Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC và phương pháp sắc ký ghép khối phổ GCMS

1.Tìm hiểu về phương pháp sắc ký2a.Định nghĩa:2b.Phân loại:2Dựa trên cơ chế tách:3Dựa trên hình thức tách:3Dựa trên trạng thái vật lý của hệ:32.Tìm hiểu về sắc ký khí ghép khối phổ (GCMSGas Chromatography Mass Spectometry)3a.Sắc ký khí (GC Gas chromatography)5Hình 1: Sắc đồ của sắc ký khí6b.Khối phổ (MS Mass Spectometry)7Hình 2: Massspectrum9Hình3:Mô tả kết quả của phân tích qua hệ thống sắc ký khí khối phổ 3D10

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC và phương pháp sắc ký ghép khối phổ GC/MS

Tìm hiểu chung về sắc ký

1. Tìm hiểu về phương pháp sắc ký

a. Định nghĩa:

Sắc ký (chromatography) là một phương pháp tách quan trọng dựa trên các quá trình hấp phụ trong điều kiện động học Trong phương pháp sắc ký, quá trình tách được thực hiện liên tục bằng cách cho các tướng tiếp xúc với nhau nhiều lần ở trên cột, trên giấy hay trên bản mỏng

Tướng được giữ nguyên được gọi là tướng tĩnh Tướng di động tiếp xúc với tướng tĩnh gọi là tướng động

Trong quá trình tiếp xúc giữa tướng tĩnh và tướng động, các cấu tử cần phân tích sẽ phân bố khác nhau giữa các tướng ấy phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích, bản chất của tướng tĩnh và tướng động, nhờ đó

mà ta có thể tách riêng các cấu tử riêng biệt

b. Phân loại:

Sắc ký

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký phẳng

Sắc ký

khí

-Sắc ký khí-lỏng

Sắc ký khí – Gas

chromatography ( GC)

Sắc ký lỏng – Liquid chromatography

Có nhiều cách khác nhau để phân loại các phương pháp sắc ký:

 Dựa trên cơ chế tách:

- Sắc ký hấp phụ ( lỏng và khí)

- Sắc ký phân bố

- Sắc ký trao đổi ion

- Sắc ký kết tủa

- Sắc ký oxy hóa khử

- Sắc ký hấp phụ-tạo phức

 Dựa trên hình thức tách:

- Sắc ký cột

- Sắc ký mao quản

- Sắc ký phẳng ( sắc ký giấy và sắc ký bản mỏng)

 Dựa trên trạng thái vật lý của hệ:

- Sắc ký khí (GC)

- Sắc ký lỏng (LC)

- Sắc ký lỏng-khí

Trong rất nhiều trường hợp có thể xảy ra đồng thời nhiều quá trình với cơ chế khác nhau tạo nên một loại sắc ký hỗn hợp, tuy nhiên bao giờ cũng có một quá trình nào đó chiếm ưu thế hơn cả (Cơ sở lý luận của sắc ký chưa được giải thích đầy đủ trong mọi chi tiết Thực

tế người ta không bao giờ được biết hết thông số lớn nhất mà họ cần nắm bắt được)

c. Ưu điểm:

Phương pháp tách sắc ký có ưu điểm là nhanh, hiệu quả cao và khả năng tự động hóa lớn nên được sử dụng rộng rãi

2. Tìm hiểu về sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS-Gas

Chromatography Mass Spectometry)

Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS_Gas Chromatography Mass Spectometry) là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện

nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao và được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp

Thiết bị GC/MS được cấu tạo thành 2 phần: phần sắc ký khí (GC)

và phần khối phổ (MS)

+ Phần sắc ký khí (GC): dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích

+ Phần khối phổ (MS): mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối

Ngày nay, người ta ứng dụng kỹ thuật GC/MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các ngành như y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm…, có thể phân tích các hỗn hợp hóa chất phức tạp như không khí, nước… Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất hiện, khối phổ có thể nhận dạng cấu trúc hóa học độc nhất của nó (giống như việc lấy dấu vân tay) Cấu trúc của chất này sau đó được so sánh với một thư viện cấu trúc các chất đã biết Nếu không tìm ra được chất tương ứng trong thư viện thì nhà nghiên cứu, có thể dựa trên cấu trúc mới tìm được để phát triển các

