28 cột có chứa sẵn đệm Tris. Cho đệm Tris vào đầy cột, đặt frit còn lại vào cột và rửa lại một lần nữa bằng đệm Tris. Giải hấp: Sau khi nén cột ta cho kháng thể đã tinh chế vào cột rồi cũng cân bằng lại cột bằng đệm Tris. Giải hấp kháng thể kháng kháng nguyên tiết của sán lá gan lớn bằng glycine 0,1M, pH=2.5. Sau khi giải hấp cũng rửa cột với đệm Tris để cân bằng lại cột. 3.3.7 Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh hoặc trong phân bệnh nhân Nguyên tắc chung của kỹ thuật ELISA là nguyên tắc bánh kẹp (Sandwich), tạo liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Sự liên kết đó biểu hiện hợp thức liên kết hóa học cho phép định lượng sự có mặt của kháng thể hoặc kháng nguyên. Kháng thể hoặc kháng nguyên có thể được xác định khi được nhận biết đặc hiệu bằng một kháng thể thứ hai cộng hợp với hệ biotin – Streptavidin – enzyme sẽ tạo ra sản phẩm có màu khi tác dụng với cơ chất phù hợp. Hình 3.3.7 – Sơ đồ nguyên tắc phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên OPD B B Streptavidin - PO Polystyrene Giai đoạn gắn bản Giai đoạn phản ứng 29 Gắn IgG kháng nguyên tiết vào giếng nhựa polystyrene Phủ protein lên giếng nhựa: IgG kháng nguyên tiết pha trong đệm NaHCO 3 - Na 2 CO 3 0,1 M, pH = 9,6 thu được dung dịch kháng thể có nồng độ 5 µg/ml. Cho vào mỗi giếng 100 µl dung dịch trên. Ủ qua đêm ở 4 0 C. Rửa giếng 3 lần bằng đệm PBS -thimerosal 0,01%, Tween 20 0,05%, gelatine 0,5% (đệm 1). Dung dịch bão hòa: Bão hòa các vị trí kháng thể không gắn vào giếng bằng dung dịch Tris 0,1 M; NaCl 0,15M; EDTA 1mM; Tween 20 0,05%; gelatine 0,5%; pH = 8 (375 µl/ giếng) trong 60 phút ở 39 0 C. Rửa giếng 3 lần bằng đệm 1. Thực hiện phản ứng trên giá rắn: Pha kháng nguyên tiết trong huyết thanh âm thành các dung dịch có nồng độ kháng nguyên tiết lần lượt 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,25 (ng/ml). Cho các dung dịch vừa pha vào giếng (100 µl/giếng) theo bảng sau: Bảng 3.3.7 – Bố trí hệ thống ELISA để phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân Giếng 1 2 A Huyết thanh âm Huyết thanh âm B 31,25 ng kháng nguyên tiết C 62,5 x D 125 x E 250 x F 500 x G 1000 x H Huyết thanh dương Huyết thanh dương Ủ 39 0 C, 60 phút. Sau đó, rửa ba lần với đệm 1. Cho IgG kháng nguyên tiết -biotin vào (100 µl/giếng). Ủ 39 0 C trong 30 phút. Sau đó rửa ba lần với đệm 1. 30 Cho Streptavidin – peroxydase vào (100 μl/giếng). Ủ nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó cho OPD vào (100 μl/giếng). Ủ nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó chờ khoảng 15 phút để hiện màu. Rồi cho vào mỗi giếng 100 μl dung dịch H 2 SO 4 1,5N. Sau đó đem đi đọc kết quả bằng máy đọc ELISA Sanofi Pr 2100 ở 1 = 490 nm và 2 = 620 nm. 31 Albumin Papain Mẫu Lysozyme PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nồng độ protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Bradford Sau khi xử lý số liệu bằng phần mềm KC4 ta tính được nồng độ protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn Nồng độ protein đo được = mlmg/38,1 3 4433,12806,14258,1 4.2 Kết quả điện di SDS-PAGE 12% xác định thành phần protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn Hình 4.2.1 – Kết quả điện di để xác định trọng lƣợng phân tử của các protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn Giếng 1, 2, 3, 5, 7: Protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn với các nồng độ khác nhau. Giếng 4,6 : Protein chuẩn - Albumin ( MW = 