Vi khuẩn Qxy hóa Fe(II) và khử Nitrate ở Việt Nam tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng

Vi khuẩn Qxy hóa Fe(II) và khử Nitrate ở Việt Nam tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng.

đại học quốc gia hà nội

Trờng đại học khoa học tự nhiên

đại học quốc gia hà nội

Trờng đại học khoa học tự nhiên

-Nguyễn Thị Tuyền

Chuyªn ngµnh: Vi sinh vËt häc M· sè: 60 42 40

LuËn v¨n th¹c sÜ khoa häc

Ngêi híng dÉn khoa häc: ts ®inh thóy h»ng

Hµ Néi - 2009

Tôi cũng mong muốn đợc gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban lãnh đạo vàcác cán bộ Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạođiều kiện thuận lợi về trang thiết bị và cơ sở vật chất cho tôi hoàn thành nghiên cứunày.

Qua đây, tôi cũng muốn đợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy côgiáo, cán bộ Khoa Sinh học, Trờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia HàNội đã giúp đỡ và trang bị những kiến thức hữu ích cho tôi trong suốt thời gian họctập tại trờng.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè thân thiết,những ngời đã luôn cổ vũ, động viên tôi vợt qua mọi khó khăn trong quá trình học tậpvà nghiên cứu.

Hà Nội, ngày tháng năm

Học viên

Nguyễn Thị Tuyền

môc lôc

2.1.2.Hóa chất 18

2.1.3.Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 19

2.2 Phơng pháp nghiên cứu 19

2.2.1.Xác định số lợng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate 21

2.2.2.Phân lập vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II), khử nitrate 23

2.2.3.Tách DNA tổng số từ mẫu bùn và trầm tích và chủng đơn 23

2.2.4.Phân tích đa dạng di truyền các chủng đơn bằng phơng pháp ARDRA 242.2.5.Phơng pháp điện di biến tính DGGE 25

2.2.6.Giải trình tự gen 16S rDNA và dựng cây phân loại 27

2.2.7.Phơng pháp FISH 27

2.2.8.Định lợng Fe(II), Mn(II) và nitrate 29

Chơng 3 - Kết quả và thảo luận 33

3.1 Xác định số lợng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tại các môi trờngsinh thái khác nhau 33

3.2 Phân tích cấu trúc quần xã vi khuẩn bằng điện di biến tính (DGGE) 34

3.3 Đánh giá đa dạng di truyền vi khuẩn trong các môi trờng nghiên cứu bằngphơng pháp FISH 36

3.4 Mức độ oxy hóa Fe(II) và khử nitrate của vi khuẩn trong các mẫu nghiêncứu 37

3.5 Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate từ các mẫu nghiên cứu 38

3.6 Đánh giá tính đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II),khử nitrate bằng phơng pháp ARDRA 40

3.7 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, phân loại và hoạt tính sinh học của cácchủng vi khuẩn đại diện 43

Kết luận 49

hớng nghiên cứu tiếp theo 50

Tài liệu tham khảo 51

Phụ lục 62

TE Tris-EDTA (đệm)

TaqThermus aquaticus DNA

Hình 1 Chu trình sắt trong tự nhiên (Ehrlich và Newman, 2008) 1 - Vi sinh vật

trong môi trờng acid; 2 - Vi sinh vật kỵ khí ở môi trờng trung tính (khử nitrate,quang hợp kỵ khí); 3 - Quá trình hóa học trong môi trờng trung tính với nồng độ O2

cao; 4 - Quá trình hóa học; 5 - Quá trình sinh học; 6 - H2S từ vi sinh vật; 7 - +O2,quá trình sinh học hoặc hóa học; 8 - +CO32−, quá trình hóa học; 9 - chuyển H+, quá

trình sinh học hoặc hóa học; 10 - Quá trình sinh học hoặc hóa học.

