần được sử dụng để tạo gel polyacrylamide 22 Hình 3.3.4.2 – Phản ứng chuỗi đa phân hóa acrylamide 22 ii ix Hình 3.3.4.3 – Phản ứng tạo liên kết chéo nối hai sợi đa phân acrylamide 23 Hình 3.3.5 – Phân tích kết quả từ các miễn dịch khuếch tán kép trên thạch agarose (Ouchterlony) 26 Hình 3.3.7 – Sơ đồ nguyên tắc phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên 28 Hình 4.2.1 – Kết quả điện di để xác định trọng lượng phân tử của các protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn 31 Hình 4.2.2 – Đồ thị tuyến tính giữa đường di chuyển của các protein chuẩn và trọng lượng phân tử 32 Hình 4.3 – Kết quả miễn dịch khuếch tán kép phát hiện kháng thể đặc hiệu ở huyết thanh bệnh nhân 33 Hình 4.5 – Tinh chế kháng thể qua sắc ký ái lực dùng Sepharose – 4B cộng hợp với protein tiết từ Fasciola gigantica . 34 Hình 4.6.1 – Đồ thị hệ thống ELISA phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân . 35 Hình 4.6.2 – Đồ thị biểu hiện sự biến động của kháng nguyên tuần hoàn trong máu và trong phân bệnh nhân nhiễm Fasciola sp . 36 ii x . hiện đề tài: Thu thập dịch tiết từ Fasciola gigantica và sử dụng làm kháng ngun trong chẩn đốn” Các kết quả thu được: • Số lượng sán thu thập cho nghiên. Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. THU THẬP DỊCH TIẾT TỪ FASCIOLA GIGANTICA VÀ SỬ DỤNG LÀM KHÁNG NGUN TRONG CHẨN ĐỐN”. Hội đồng hướng dẫn: PGS.TSKH