trong phân bệnh nhân
Nguyên tắc chung của kỹ thuật ELISA là nguyên tắc bánh kẹp (Sandwich), tạo liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể.
Sự liên kết đó biểu hiện hợp thức liên kết hóa học cho phép định lượng sự có mặt của kháng thể hoặc kháng nguyên. Kháng thể hoặc kháng nguyên có thể được xác định khi được nhận biết đặc hiệu bằng một kháng thể thứ hai cộng hợp với hệ biotin – Streptavidin – enzyme sẽ tạo ra sản phẩm có màu khi tác dụng với cơ chất phù hợp.
Hình 3.3.7 – Sơ đồ nguyên tắc phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên OPD B B Streptavidin - PO Polystyrene Giai đoạn gắn bản Giai đoạn phản ứng
Gắn IgG kháng nguyên tiết vào giếng nhựa polystyrene
Phủ protein lên giếng nhựa: IgG kháng nguyên tiết pha trong đệm NaHCO3 - Na2CO3 0,1 M, pH = 9,6 thu được dung dịch kháng thể có nồng độ 5 µg/ml. Cho vào mỗi giếng 100 µl dung dịch trên. Ủ qua đêm ở 40C. Rửa giếng 3 lần bằng đệm PBS -thimerosal 0,01%, Tween 20 0,05%, gelatine 0,5% (đệm 1).
Dung dịch bão hòa: Bão hòa các vị trí kháng thể không gắn vào giếng bằng dung dịch Tris 0,1 M; NaCl 0,15M; EDTA 1mM; Tween 20 0,05%; gelatine 0,5%; pH = 8 (375 µl/ giếng) trong 60 phút ở 390C. Rửa giếng 3 lần bằng đệm 1.
Thực hiện phản ứng trên giá rắn: Pha kháng nguyên tiết trong huyết thanh âm thành các dung dịch có nồng độ kháng nguyên tiết lần lượt 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,25 (ng/ml). Cho các dung dịch vừa pha vào giếng (100 µl/giếng) theo bảng sau:
Bảng 3.3.7 – Bố trí hệ thống ELISA để phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân
Giếng 1 2
A Huyết thanh âm Huyết thanh âm B 31,25 ng kháng nguyên tiết C 62,5 x D 125 x E 250 x F 500 x G 1000 x
H Huyết thanh dương Huyết thanh dương
Ủ 390C, 60 phút. Sau đó, rửa ba lần với đệm 1.
Cho IgGkháng nguyên tiết-biotin vào (100 µl/giếng). Ủ 390C trong 30 phút. Sau đó rửa ba lần với đệm 1.
Cho Streptavidin – peroxydase vào (100 μl/giếng). Ủ nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó cho OPD vào (100 μl/giếng). Ủ nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó chờ khoảng 15 phút để hiện màu. Rồi cho vào mỗi giếng 100 μl dung dịch H2SO4 1,5N. Sau đó đem đi đọc kết quả bằng máy đọc ELISA Sanofi Pr 2100 ở 1 = 490 nm và 2 = 620 nm.
Albumin
Papain Mẫu
Lysozyme