1.1.3 Vi khuẩn hiếu khí oxy hóa Fe(II) ở pH trung tính

Sự cạnh tranh của các vi khuẩn hiếu khí có khả năng oxy hóa Fe(II) (FOM)với động học của quá trình oxy hóa vô sinh Fe(II) bằng O2 đã đợc chứng minh làgóp phần hoàn thiện chu trình sắt trong môi trờng hiếu khí (Emerson và Moyer,1997; Sobolev và Roden, 2001; Edwards và cs, 2003) Quá trình oxy hóa Fe(II) nhờvi khuẩn đi kèm với khử oxy ở pH trung trính và acid đã đợc biết đến trong hơn mộtthế kỷ nay ở thời điểm đầu vai trò của oxy hóa Fe(II) ở pH trung tính nhờ vi khuẩnhiếu khí đã bị xem nhẹ vì phản ứng hóa học oxy hóa Fe(II) bằng oxy không khí xảyra rất nhanh Cho đến nay, mức độ đa dạng của FOM trong môi trờng hiếu khí đã đ-

ợc nghiên cứu chi tiết, các loài đợc phát hiện đều thuộc 3 chi Gallionella, Leptothrixvà Marinobacter (Kỹtzing, 1919; Ehrenberg, 1919) Một số FOM hiếu khí a pH

trung tính gần đây đã đợc xác định thuộc vào các phân lớp α-, β-, γ- Proteobacteria

(Edwaras và cs, 2003; Emerson và Weiss, 2004; Dhillon và cs, 2005; Rentz và cs,2007).

1.1.4 Vi khuẩn quang hợp kỵ khí oxy hóa Fe(II)

Trong những khu vực có ánh sáng, Fe(III) có thể cũng đợc tạo thành thôngqua hoạt tính oxy hóa Fe(II) của vi khuẩn quang hợp có khả năng sử dụng Fe(II) nhmột nguồn cho điện tử để tạo các đơng lợng khử cho quá trình đồng hóa carbon vô

cơ (Weber và cs, 2006 a) Vi khuẩn quang hợp kỵ khí là vi khuẩn oxy hóa Fe(II)bằng con đờng kỵ khí đợc biết điến đầu tiên (Widdel và cs, 1993) Vi khuẩn này phổ

biến đợc biết đến hiện nay thuộc các chi Chlorobium, Rhodobacter, Thiodictyon,

Rhodovulum, Rhodomicrobium (Ehrenreich và Widdel, 1994; Heising và Schink,

1998; Heising và cs, 1999; Straub và cs, 1999; Kappler và Newman, 2004; Miot vàcs, 2009) Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng vi khuẩn quang hợp oxy hóaFe(II) không có khả năng sử dụng Fe(II) ở dạng khoáng mà chỉ có thể oxy hóaFe(II) ở dạng ion hòa tan (Kappler và Newman, 2004), do đó chúng chỉ đóng vai trònhỏ trong quá trình oxy hóa - khử sắt và sự phong hóa sắt trong môi trờng trên cạn.

1.1.5 Vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II)

Gần đây, việc xác định đợc các vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II) đã lấp đầy chỗtrống trong bức tranh tổng thế về chu trình oxy hóa - khử sắt nhờ vi sinh vật (Widdelvà cs, 1993; Straub và cs, 1996) Các bằng chứng gần đây cũng đã chỉ ra rằng vikhuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II) có thể đóng vai trò quan trọng trong chu trình oxy hóa -khử sắt (Senn và Hemond, 2002; Straub và cs, 2004; Weber và cs, 2006 c), trongchu trình sinh địa hóa đất, trầm tích, khoáng hóa, và quá trình cố định các chấtphóng xạ và kim loại nặng (Chaudhuri và cs, 2001; Weber và cs, 2001; Lack và cs,2002; Weber và cs, 2006 c) Trong môi trờng không có oxy, quá trình oxy hóaFe(II) nhờ vi khuẩn đã đợc chứng minh là thờng đi kèm với quá trình khửperchlorate, chlorate và đặc biệt là nitrate (Straub và cs, 1996; Bruce và cs, 1999;Weber và cs, 2006 c).

1.2. Khử nitrate nhờ vi khuẩn

Hình 2 Chu trình nitơ trong tự nhiên.

Nguồn nitơ chủ yếu cho quá trình đồng hoá ở các sinh vật tự dỡng và dị dỡnglà ammonium và nitrate (đợc khử thành ammonium trớc khi sử dụng) Trong tế bào,

Cố định Nitơ

Azotobacter, Rhizobium

Nitrobacter

nitơ tập trung ở thành phần của protein (các axit amin) và đợc chuyển hoá thànhdạng vô cơ thông qua quá trình oxy hoá hoặc khử nhóm amin (-NH2) trong axitamin thành ammonium Ngoài tự nhiên, ammonium tồn tại ở dạng NH3 tại pH kiềmvà ở dạng NH4 tại pH acid và trung tính.

