vi khuẩn oxy hóa Fe (II) và khử nitrate ở Việt Nam

vi khuẩn oxy hóa Fe (II) và khử nitrate ở Việt Nam: tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng

Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 đại học quốc gia hà nội Trờng đại học khoa học tự nhiên -------------------- Nguyễn Thị Tuyền Vi khuẩn oxy hóa fe(ii) và khử nitrate ở việt nam: tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng Luận văn thạc sĩ khoa học Hà Nội - 2009 đại học quốc gia hà nội Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Trờng đại học khoa học tự nhiên -------------------- Nguyễn Thị Tuyền Vi khuẩn oxy hóa fe(ii) và khử nitrate ở việt nam: tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 Luận văn thạc sĩ khoa học Ngời hớng dẫn khoa học: ts. đinh thúy hằng Hà Nội - 2009 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16 Lời cảm ơn Đề tài luận văn đợc thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài Đặc biệt cấp Đại học Quốc gia Hà Nội, mã số QG.07.23. Để có thể hoàn thành luận văn này, trớc tiên, tôi muốn bày tỏ lỏng biết ơn sâu sắc tới Tiến sĩ Đinh Thúy Hằng, Trởng phòng Sinh thái Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã định hớng nghiên cứu, trực tiếp hớng dẫn và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu. Tôi cũng mong muốn đợc gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban lãnh đạo và các cán bộ Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và cơ sở vật chất cho tôi hoàn thành nghiên cứu này. Qua đây, tôi cũng muốn đợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo, cán bộ Khoa Sinh học, Trờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã giúp đỡ và trang bị những kiến thức hữu ích cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trờng. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè thân thiết, những ngời đã luôn cổ vũ, động viên tôi vợt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm Học viên Nguyễn Thị Tuyền Chuyên ngành Vi sinh vật học Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16 mục lục danh mục các chữ viết tắt 7 ARDRA Amplified ribosomal DNA Restriction Analysis 7 bp Base pair .7 BSA Bovin serum albumin .7 DNA Deoxyribonucleic acid .7 CI Chloroform-isoamyl alcohol .7 CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide 7 DAPI 4 6-diamidino-2-phenylindole .7 ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate .7 DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis .7 dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate .7 EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid .7 FISH Fluorescence in situ hydridization 7 MQ Mili-Q 7 MPN Most probable number .7 OD Optical density 7 PBS Phosphate-buffered saline 7 PCI Phenol-Chloroform-isoamyl alcohol 7 PCR Polymerase chain reaction 7 rDNA Ribosomal deoxyribonucleic acid .7 RNA Ribonucleic acid 7 rRNA Ribosomal ribonucleic acid 7 SDS Sodium dodecyl sulfate .7 Chuyên ngành Vi sinh vật học Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16 TAE Tris-Acetic-EDTA (đệm) 7 TE Tris-EDTA (đệm) 7 Taq Thermus aquaticus DNA .7 UV Ultraviolet 7 Mở đầu 1 Chơng 1- Tổng quan tài liệu .3 1.1. Quá trình oxy hóa Fe(II) nhờ vi khuẩn .3 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn oxy hóa Fe(II) (FOM) .3 1.1.2. Vai trò của vi khuẩn trong chu trình oxy hóa - khử sắt .4 1.1.3. Vi khuẩn hiếu khí oxy hóa Fe(II) ở pH trung tính 5 1.1.4. Vi khuẩn quang hợp kỵ khí oxy hóa Fe(II) 6 1.1.5. Vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II) .6 1.2.Khử nitrate nhờ vi khuẩn 7 1.3. Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate 8 1.4. Cơ chế phân tử của quá trình oxy hóa Fe(II) và các gen liên quan 9 1.5. ảnh hởng của ô nhiễm nitrate và thừa sắt trong nguồn nớc sinh hoạt 12 1.5.1. ảnh hởng của nitrate đến sức khỏe con ngời .12 1.5.2. ảnh hởng của thừa sắt đến sức khỏe con ngời .14 1.6. ý nghĩa của việc nghiên cứu tính đa dạng di truyền và tiềm năng ứng dụng của các vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate 14 1.7. Các phơng pháp sinh học phân tử hiện đại đợc sử dụng trong các nghiên cứu về tính đa dạng và cấu trúc di truyền của quần xã vi khuẩn .15 1.7.1. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) .15 1.7.2. FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) .16 1.7.3. ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) 16 Chơng 2 - Nguyên vật liệu và phơng pháp nghiên cứu .17 2.1. Nguyên vật liệu .17 2.1.1. Đối tợng nghiên cứu .17 2.1.2. Hóa chất .18 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 18 2.2. Phơng pháp nghiên cứu 19 2.2.2. Phân lập vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II), khử nitrate .22 2.2.3. Tách DNA tổng số từ mẫu bùn và trầm tích và chủng đơn .23 Chuyên ngành Vi sinh vật học Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16 2.2.4. Phân tích đa dạng di truyền các chủng đơn bằng phơng pháp ARDRA 24 2.2.5. Phơng pháp điện di biến tính DGGE 25 2.2.6. Giải trình tự gen 16S rDNA và dựng cây phân loại .26 2.2.7. Phơng pháp FISH 27 Lai với đầu dò: 28 2.2.8. Định lợng Fe(II), Mn(II) và nitrate .29 Chơng 3 - Kết quả và thảo luận .32 3.1. Xác định số lợng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tại các môi trờng sinh thái khác nhau .32 3.2. Phân tích cấu trúc quần xã vi khuẩn bằng điện di biến tính (DGGE) 34 3.3.Đánh giá đa dạng di truyền vi khuẩn trong các môi trờng nghiên cứu bằng phơng pháp FISH 35 3.4. Mức độ oxy hóa Fe(II) và khử nitrate của vi khuẩn trong các mẫu nghiên cứu .37 3.5. Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate từ các mẫu nghiên cứu 38 3.6. Đánh giá tính đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate bằng phơng pháp ARDRA 40 3.7. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, phân loại và hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn đại diện .43 Kết luận 49 hớng nghiên cứu tiếp theo 50 Tài liệu tham khảo 51 Phụ lục 62 Chuyên ngành Vi sinh vật học Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16 danh mục các chữ viết tắt ARDRA Amplified ribosomal DNA Restriction Analysis bp Base pair BSA Bovin serum albumin DNA Deoxyribonucleic acid CI Chloroform-isoamyl alcohol CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide DAPI 46-diamidino-2-phenylindole ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FISH Fluorescence in situ hydridization MQ Mili-Q MPN Most probable number OD Optical density PBS Phosphate-buffered saline PCI Phenol-Chloroform-isoamyl alcohol PCR Polymerase chain reaction rDNA Ribosomal deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris-Acetic-EDTA (đệm) TE Tris-EDTA (đệm) Taq Thermus aquaticus DNA UV Ultraviolet Chuyên ngành Vi sinh vật học Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16 Mở đầu Sắt là một trong những kim loại phổ biến trên trái đất. Thông thờng sắt tồn tại ở dạng Fe 2 O 3 ít tan trong nớc và có màu vàng nâu. Trong môi trờng pH trung tính, dạng