66 kDa; Nồng độ 1,53 mg/ml) - Papain (MW = 23 kDa; Nồng độ 2,8 mg/ml) - Lysozyme (MW = 14 kDa; Nồng độ 4,3 mg/ml) 32 Hình 4.2.2 – Đồ thị tuyến tính giữa đƣờng di chuyển của các protein chuẩn và trọng lƣợng phân tử Nhận xét: Dựa theo hình điện di và đồ thị trên ta thấy trong dịch tiết của sán lá gan lớn có một thành phần protein trội có trọng lượng phân tử xấp xỉ trong khoảng từ 27 – 29 kDa. 4.3 Kết quả miễn dịch khuếch tán kép kiểm tra độ đặc hiệu của kháng nguyên tiết trong dịch tiết của sán lá gan lớn so với kháng nguyên thân của chính nó Kháng nguyên tiết và kháng nguyên thân của sán lá gan lớn được pha loãng bậc hai nồng độ bắt đầu từ ½ với PBS. Cho mẫu vào giếng tương ứng. Ta có kết quả như sau: 33 Kháng nguyên tiết Kháng nguyên thân Hình 4.3 – Kết quả miễn dịch khuếch tán kép phát hiện kháng thể đặc hiệu ở huyết thanh bệnh nhân Kết quả cho thấy đường tủa giữa kháng nguyên tiết và kháng thể của bệnh nhân bị nhiễm bệnh rõ nét hơn. Cho thấy độ đặc hiệu của kháng nguyên tiết cao hơn kháng nguyên thân so với kháng thể của Fasciola sp. 4.4 Kết quả tinh chế kháng thể kháng Fasciola sp từ huyết thanh bệnh nhân Từ 4ml huyết thanh ban đầu của bệnh nhân bị nhiễm Fasciola sp qua giai đoạn tủa kháng thể. Sau khi đo OD 280 ta thu được nồng độ kháng thể 21 mg/ml. Bảo quản kháng thể thu được trong dung dịch đệm PBS 1X. 34 4.5 Giải hấp kháng thể từ cột sắc ký ái lực tạo với kháng nguyên tiết IgG kháng nguyên tiết 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 10 20 30 Đoạn 1ml OD280nm Hình 4.5 – Tinh chế kháng thể qua sắc ký ái lực dùng Sepharose – 4B cộng hợp với protein tiết từ Fasciola gigantica. Sau khi giải hấp với glycine pH = 2.5, các đoạn số 1 đến số 27 được gom lại và hấp phụ quang trung bình đo được là: [IgG kháng nguyên tiết ] = 0,293 mg/ml 35 0 0.5 1 1.5 2 0 125 250 375 500 625 750 875 1000 Nồng độ kháng nguyên tiết (ng/ml) Abs 490 nm 4.6 Kết quả phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân bằng phƣơng pháp ELISA Sau khi xử lý số liệu bằng phần mềm KC4 ta có kết quả như sau: Bảng 4.6 – Kết quả phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân bằng hệ thống ELISA ] Hình 4.6.1 – Đồ thị hệ thống ELISA phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân Giếng 1 2 A 0.014 0.016 HT - B 0.728 0.726 31.25ng C 1.099 1.124 62.5 D 1.312 1.418 125 E 1.506 1.367 250 F 1.558 1.339 500 G 1.495 1.406 1000 H 0.013 0.012 HT + 36 Kết quả cho thấy hệ thống hoạt động tốt phát hiện được hàm lượng kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân ở giá trị 125 ng/ml. Tuy nhiên ở huyết thanh bệnh nhân dương tính không cho thấy có kháng nguyên tiết có thể đây là trường hợp nhiễm Fasciola sp mãn tính nên lượng kháng nguyên tiết sẽ được bài tiết ra trong phân. Hình 4.6.2 – Đồ thị biểu hiện sự biến động của kháng nguyên tuần hoàn trong máu và trong phân bệnh nhân nhiễm Fasciola sp [11] . khuếch tán kép kiểm tra độ đặc hiệu của kháng nguyên tiết trong dịch tiết của sán lá gan lớn so với kháng nguyên thân của chính nó Kháng nguyên tiết và kháng nguyên thân của sán lá gan lớn được. cao hơn kháng nguyên thân so với kháng thể của Fasciola sp. 4. 4 Kết quả tinh chế kháng thể kháng Fasciola sp từ huyết thanh bệnh nhân Từ 4ml huyết thanh ban đầu của bệnh nhân bị nhiễm Fasciola. Gắn IgG kháng nguyên tiết vào giếng nhựa polystyrene Phủ protein lên giếng nhựa: IgG kháng nguyên tiết pha trong đệm NaHCO 3 - Na 2 CO 3 0,1 M, pH = 9,6 thu được dung dịch kháng thể