Cố định nitơ không khí chuyển thành ammonium là quá trình tiêu tốn nhiều

năng lợng Trong tự nhiên chỉ có một số loài vi khuẩn và tảo lam có khả năng thựchiện phản ứng này nhờ sản sinh ra enzyme nitrogenase Các loài vi khuẩn cố địnhnitơ đợc chia vào hai nhóm (1) các loài sống cộng sinh trong nốt sần ở rễ của thực

vật (Rhizobium) và (2) các loài sống tự do trong đất, tập trung quanh vùng rễ thựcvật (Azotobacter) (Shapleigh, 2000)

Nitrate hoá là quá trình chuyển hoá ammonium thành nitrate do hai nhóm vi

khuẩn riêng biệt đảm nhiệm Nhóm thứ nhất là các loài thuộc chi Nitrosomonas (vàmột số chi khác nh Nitrospira, Nitrococcus, Nitrosolobus và Nitrosovibrio) oxy

hoá ammonium thành nitrite: NH4 + 1,5 O2 → NO2−

+ 2 H+ + H2O Nhóm thứ hai

đại diện là chi Nitrobacter tiếp tục oxy hoá nitrite thành nitrate: NO2−

+ 0,5 O2 →NO3−

Ngoài ra hai chi Nitrospira và Nitrococcus thuộc nhóm thứ nhất cũng có khả

năng tham gia bớc phản ứng oxy hoá nitrite thành nitrate (Shapleigh, 2000)

Khử nitrate thành khí nitơ là quá trình diễn ra trong điều kiện không có oxy,

trong đó nitrate đợc vi sinh vật sử dụng làm chất nhận điện tử cuối cùng khép kínchuỗi hô hấp trong tế bào Khử nitrate diễn ra qua một số bớc trung gian, mỗi bớcdo một loại enzyme làm chất xúc tác: NO3−

→ NO2−

→ NO → N2O → N2 Cácnghiên cứu về đa dạng và sinh thái cho thấy phổ biến nhất trong các môi trờng đất,

nớc và nớc thải là các loài thuộc chi Pseudomonas (P fluorescens, P aeruginosa,

P denitrificans) và Acaligenes (Shapleigh, 2000).

Trong tự nhiên, vi khuẩn có khả năng sinh trởng bằng cách khử nitrate tơngđối đa dạng, thuộc nhiều nhóm phân loại khác nhau (Shapleigh, 2000) Nguồn điệntử cho nhóm vi khuẩn này sử dụng để khử nitrate cũng rất phong phú, bao gồm cácacid hữu cơ, cacbuahydro mạch thẳng hay mạch vòng, kể cả một số chất khó phânhủy (Shapleigh, 2000) Trong môi trờng nớc ngọt nitrate là chất nhận điện tử quantrọng thứ hai sau oxy, vì thế nhóm vi khuẩn khử nitrate ở đây cũng đa dạng hơn sovới môi trờng nớc lợ và nớc mặn, nơi có vi khuẩn khử sulfat chiếm u thế do ảnh h-ởng của nồng độ sulfate (SO42-) cao từ nớc biển.

1.3.Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate

ở pH trung tính, oxy hóa Fe(II) hòa tan và Fe(II) ở dạng khoáng nhờ vikhuẩn kỵ khí không phụ thuộc ánh sáng xảy ra đồng thời với quá trình khử nitrateđã đợc chứng minh trong các môi trờng nớc mặn và nớc ngọt khác nhau, bao gồm cảđất ruộng, ao, suối, mơng, phá nớc lợ, hồ, đầm lầy, lớp ngập nớc, thủy nhiệt, trầmtích đáy biển (Straub và cs, 1996; Benz và cs, 1998; Chaudhuri và cs, 2001; Rateringvà Schnell, 2001; Hauck và cs, 2001; Senn và Hemond, 2002; Edwards và cs, 2003).Những môi trờng này chứa quần xã vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate khoảng 103 -5ì108 tế bào/g trầm tích tham gia vào chu trình oxy hóa - khử sắt.