hòa tan trong nớc, Fe(II), chỉ tồn tại ở điều kiện không có oxy, ví dụ nh ở đáy các thủy vực, nơi oxy hòa tan trong nớc đã bị các vi sinh vật hiếu khí sử dụng để phân hủy các hợp chất hữu cơ. Với hiệu điện thế oxy hóa khử Fe(III)/Fe(II) tại pH 7 vào khoảng +200 mV, ion Fe(II) có thể trở thành nguồn điện tử cho các quá trình hô hấp kỵ khí, điển hình là khử nitrate thành N 2 do một số nhóm vi khuẩn đảm nhiệm (Straub và cs, 1996; Benz và cs, 1998; Weber và cs, 2006 c). Quá trình oxy hóa Fe(II), khử nitrate đợc tóm tắt nh sau: 10 Fe 2+ + 2 NO 3 + 24 H 2 O = 10 Fe(OH) 3 + N 2 + 9 H 2 Trong tự nhiên, quá trình oxy hóa Fe(II) với chất nhận điện tử là nitrate chủ yếu diễn ra ở ranh giới hiếu khí (có oxy) và kỵ khí (không có oxy) trong lớp trầm tích ở đáy các thủy vực. Oxy hóa Fe(II) kết hợp với khử nitrate có thể đóng vai trò quan trọng trong môi trờng ô nhiễm với nồng độ Fe(II) cao (do thiếu oxy) và nitrate cao (do chất hữu cơ bị phân hủy tạo thành) (Weber và cs, 2006 c). Các loài vi khuẩn với khả năng tiến hành phản ứng oxy hóa khử này có thể cùng một lúc thực hiện đợc hai nhiệm vụ, thứ nhất là chuyển Fe(II) hòa tan trong nớc về dạng Fe(III) kết tủa, và hai là loại bỏ nitrate, chuyển thành dạng N 2 không độc hại. Vi khuẩn dùng ion Fe(II) làm nguồn cho điện tử để khử nitrate đợc phân lập đầu tiên từ các lớp trầm tích ao, hồ nớc ngọt tại Bremen, Đức năm 1996 (Straub và cs, 1996). Một số công trình nghiên cứu tiếp sau cho thấy sự có mặt khá phổ biển của nhóm vi khuẩn này với mật độ khá cao (10 6 tế bào/g trầm tích) trong các điều kiện môi trờng khác nhau, bao gồm cả nớc ngọt, nớc lợ và nớc mặn và tại nhiều vi trí địa lý khác nhau trên thế giới (Straub và Buchholz-Cleven, 1998). Các loài vi khuẩn phổ biến nhất trong nhóm này đợc biết đến hiện nay là các loài thuộc chi Chromobacterium và Klebsiella (Benz và cs, 1998; Senko và cs, 2005; Weber và cs, Chuyên ngành Vi sinh vật học 1 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16 2006 b). Các nghiên cứu về nhóm vi khuẩn này ở châu Âu với điều kiện sinh thái hoàn toàn khác biệt với nớc ta. Hiện nay, ở Việt Nam cũng nh trên thế giới, tình trạng ô nhiễm các kim loại nặng và nitơ trong nguồn nớc sinh hoạt và nớc thải đang là vẫn đề đợc quan tâm hàng đầu. Nồng độ ammonium hay nitrate cao trong nớc uống cũng nh nớc thải có thể gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng liên quan đến môi trờng sinh thái và sức khỏe cộng đồng (Avery, 1999; Lundgerg và cs, 2004; Tricker và Preussmann, 1991). Thừa sắt trong cơ thể đợc cho là một trong những nguyên nhân gây ra các bệnh về thần kinh và ung th (Moon, 2008). Các kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nghiên cứu sinh thái vi sinh vật đã có nhiều bớc tiến đáng kể trong những năm gần đây. Trong số các phơng pháp đó, có thể kể đến PCR-DGGE và FISH (không cần phân lập và nuôi cấy) hay ARDRA và giải trình tự gen (thông qua bớc phân lập và nuôi cấy) là các phơng pháp hữu hiệu đợc sử dụng phổ biến trong đánh giá tính đa dạng, phân tích cấu trúc di truyền các nhóm loài của các vi sinh vật trong các môi trờng sinh thái khác nhau. Từ những thực tế kể trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Vi khuẩn oxy hóa Fe(II) và khử nitrate ở Việt Nam: Tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng với mục đích đánh giá tính đa dạng di truyền của vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate ở Việt Nam và tìm hiểu khả năng ứng dụng của chúng trong xử lý nguồn nớc nhiễm ion sắt kim loại và các hợp chất chứa nitơ. Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16 Chơng 1- Tổng quan tài liệu 1.1. Quá trình oxy hóa Fe(II) nhờ vi khuẩn 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn oxy hóa Fe(II) (FOM) Khái niệm vi sinh vật liên quan đến oxy hóa sắt có từ nửa đầu thế kỉ 19, khi Ehrenberg cho rằng các quặng sắt có thể đợc hình thành do kết quả của hoạt động sinh học. Vi khuẩn liên quan trực tiếp đến sắt oxit, Gallionella ferruginea, cũng đã đợc ông mô tả một cách chi tiết (Ehrenberg, 1919). Trong suốt thời gian sau đó, nhiều đối tợng vi sinh vật đã đợc sử dụng để chứng minh rằng vi khuẩn có khả năng oxy hóa sắt ở pH trung tính ví dụ nh Leptothrix ochracea (Kỹtzing, 1919). Tuy nhiên vào thời điểm đó các bằng chứng đa ra vẫn cha đợc hoàn toàn xác thực. Cũng vào thời điểm này, Harder, một giáo viên địa chất ngời Mỹ đã công bố một công trình nghiên cứu về vi khuẩn sắt (Harder, 1919), trong đó vi khuẩn đợc chứng minh là một trong các yếu tố địa hóa của chu trình sắt. Những vi khuẩn mà Harder đề cập này sau đó đợc phát hiện trong một vài môi trờng nớc ngọt và phơng pháp làm giàu cũng đợc sử dụng để cung cấp các bằng chứng cụ thể về hình thức sinh trởng tự d- ỡng vô cơ của nhóm vi khuẩn này. Tuy nhiên vào thời điểm đó, chủng đơn vẫn cha phân lập đợc. 75 năm sau đó, nhiều nghiên cứu đã cung cấp các hiểu biết về tập tính của vi sinh vật oxy hóa Fe(II) (FOM- Ferrous oxidizing Microbiology) cũng nh vai trò quan trọng của chúng trong phản ứng địa hóa và ăn mòn sinh học. Mặc dù vậy số chủng phân lập đợc còn giới hạn, do đó mức độ đa dạng, phân loại, hình thái cũng nh sinh lý của nhóm vi khuẩn này vẫn cha đợc mô tả chi tiết (Emerson, 2000). Năm 1984, tổng quan của Ghiorse đã thảo luận nhiều vấn đề về pháp danh và phân loại của nhóm vi khuẩn này (Ghiorse, 1984). Quá trình oxy hóa Fe(II) kỵ khí mới đợc biết đến nhờ việc phân lập đợc vi khuẩn tía quang hợp không lu huỳnh, có khả năng sử dụng Fe(II) làm chất cho điện tử (Widdel và cs, 1993). Tiếp sau đó, vào năm 1996 Straub và cộng sự lần đầu tiên phân lập đợc vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II), khử nitrate (Straub và cs, 1996). Năm 1997 lần đầu tiên vi khuẩn vi hiếu khí ở pH Chuyên ngành Vi sinh vật học 3 [...]... chủng Ferroglobus placidus, là một vi khuẩn cổ a nhiệt (Hafenbradl và cs, 1996) và chủng 2002, là vi khuẩn a ấm thuộc phân lớp -Proteobacteria (Weber và cs, 2006 b) 1.4 Cơ chế phân tử của quá trình oxy hóa Fe( II) và các gen liên quan Cho đến nay cha có bất cứ công bố nào về cơ chế phân tử của quá trình oxy hóa Fe( II) ở vi khuẩn oxy hóa Fe( II), khử nitrate Tuy nhiên, quá trình oxy hóa Fe( II) ở vi khuẩn. .. trình oxy hóa Fe( II) Về mặt nhiệt động học, oxy hóa Fe( II) có thể xảy ra đồng thời với khử nitrate thành NH 4+ (NO3/NH4+ = + 360 mV (Thauer và cs, 1977), nhng thực tế cha có bằng chứng nào chứng minh vi khuẩn oxy hóa Fe( II) tạo ra NH 4+ từ vi c khử nitrate (Straub và cs, 1996, 1998; Benz và cs, 1998) Trong tất cả các vi khuẩn đợc biết đến, oxy hóa Fe( II) luôn đi kèm với khử nitrate thành N 2 (Straub và. .. Trong môi trờng nớc ngọt nitrate là chất nhận điện tử quan trọng thứ hai sau oxy, vì thế nhóm vi khuẩn khử nitrate ở đây cũng đa dạng hơn so với môi trờng nớc lợ và nớc mặn, nơi có vi khuẩn khử sulfat chiếm u thế do ảnh hởng của nồng độ sulfate (SO42-) cao từ nớc biển 1.3 Vi khuẩn oxy hóa Fe( II), khử nitrate ở pH