Giải trình tự ADN pptx

Giải trình tự ADN Phương pháp chính xác và đưa lại nhiều thông tin nhất cho định danh và định typ vi sinh vật là xác định chính xác trình tự chuỗi ADN của một vùng quy định trên nhiễm sắc thể. Phương pháp giải trình tự ADN phát triển nhanh chóng, kết quả so sánh sự tương đồng của trình tự gene nghiên cứu trở thành phương pháp phân loại chuẩn theo sinh học phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và cây phả hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu. Các gene bảo thủ được giải trình tự làm cơ sở để xác định vị trí của sinh vật nghiên cứu, trong khi đó các trình tự không tương đồng (khác biệt) lại làm cơ sở cho sự biệt hóa cũng như xác định mối quan hệ giữa các cá thể gần với nhau. + Nguyên tắc: Phương pháp giải trình tự ADN theo nguyên tắc tạo ra các mảnh ADN được đánh dấu tại đầu 5’ hoặc 3’. Các mảnh có các base đánh đấu được tách ra trên gel polyacrylamid Các mảnh được phân biệt về vị trí trên gel với sự sai khác chỉ với một nucleotid. Việc đánh dấu và đọc kết quả theo các kỹ thuật và phương pháp khác nhau. Việc tạo ra các mảnh ADN sai khác nhau về 1 nucleotid được trình bày theo 2 phương pháp: phương pháp hóa học (Maxam & Gilbert, 1997) và phương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi (Sanger, 1997). Ngày nay phương pháp enzym được dùng phổ biến hơn cả. + Phương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi của Sanger: Phương pháp kết thúc phản ứng chuỗi được thực hiện dựa trên việc nhân ADN từ sợi khuôn khi có đoạn ADN mồi với xúc tác của Klenow hay T7-ADN polymerase và 4 loại deoxyribonucleotid (dNTPs). Như vậy, có 4 phản ứng được tiến hành đồng thời và trong mỗi phản ứng thì có một loại dNTP bị thay đổi bởi một dẫn xuất để làm dừng phản ứng (ddNTP). Kết quả là phản ứng chuỗi bị dừng đặc hiệu cho mỗi một base xác định xảy ra một cách ngẫu nhiên trong mỗi phản ứng. Trình tự của ADN được xác định trên gel. Đầu tiên phương pháp này được xây dựng cho xác định trình tự sợi ADN đơn tạo ra bằng cách tách dòng ADN vào vectơ thực khuẩn thể M13 (Sanger và cộng sự, 1978). Sau đó phương pháp xác định trình tự sợi đôi ADN đã được Chen, William (1986) mô tả khi tách dòng ADN vào plasmid. Ngày nay người ta lựa chọn phương pháp Sanger để giải trình tự ADN cho nghiên cứu phân loại và xác định typ vi sinh vật thay cho phương pháp hóa học. Một số lợi thế của phương pháp này ở chỗ: Phương pháp này đơn giản và không tốn nhiều thời gian như phương pháp hóa học. Khi nghiên cứu phân loại và xác định typ thì các gene nghiên cứu có độ bảo thủ nhất định vì vậy ta có thể dùng chung mồi cho nhiều đối tượng khác nhau. Một trong hạn chế của phương pháp này ở chỗ các đoạn ADN cần được tách dòng trước khi tiến hành giải trình tự ADN. Tuy nhiên cho đến nay người ta đã cải tiến phương pháp này để có thể giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR. + Giới thiệu kỹ thuật giải trình tự ADN theo Sanger: Có hai phương pháp: Phương pháp giải trình tự truyền thống đọc kết quả trên bản gel (đánh dấu bằng phóng xạ là chủ yếu) và phương pháp giải trình tự và đọc kết quả tự động (đánh dấu bằng hóa chất huỳnh quang). - Phương pháp truyền thống: Các bước chính cho giải trình tự ADN như sau: Chuẩn bị ADN khuôn Bắt cặp ADN khuôn và mồi Tiến hành phản ứng giải trình tự ADN Tách sản phẩm trên gel polyacrylamid biến tính với urea. Đọc kết quả. Tuy nhiên cần chú ý một số điểm sau: 1. Chuẩn bị ADN khuôn. 