ở pH 7, tất cả các cặp oxy hóa khử của quá trình khử nitrate có giá trị dơng(NO3ˉ/NO2ˉ = +430 mV; NO2ˉ/NO = +350 mV; NO/N2O = +1180 mV; N2O/N2 =+1350 mV (Thauer và cs, 1977)) hơn so với cặp oxy hóa khử Fe(III)/Fe(II) do đónitrate là chất nhận điện tử thích hợp cho quá trình oxy hóa Fe(II) Về mặt nhiệtđộng học, oxy hóa Fe(II) có thể xảy ra đồng thời với khử nitrate thành NH4 (NO3ˉ/NH4 = + 360 mV (Thauer và cs, 1977), nhng thực tế cha có bằng chứng nào chứngminh vi khuẩn oxy hóa Fe(II) tạo ra NH4 từ việc khử nitrate (Straub và cs, 1996,1998; Benz và cs, 1998) Trong tất cả các vi khuẩn đợc biết đến, oxy hóa Fe(II) luônđi kèm với khử nitrate thành N2 (Straub và cs, 1996; Benz và cs, 1998) Gần đây,

Weber và cộng sự (2006 c) mới phát hiện đợc chủng Geobacter sp có cả hai khả

năng khử Fe(III) và oxy hóa Fe(II) bằng nitrate tạo NH4 là sản phẩm của quá trìnhkhử.

Vì quá trình oxy hóa Fe(II), khử nitrate không bị giới hạn bởi vùng tiếp xúcánh sáng nên có thể có vai trò quan trọng hơn quá trình oxy hóa kỵ khí nhờ vi khuẩnquang hợp (Straub và cs, 2001) Đáng chú ý là hầu hết các thí nghiệm làm giàu haynuôi cấy vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate đã tiến hành đều phụ thuộc vào nguồncarbon hữu cơ (nh Na-acetate) (Straub và cs, 1996; Benz và cs, 1998), tức là điềuđiện sinh trởng dị dỡng vô cơ Phơng pháp MPN đã cho thấy FOM dị dỡng chiếm0,8% tổng số vi khuẩn khử nitrate và thờng gặp hơn so với FOM tự dỡng (Straub vàcs, 1998) Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tự dỡng mới chỉ đợc biết đến với hai

chủng Ferroglobus placidus, là một vi khuẩn cổ a nhiệt (Hafenbradl và cs, 1996) vàchủng 2002, là vi khuẩn a ấm thuộc phân lớp β-Proteobacteria (Weber và cs, 2006

b).

1.4.Cơ chế phân tử của quá trình oxy hóa Fe(II) và các gen liên quan

Cho đến nay cha có bất cứ công bố nào về cơ chế phân tử của quá trình oxyhóa Fe(II) ở vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate Tuy nhiên, quá trình oxy hóa

Fe(II) ở vi khuẩn hiếu khí, a acid Acidithiobacillus ferrooxidans đã đợc nghiên cứu

khá chi tiết.

Hình 3 Cơ chế tạo năng lợng trong quá trình oxy hóa Fe(II) ở vi khuẩn A.ferrooxidans theo Ingledew và cộng sự (Ehrlich và Newman, 2008).

Theo mô hình về quá trình oxy hóa Fe(II) ở A ferrooxidans do Ingledew mô

tả năm 1986 (hình 3) (Ehrlich và Newman, 2008), Fe(II) đợc oxy hóa ở bề mặtngoài của màng ngoài tế bào bằng cách chuyển 1 điện tử cho lớp Fe(III) nằm trongmàng ngoài của tế bào, lớp sắt này bị khử thành Fe(II) Điện tử sau đó đợc chuyển

lần lợt cho enzyme X (cha xác định), protein rusticyanin và cytochrome c nằm trongkhoảng gian màng Cytochrome c sau đó gắn lên bề mặt ngoài của màng sinh chấtđể thuận tiện cho việc chuyển điện tử qua màng tới cytochrome a1 định vị ở mặt

trong của màng sinh chất Cytochrome a1 sau đó chuyển điện tử cho O2 để tạo thànhH2O (hình 3) (Ehrlich và Newman, 2008)