trung tính, oxy hóa Fe( II) hòa tan và Fe( II) ở dạng khoáng nhờ vi khuẩn kỵ khí không phụ... thể oxy hóa Fe( II) ở dạng ion hòa tan (Kappler và Newman, 2004), do đó chúng chỉ đóng vai trò nhỏ trong quá trình oxy hóa - khử sắt và sự phong hóa sắt trong môi trờng trên cạn 1.1.5 Vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe( II) Gần đây, vi c xác định đợc các vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe( II) đã lấp đầy chỗ trống trong bức tranh tổng thế về chu trình oxy hóa - khử sắt nhờ vi sinh vật (Widdel và cs, 1993; Straub và cs,... trình sắt trong môi trờng hiếu khí (Emerson và Moyer, 1997; Sobolev và Roden, 2001; Edwards và cs, 2003) Quá trình oxy hóa Fe( II) nhờ vi khuẩn đi kèm với khử oxy ở pH trung trính và acid đã đợc biết đến trong hơn một thế kỷ nay ở thời điểm đầu vai trò của oxy hóa Fe( II) ở pH trung tính nhờ vi khuẩn hiếu khí đã bị xem nhẹ vì phản ứng hóa học oxy hóa Fe( II) bằng oxy không khí xảy ra rất nhanh Cho đến nay,... nghiệm làm giàu hay nuôi cấy vi khuẩn oxy hóa Fe( II), khử nitrate đã tiến hành đều phụ thuộc vào nguồn carbon hữu cơ (nh Na-acetate) (Straub và cs, 1996; Benz và cs, 1998), tức là điều điện sinh trởng dị dỡng vô cơ Phơng pháp MPN đã cho thấy FOM dị dỡng chiếm 0,8% tổng số vi khuẩn khử nitrate và thờng gặp hơn so với FOM tự dỡng (Straub và cs, 1998) Vi khuẩn oxy hóa Fe( II), khử nitrate tự dỡng mới chỉ đợc... 2005; Rentz và cs, 2007) 1.1.4 Vi khuẩn quang hợp kỵ khí oxy hóa Fe( II) Trong những khu vực có ánh sáng, Fe( III) có thể cũng đợc tạo thành thông qua hoạt tính oxy hóa Fe( II) của vi khuẩn quang hợp có khả năng sử dụng Fe( II) nh một nguồn cho điện tử để tạo các đơng lợng khử cho quá trình đồng hóa carbon vô cơ (Weber và cs, 2006 a) Vi khuẩn quang hợp kỵ khí là vi khuẩn oxy hóa Fe( II) bằng con đờng kỵ khí... toàn và ủ trong tủ ấm tại 28 oC trong 8 tuần Sự phát triển của vi khuẩn trong ống MPN đợc ghi nhận thông qua sự thay đổi màu môi trờng từ trắng đục (màu của Fe( II)) sang vàng nâu (màu của Fe( III)) 2.2.2 Phân lập vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe( II), khử nitrate ống MPN ở nồng độ pha loãng cao nhất có vi khuẩn oxy hóa Fe( II), khử nitrate phát triển đợc sử dụng để làm nguồn phân lập các khuẩn lạc đơn Vi c... năng sinh trởng vô cơ sử dụng Fe( II) làm nguồn điện tử để khử nitrate là một u thế của nhóm vi khuẩn này so với các loài khử nitrate thông thờng Do tác động của vi khuẩn oxy hóa Fe( II), khử nitrate, cùng một lúc ion Fe( II) và nitrate d trong nguồn nớc có thể đợc loại bỏ Khả năng ứng dụng của nhóm vi khuẩn này có ý nghĩa đối với vi c xử lý các nguồn nớc ngầm dùng cho sinh hoạt bị nhiễm sắt và nitơ ngấm... rằng vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe( II) có thể đóng vai trò quan trọng trong chu trình oxy hóa khử sắt (Senn và Hemond, 2002; Straub và cs, 2004; Weber và cs, 2006 c), trong chu trình sinh địa hóa đất, trầm tích, khoáng hóa, và quá trình cố định các chất phóng xạ và kim loại nặng (Chaudhuri và cs, 2001; Weber và cs, 2001; Lack và cs, 2002; Weber và cs, 2006 c) Trong môi trờng không có oxy, quá trình oxy hóa . nitrate ở Vi t Nam: Tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng với mục đích đánh giá tính đa dạng di truyền của vi khuẩn oxy hóa Fe( II), khử nitrate ở Vi t Nam và. trình oxy hóa Fe( II) và các gen liên quan Cho đến nay cha có bất cứ công bố nào về cơ chế phân tử của quá trình oxy hóa Fe( II) ở vi khuẩn oxy hóa Fe( II), khử