2. Điều kiện bắt cặp mồi. 3. Thực hiện phản ứng giải trình tự ADN. 4. Tách sản phẩm trên acrylamid gel. 5. Đọc kết quả. Một số điểm cần được chi tiết thêm cho mỗi bước như sau: 1, Chuẩn bị ADN khuôn: Sợi khuôn cần được hiểu là việc giải trình tự được thực hiện với sợi đơn (vectơ M13) hay sợi đôi ADN. Việc đọc trình tự theo sợi đơn thường cho kết quả là kích thước đoạn gene đọc dài và độ chính xác cao. Ngày nay người ta thường đọc sợi đôi vì việc chuẩn bị mẫu dễ dàng hơn, ngoài ra khi sử dụng hai phản ứng với hai mồi tương thích thì quá trình đọc lại chính xác hơn. Đó là ưu thế của cách đọc sợi đôi ADN. Do vậy, rất cần đọc kết quả từ cả hai sợi ADN. Hiện nay phương pháp đọc trình tự ADN trực tiếp từ sản phẩm PCR đang ngày càng trở lên phổ biến. 2, Chuẩn bị sợi ADN mồi cho bước bắt cặp vào sợi khuôn: Người ta có thể dùng các đoạn ADN mồi tiêu chuẩn đặc hiệu cho trình tự ADN của vectơ gần sát với sợi khuôn hay primer đặc hiệu của sợi khuôn mà nó sẽ bắt cặp vào. Tiện ích của việc dùng mồi chuẩn ở chỗ mọi điều kiện đã được lựa chọn cho sợi khuôn và mồi được dùng lặp đi lặp lại nhiều lần cho các sợi khuôn khác nhau. Hạn chế của loại mồi này ở chỗ chỉ đọc được một đoạn ngắn của gene (300 – 500 bps) trong trường hợp phải đọc các gene có kích thước lớn cần phải tiến hành subclone để đọc tiếp. Điều này có thể thực hiện bằng cách tạo ra các đoạn ADN ngẫu nhiên từ toàn bộ gene sau đó lại gắn vào vectơ để đọc cho hết trình tự của gene. Phương pháp tiếp theo là sử dụng mồi được thiết kế theo nguyên tắc bổ sung với trình tự của gene. Theo cách này, lần lượt các đoạn được đọc mà không cần thao tác subclone. Tuy nhiên theo cách đoạn mồi được thiết kế để đọc gene như vậy thì điều kiện cho từng phản ứng giải trình tự ADN với các mồi khác nhau sẽ không được tối ưu. Tuy vậy, hiện nay việc tổng hợp mồi đã trở nên dễ dàng và phổ biến với giá thành thấp, hơn thế nữa với sự trợ giúp của tin học thì bước thiết kế mồi đã được tối ưu hoá. Vì vậy phương pháp này ngày càng trở lên thông dụng hơn. Sau khi mồi đã được thiết kế thì việc tiếp theo là chọn cách đánh dấu vào mồi hay vào đoạn ADN sẽ được tổng hợp. Ưu thế của việc đánh dấu ngay tại đầu 5’ của mồi ở chỗ các băng ADN thường có cùng một cường độ tín hiệu. Thông thường với phương pháp đọc trình tự thủ công thì P 32 thường được dùng. Ưu thế của nó là mang gốc photphat cao năng bêta mạnh, do đó chỉ cần trong thời gian ngắn là thu được tín hiệu. Hạn chế của phương pháp này là do mang năng lượng cao nên khó phân biệt giữa các băng khác nhau so với dùng S 35 . Hiện nay để giải quyết vấn đề này người ta dùng P 33 tuy giá thành cao nhưng cho kết quả tốt hơn. 3, Thực hiện phản ứng giải trình tự ADN: Enzym thông dụng thường dùng là sequenase (là một dạng của T7 DNA polymerase), enzym này có ưu thế hơn hẳn so với Klenow được dùng trước đây. Phản ứng được thực hiện nhanh hơn và thu được kết quả tối ưu nếu có mặt ion Mn ++ , ion này giúp cho quá trình sao chép có độ chính xác cao. Trước