Sau đó, Blake và cộng sự (1992) đã đa ra một mô hình chuỗi dẫn truyền điện

tử trong quá trình oxy hóa Fe(II) ở A Ferrooxidans, theo đó điện tử đợc chuyển rất

nhanh từ Fe(II) đến rusticyanin nhờ xúc tác bởi enzyme (iron rusticyaninoxidoreductase) Quá trình đợc chứng minh là phụ thuộc vào sự có mặt của ionsulfate Tuy nhiên vào thời điểm đó các tác giả lại cha xác định đợc vị trí của

cytochrome c (chất khử rusticyanin) và cách chuyển điện tử từ Fe(II) đi vào khoảng

gian bào (nơi rusticyanin kh trú)

Hình 4 Mô hình mới nhất hiện nay về cơ chế dẫn truyền điện tử từ Fe(II) đếnO2 trong quá trình oxy hóa Fe(II) ở A ferrooxidans (Ehrlich và Newman, 2008).

OM, màng ngoài; PP, khoảng gian màng; PM, màng sinh chất; Cyc1, cytochrome

c1; Cyc2, cytochrome c2; rc, rusticyanin; bc1, phức hợp cytochrome bc1; aa3,cytochrome aa3; mũi tên chỉ hớng dòng điện tử.

Cho đến năm 2002, Yarzábal và cs đã xác định đợc cytochrome c có khối ợng phân tử lớn (Cyc2) trên màng ngoài của A ferrooxidans chủng 23270 và chủng33020 bằng phơng pháp sinh học phân tử (Yarzábal và cs, 2002a, b) Trớc đó genmã hóa cho Cyc2 cũng đã đợc chứng minh là gen thuộc operon rus (Appia-Ayme và

l-cs, 1999) Operon này bao gồm các gen mã hóa cho tất cả các protein liên quan đếnchuỗi dẫn truyền điện tử từ Fe(II) tới O2 và chúng đợc điều hòa rất nghiên ngặt

(Yarzábal và cs, 2004) Những protein đợc mã hóa từ operon rus sẽ vận chuyển điện

tử đến chất nhận điện tử cuối cùng là O2 lần lợt là cytochrome Cyc2, rusticyanin,cytochrome Cyc1, và cytochrome oxidase (aa3) (hình 4) Vị trí của cytochromeCyc2 trên màng ngoài có liên quan trực tiếp đến quá trình vận chuyển một điện tử từmỗi Fe(II) vào trong tế bào chứng minh rằng Fe(II) đợc sử dụng nh một nguồn năng

lợng của A ferrooxidans nhng không xâm nhập vào bên trong tế bào.

Các gen liên quan đến quá trình oxy hóa Fe(II) mới chỉ đợc đề cập ở các

FOM hiếu khí nh A ferrooxidans và FOM quang hợp kỵ khí nh Rhodopseudomonas

palustris, chủng TIE-1 (Jiao và cs, 2005; Jiao và Newman, 2007) hay Rhodobactercapsulatus SB1003 (Croal và cs, 2007) Những gen liên quan và cơ chế dẫn truyền

điện tử trong quá trình oxy hóa Fe(II) kỵ khí đi kèm với quá trình khử nitrate trongmôi trờng pH trung tính vẫn cha đợc làm rõ, và cho đến nay cha có công bố nào đềcập đến vấn đề này Khó khăn trong việc nghiên cứu có thể là do môi trờng sống kỵkhí của những vi khuẩn quyết định hoặc là do trong môi trờng pH trung tính, cơ chấtvà sản phẩm của quá trình oxy hóa Fe(II) ít hòa tan gây khó khăn trong quá trìnhnghiên cứu sinh lý cũng nh di truyền hay cơ chế chuyển hóa diễn ra trong tế bào(Straub và cs, 2001).