ý tưởng về cấu trúc hóa học Nói cách khác, nhà nghiên cứu thu được 1

dữ liệu mới và có thể đóng góp vào thư viện cấu trúc nói trên, sau khi tiến hành thêm các biện pháp để xác định chính xác loại hợp chất mới này

Khi GC kết hợp với MS, nó sẽ trở thành 1 máy phân tích đa năng, các nhà nghiên cứu hóa học có thể hòa tan hỗn hợp các hợp chất hữu cơ,

tách chiết và bơm vào máy để nhận dạng chúng, qua đó có thể đánh giá, phân tích định tính và định lượng và có cách giải quyết đối với một số hóa chất

a. Sắc ký khí (GC- Gas chromatography)

Sắc ký khí được dùng để chia tách các hỗn hợp của hóa chất ra các phần riêng lẻ, mỗi phần có một giá trị riêng biệt

Pha động mang hỗn hợp mẫu đi qua pha tĩnh, pha tĩnh được sử dụng là các hóa chất, hóa chất này có độ nhạy và hấp thụ thành phần hỗn hợp trong mẫu

Thành phần hỗn hợp trong pha động tương tác với pha tĩnh, mỗi hợp chất trong hỗn hợp tương tác với một tỷ lệ khác nhau, hợp chất tương tác nhanh sẽ thoát ra khỏi cột trước và hợp chất tương tác chậm sẽ ra khỏi cột sau Đó là đặc trưng cơ bản của pha động và pha tĩnh, hơn nữa quá trình chia tách có thể xảy ra bởi sự thay đổi nhiệt độ của pha tĩnh hoặc là

áp suất của pha động

Cột trong GC được làm bằng thủy tinh, inox hoặc thép không rỉ có kích thước, kích cỡ rất đa dạng Cột của GC dài có thể là 25m, 30m, 50m, 100m và có đường kính rất nhỏ, bên trong đường kính được tránh bằng một lớp polimer đặc biệt nhưphenyl 5% + dimetylsiloxane polymer 95%), đường kính cột thường rất nhỏ giống như là một ống mao dẫn Thông thường cột được sử dụng là semivolatile, hợp chất hữu cơ không

phân cực như PAHs, các chất trong hỗn hợp được phân tích bằng cách chạy dọc theo cột này

Một chất chia tách, rửa giải phóng đi ra khỏi cột và đi vào đầu dò Đầu

dò có khả năng tạo ra một tín hiệu bất kỳ lúc nào, khi phát hiện ra chất cần phân tích Tín hiệu này phát ra từ máy tính, thời gian từ khi bơm mẫu đến khi rửa giải gọi là thời gian lưu (TR)

Trong khi các thiết bị chạy, máy sẽ đưa ra các biểu đồ từ các tín hiệu

như hình 1

Hình 1: Sắc đồ của sắc ký khí

Đây gọi là sắc đồ, mỗi một peak trong sắc đồ sẽ miêu tả một tín hiệu tạo nên khi chất giải hấp từ cột sắc ký và đi vào đầu dò detector, trục hoành

biểu diễn thời gian lưu và trục tung biểu diễn cường độ của tín hiệu,

trong hình 1 mỗi đỉnh (peak) biểu diễn một chất riêng lẻ, chất này được

tách từ hỗn hợp mẫu phân tích, peak có thời gian lưu (TR) 4,97 phút là dodecane, 6.36 phút là biphenyl, 7.64 phút là chlolobiphenyl, 9.41 phút

là hexadecanoic acid methyl ester

b. Khối phổ (MS- Mass Spectometry)