đây dNTPs đánh dấu với P 32 được dùng để đánh dấu sản phẩm. Tuy nhiên ngày nay nhiều người đã chuyển sang dùng S 35 thay thế cho P 32 , kết quả là cho độ phân giải cao hơn. Mới đây phương pháp giải trình tự dựa trên kỹ thuật PCR được gọi là chu kỳ giải trình tự trực tiếp ADN đang thay thế phương pháp cũ dùng enzym sequenase. Về nguyên tắc thì các phương pháp này là giống nhau. Ưu thế của phương pháp này là: lượng ADN đòi hỏi ít và không yêu cầu phải có mức độ tinh sạch cao. Ngoài ra, có một ưu điểm nữa là phản ứng xảy ra ở nhiệt độ cao, do đó đã khắc phục được những hạn chế của các phương pháp khác khi giải trình tự đối với các sợi khuôn có cấu trúc bậc 2 (Fan & cộng sự, tạp chí Biotechniques 21: 1132-1137). 4, Tách sản phẩm trên gel urea-acrylamid: Cho đến nay đã có nhiều tiến bộ trong kỹ thuật điện di gel kể từ năm 1970 khi mà người ta phát hiện ra phương pháp này. Tiến bộ quan trọng nhất là gel gradient tạo ra độ dãn cách thích hợp để đọc được thêm từ 50-100 base. Đầu tiên, gradient được tạo ra giữa acrylamid và gradient muối khi đổ gel. Có thể có cách khác nữa là người ta thay đổi độ dày của gel bằng spacer. Phương pháp dễ nhất là bổ sung nồng độ muối NaOAc vào bể đệm dưới khi chạy gel, kết quả sẽ tạo ra một gradient cần thiết mà không mấy khó khăn. Có nhiều cách cải tiến khác nhau để tạo ra gel có độ phân giải cao, ví dụ tạo ra gradient đối với acrylamid mạch thẳng hay bổ sung một số chất tạo ra gradient (Long Ranger). Mặt khác việc đổ gel cũng được đơn giản hóa bước sử dụng băng dán. Một số người dùng các gel siêu mỏng để đạt độ phân giải cao. Nhiều thiết bị được phát minh nhằm thu nhận các băng đã được tách riêng khi chúng ra khỏi gel, và gần đây những thiết bị này đã được thương mại hóa. Nhuộm bạc là phương pháp tương đối hiệu quả để xác định các trình tự ADN, cách này hạn chế được nhiều bước dùng trong các kỹ thuật dựa vào ảnh bức xạ mà không cần sử dụng chất phóng xạ. 5, Đọc trình tự gene: Hiện nay kỹ thuật đọc phim tự động đã thay thế công việc đọc trình tự ADN buồn tẻ trước đây. Có hàng loạt các thiết bị từ loại có thể ghi lại trình tự dựa vào việc chọn từng loại base đến những thiết bị có thể thực hiện được toàn bộ quá trình này một cách tự động. Hy vọng rằng với những bàn luận ngắn gọn này sẽ giúp bạn làm quen dần với nhiều loại kỹ thuật khác nhau. Ngày nay các thiết bị giải trình tự tự động càng trở lên thông dụng và việc sử dụng loại thiết bị và hóa chất khác nhau rất đa dạng. Việc chọn lựa thiết bị, hóa chất và phương pháp thích hợp để giải trình tự ADN nhanh, chính xác và kinh tế là điều cần được quan tâm đến. . thuật giải trình tự ADN theo Sanger: Có hai phương pháp: Phương pháp giải trình tự truyền thống đọc kết quả trên bản gel (đánh dấu bằng phóng xạ là chủ yếu) và phương pháp giải trình tự và. pháp này ở chỗ các đoạn ADN cần được tách dòng trước khi tiến hành giải trình tự ADN. Tuy nhiên cho đến nay người ta đã cải tiến phương pháp này để có thể giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR phương pháp xác định trình tự sợi đôi ADN đã được Chen, William (1986) mô tả khi tách dòng ADN vào plasmid. Ngày nay người ta lựa chọn phương pháp Sanger để giải trình tự ADN cho nghiên cứu phân