37 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Sau khi thu thập dịch tiết từ Fasciola gigantica và xác định nồng độ protein trong dịch tiết bằng phương pháp Bradford, ta thu được xấp xỉ 6,5 mg protein tiết/ 1 con sán/ 24 giờ. Dịch tiết của sán lá gan lớn chứa những thành phần protein trội có trọng lượng phân tử trong khoảng từ 27-29 kDa. Đặc tính kháng nguyên tiết trong thành phần protein này đặc hiệu hơn so với kháng nguyên thân của Fasciola sp nên có thể sử dụng để chẩn đoán bệnh sán lá gan lớn ở người chính xác hơn. Với protein tiết, một giá sắc ký ái lực đã được thực hiện. Giá sắc ký này đã cho phép tinh chế từ huyết thanh bệnh nhân kháng thể (IgG), đặc hiệu với protein tiết của sán. Các kháng thể này đã được sử dụng để thực hiện một hệ thống thử nghiệm miễn dịch cộng hợp enzyme (ELISA) để sử dụng trong chẩn đoán. 5.2 Đề nghị Gia tăng độ nhạy của phản ứng ELISA. Sử dụng kháng nguyên tiết để phát hiện kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân nhiễm Fasciola sp. Thử nghiệm phát hiện kháng nguyên tiết trong phân bệnh nhân. Xác định lại hoạt tính và tinh chế enzyme cystein-protease trong dịch tiết của sán lá gan lớn. Trên cơ sở đó ứng dụng những kỹ thuật phân tử để nghiên cứu những đặc tính của enzyme trong mục đích chẩn đoán và điều chế vaccine chống sán lá gan lớn. 38 PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần tiếng Việt 1. Trần Thị Kim Dung. Chẩn đoán một số bệnh ký sinh trùng bằng phương pháp huyết thanh miễn dịch men. Chuyên ngành Ký Sinh Trùng học. Luận án Tiến sĩ khoa học Y Dược. Trường đại học Y Dược TP HCM, 1995. 2. Trần Thị Kim Dung, Trần Vinh Hiển, và Phan Anh Tuấn. Chẩn đoán bệnh sán lá lớn ở gan Fasciola gigantica bằng phương pháp huyết thanh miễn dịch ELISA và huỳnh quang. Tạp chí Y học Đại học Y Dược TP HCM. Công trình nghiên cứu khoa học, trang 201-204, 1994. 3. Trần Vinh Hiển, Trần Thị Kim Dung, Nguyễn Hữu Chí, Phan Hữu Danh, Phạm Thị Hạnh. Bệnh do sán lá lớn ở gan Fasciola sp trên người tại Việt Nam. Tạp chí Y học Đại học Y Dược TP HCM. Số đặc biệt chuyên đề Ký Sinh Trùng. Phụ bản của tập 5, số 1, trang 75-78, 2001. 4. Phan Địch Lân. Bệnh sán lá gan trâu bò do Fasciola gigantica ở phía Bắc Việt Nam. Luận án Phó tiến sĩ thú y. H. Bộ Nông Nghiệp, 1980. Phần tiếng nƣớc ngoài 5. A.Y. SHEHAB et al, 1999. Serogiagnosis and assessment of antigens in the sera of patients with fascioliasis by IELISA.Tropical Medicine and International Health Volume 4, N 0 10; pp 686 – 690. Medical Research Institute, University of Alexandria, Egypt. 6. B. GÖNEç. H. O. SARIMEHMETOĞLU. M. KARA. F. KIRCALI, 2003. Comparison of Crude and Excretory/Secretory Antigens for the Diagnosis of Fasciola hepatica in Sheep by Western Blotting. Turk J Vet Anim Sci. 28 (2004) 943-949, Turkey. 39 7. Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. A ral. Biochem. 72: 248-254. 8. Peter R.Collins, Colin M. Stack et al, 2004. Cathepsin L1, the Major Protease Involved in Live Fluke (Fasciola hepatica) Virulence. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, N o . 17, Issue of April 23, pp 17038-17046, USA. 9. Cooper, Terrance G.(1977). The tools of Biochemistry. John Willey and Sons, Interscience publication, United State of America. pp 36-307. 10. John P. Dalton, Sharon J. Andrew. Induction of protective immunity in cattle against infection with Fasciola hepatica by vaccination with cathepsin L proteinase and with Hemoglobin. Infection and Immunity, Dec. 1996, pp 5066- 5074. United Kingdom. 11. ESPINO et al. Dynamics of Antigenemia and Coproantigens during a human Fasciola hepatica Outbreak. Journal of Clinical Microbiology, Sept. 1998, pp 2723 – 2726. Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kouri”, Ciudad de La Habana, Cuba. 12. ESPINO et al, 1990. Detection of Circulating Excretory Secretory Antigens in Human Fascioliasis by Sandwich Enzyme- Linked Immunosorbent Assay. Jounal of clinical microbiology, pp 2637-2640. Instituto Medicina Tropical “Pedor Kouri” Apartado 601 Zona 13, Havana, Cuba 13. Louis Nguyen Anh Van (1985). Essai d’enseignement des cycles parasitaires par le graphisme. Thèse pour le Doctorat en Médecine. Université de Paris. Sud. p28. 14. Ortiz, P.L. Claxton. J. R Clarkson, M.J. Mc Garry, J. Williams, D.J. L . The specificity of antibody responses in cattle naturally exposed to Fasciola hepatica. Vet. Parasit 2000:93:121:124. 40 Internet 15. http://www.med.cmu.ac.th/dept/parasite/trematode/Fga.html 16. http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/gellab2.html 17. http://www.med-chem.com/ 18. http://sbio.uct.ac.za/Sbio/documentation/Bradford%20assay.html 41 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Môi trƣờng nuôi sán lá gan Fasciola gigantica để thu đƣợc kháng nguyên tiết Môi trường RPMI 1640 1X (104,3 g/10 lít) bổ sung 2g NaHCO 3 /1lít Thành phần Đơn vị (mg/l) Ca(NO 3 ) 2 .4H 2 O KCl MgSO 4 (anhydrid) NaCl Na 2 HPO 4 (anhydrid) D-Glucose Glutathione Rouge de Phénol L-Arginine HCl L-Asparagine Acide L-Aspartique L-Cystine. 2HCl Acide L-Glutamique L-Glutamine Glycine L-Histidine L-Hydroxyproline L-Isoleucine L-Leucine L-Lysine HCl L-Méthionine L-Phénylalanine 100,00 400,00 48,84 6000,00 800,00 2000,00 1,00 5,00 241,86 50,00 20,00 65,15 20,00 300,00 10,00 15,00 20,00 50,00 50,00 40,00 15,00 15,00 42 L-Proline L-Sérine L-Thréonine L-Tryptophane L-Tyrosine L-Valine D-Biotine Pantothénate de Calcium D Chlorure de Choline Acide Folique i-Inositol Nicotinamide Acid Para-aminobenzoique Pyridoxal HCl Riboflavine Thiamine HCl Vitamine B 12 20,00 30,00 20,00 5,00 20,00 20,00 0,20 0,25 3,00 1,00 35,00 1,00 1,00 1,00 0,20 1,00 0,005 (Theo Catalogue 1996-97 Culture Cellulaire – Hãng Gibco BRL. Code 51800 – 035. Produced in U. K by life Technologies LTD, P. O. Box 35 PAISLEY). Pha 500 ml môi trường RPMI 1640 1X (m = 5,215g + 1g NaHCO 3 ). Chỉnh pH = 7,3 bằng HCl đặc. Bổ sung 300 µl Penicillin 1000000U (nồng độ 200 000 U / 1 ml). Thêm vào 300 µl Streptomycin 1000000 µg (nồng độ 200 mg / 1 ml). Cho dung dịch qua lọc vô trùng 0,22 µm để khử trùng. Phân phối đều vào các ống nghiệm, mỗi ống 5 ml giữ trong 4 0 C. Tất cả các thao tác đều thực hiện trong điều kiện vô trùng. 43 Hình - Các ống nghiệm chứa môi trƣờng RPMI 1640 dùng để nuôi sán bên ngoài vật chủ Phụ lục 2: Hình cột sắc ký ái lực để tinh chế kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên tiết của sán lá gan lớn 44 Phụ lục 3: Máy đo quang phổ hấp thụ Spectrophotometer U 3310 Hitachi (Japan) Phụ lục 4: Máy đọc Elisa Sanofi PR 2100, Diagnostics Pasteur 45 Phụ lục 5: Các giếng thực hiện phản ứng ELISA để phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh của bệnh nhân . PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5. 1 Kết luận Sau khi thu thập dịch tiết từ Fasciola gigantica và xác định nồng độ protein trong dịch tiết bằng phương pháp Bradford, ta thu được xấp xỉ 6 ,5 mg. enzyme (ELISA) để sử dụng trong chẩn đoán. 5. 2 Đề nghị Gia tăng độ nhạy của phản ứng ELISA. Sử dụng kháng nguyên tiết để phát hiện kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân nhiễm Fasciola sp. . phát hiện kháng nguyên tiết trong phân bệnh nhân. Xác định lại hoạt tính và tinh chế enzyme cystein-protease trong dịch tiết của sán lá gan lớn. Trên cơ sở đó ứng dụng những kỹ thu t phân