Khối phổ được dùng để xác định một chất hóa học dựa trên cấu trúc của

nó Khi giải hấp các hợp chất riêng lẻ từ cột sắc ký, chúng đi vào đầu dò

có dòng điện ion hóa (mass spectrometry) Khi đó, chúng sẽ tấn công vào các luồng, do chúng bị bỡ thành những mảnh vụn, những mảnh vụn này có thể lớn hoặc nhỏ;

Những mảnh vụn thực tế là các vật mang điện hay còn gọi là iôn, điều này là quan trọng bởi vì các hạt cần ở trạng thái tích điện thì mới đi qua được bộ lọc Các khối nhỏ chắc chắn, khối của mảnh vỡ được chia bởi các vật mang gọi là tỉ lệ vật mang khối (M/Z);

Hầu hết các mảnh vụn có điện tích là +1, M/Z thường miêu tả các phân

tử nặng của mảnh vụn.Nhóm gồm có 4 nam châm điện gọi là tứ cực (quadrapole), tiêu điểm của các mảnh vụn đi xuyên qua các khe hở và đi vào đầu dò detector, tứ cự được thành lập bởi phần mền chương trình và hướng các mảnh vụn đi vào các khe của khối phổ

Phân tích kết quả

Máy tính sẽ ghi lại các biểu đồ của mỗi lần quét Trục hoành biểu diễn tỉ

lệ M/Z còn trục tung biểu diễn cường độ tín hiệu của mỗi mảnh vụn được quét bởi đầu dò detector Đây là đồ thị của số khối Làm thế nào để phân tích các kết quả từ máy tính? Dưới đây là một hình khối phổ Trục

X là khối lượng còn trục Y là số lượng Mỗi hóa chất chỉ tạo ra một mô hình duy nhất, nói cách khác mỗi chất có một “dấu vân tay” để nhận dạng, dựa trên mô hình ion của nó

Trên hình ta thấy phân tử ban đầu có khối lượng là 5 Trên sơ đồ khối phổ hạt lớn nhất này được gọi là ion phân tử (molecular ion) Các hạt nhỏ hơn có khối lượng 1,2,3 và 4 được gọi là các ion phân mảnh (fragment ions) Trong trường hợp ví dụ trên ta thấy các phân tử của chất này có xu hướng bị phá vỡ thành các tổ hợp 1-4 hơn là 2-3

Các nhà nghiên cứu có thể so sánh khối phổ thu được trong thí nghiệm của họ với một thư viện khối phổ của các chất đã được xác đinh trước Việc này có thể giúp họ định danh được chất đó (nếu phép so sánh tìm được kết quả tương ứng) hoặc là cơ sở để đăng ký một chất mới (nếu phép so sánh không tìm được kết quả tương ứng)

Trong hình 2, hình ảnh khối cao nhất là dodecane, phần nềm của

GC/MS nó giống như là một thư viện hình ảnh dùng để nhận ra các chất chưa biết tồn tại trong hỗn hợp mẫu Thư viện này có thể so sánh hình ảnh khối từ thành phần của mẫu với hình ảnh khối trong thư viện của máy

Hình 2: Mass-spectrum

Khi GC kết hợp với MS, nó sẽ trở thành 1 máy phân tích đa năng, các nhà nghiên cứu hóa học có thể hòa tan hỗn hợp các hợp chất hữu cơ, tách chiết và bơm vào máy để nhận dạng chúng, hơn nữa các nhà nghiên cứu cũng xác định nồng độ của mỗi thành phần hóa chất

Hình 3 sẽ mô tả 3 chiều (dài, rộng, sâu) khi GC kết hợp với MS.

Khác với các máy phân tích dư lượng kháng sinh như sắc ký lỏng ghép

khối phổ (LC/MS/MS), thì sắc ký khí ghép khối phổ độ phận giải cao

(HRGC/HRMS), GC/MSN sắc ký ghép khối phổ có ứng dụng phân tích các độc chất trong nước tương, nước mắm (3 MCPD );

Nghiên cứu chiết xuất và xác định thành phần các chất hóa học, độc chất, kháng sinh, đánh giá độ tồn lưu của hóa chất diệt côn trùng khác nhau trong các vật liệu hoặc hợp chất khác nhau