1.5.ảnh hởng của ô nhiễm nitrate và thừa sắt trong nguồn nớc sinh hoạt

Ô nhiễm nitrate và sắt trong nớc sinh hoạt là một trong những vấn đề quantrọng đang đợc quan tâm ở Việt Nam cũng nh trên thế giới Hàm lợng nitrate chophép trong các nguồn nớc sinh hoạt là 10 mg/L theo tiêu chuẩn quốc tế và 45 mg/Ltheo tiêu chuẩn Việt Nam Một nghiên cứu của Kross và cộng sự (1993) cho thấy n-ớc giếng ở Iowa, Mỹ có nồng độ nitrate vợt quá 10 mg/L so với lợng tiêu chuẩn chophép Hàm lợng nitrate trong vùng nớc châu thổ sông Cửu Long, Việt Nam lên đến80 mg/L (Mai Thanh Truyết, 1997), trong khi hàm lợng cho phép là 45 mg/L(TCVN 5944 - 1995) Nghiên cứu của Viện Vệ sinh dịch tễ Tây Nguyên cho biếttình trạng ô nhiễm các kim loại nặng nh sắt và mangan rất đáng báo động, hàm lợngsắt lên tới 50 mg/L, trong khi hàm lợng tiêu chuẩn cho phép là 1 - 5 mg/L (TCVN5944 - 1995)

1.5.1 ảnh hởng của nitrate đến sức khỏe con ngời

Hội chứng trẻ da xanh (methemoglobinaemia): Hội chứngmethemoglobinemia đợc hình thành do nhiều nguyên nhân, trong đó bao gồm cảviệc thiếu hụt các enzyme khử methemoglobin (mang tính di truyền), sự khác thờngvề mặt di truyền của hemoglobin (dễ bị oxy hóa), và ảnh hởng của dợc phẩm và hóachất có tính oxy hóa bao gồm cả nitrate và nitrite (Avery, 1999) Nitrate hoặc nitriteoxy hóa Fe(II) trong hemoglobin thành Fe(III) là nguyên nhân khiến hemoglobinchuyển thành dạng methemoglobin, ở trạng thái này hồng cầu không thể liên kết vàvận chuyển oxy (Avery, 1999; Lundberg và cs, 2004) Thông thờng, khimethemoglobin hình thành đợc khoảng 15% lợng hemoglobin lu thông thì bắt đầuhình thành hội chứng xanh tím (Avery, 1999) Hội chứng này phổ biến ở trẻ dới 6tháng tuổi bởi vì lợng enzyme khử methemoglobin (reductase NADH-cytochrome

b5) của chúng chỉ bằng một nửa của ngời lớn (Lundgerg và cs, 2004) Tác hại củanitrate đối với sức khỏe con ngời không phải là do bản thân ion nitrate gây ra Thựctế là nitrate có độc tính rất thấp nhng khi nồng độ nitrate tăng lên thì nó sẽ chuyển

thành nitrite nhờ xúc tác của enzyme vi khuẩn và chính nitrite là nguyên nhân gâyđộc (Lundberg và cs, 2004).

Ung thu dạ dày: Quá trình chuyển hóa giữa nitrate và nitrite có thể hình

thành N-nitrosamines là một chất gây ung th phổ biến (Tricker và Preussmann,1991) N-nitrosamines có thể đợc hình thành từ chế độ ăn, môi trờng nghề nghiệp và

thông qua sử dụng thuốc lá Bình thờng trong dạ dày có tính acid nên nitrite tạothành acid nitrous và không gây hại cho dạ dày Nhng khi tính acid của dạ dày giảm(do sử dụng thuốc hoặc bị bệnh) các vi khuẩn định c trong dạ dày có thể xúc tác cho

việc hình thành N-nitrosamines từ nitrite, và đây có thể là một trong những nguyên

nhân gây ung th dạ dày Tuy nhiên cơ chế chi tiết của hiện tợng này vẫn cha đợc làmrõ (Lundberg và cs, 2004).

Ung th bàng quang Hầu hết nitrate nội sinh và thu nạp từ chế độ ăn đợc thải

ra ở dạng nớc tiểu Vì nớc tiểu thờng là vô trùng nên không có quá trình khử nitratexảy ra Tuy nhiên, trong trờng hợp nhiễm khuẩn đờng tiết niệu thì một số lợng đáng

kể nitrite có thể đợc tạo thành bởi vi khuẩn Nhiễm Schistosoma haematobium (sống

ký sinh) là một tác nhân cực kỳ nguy hiểm đối với quá trình phát triển ung th bàng

quang, và N-nitrosamines đợc cho là đóng vai trò quan trọng trong việc phát sinh

dạng ung th này Cơ chế giả thiết là do nhiễm kinh niên vi khuẩn khử nitrate, làm

tăng nồng độ nitrite trong nớc tiểu, do đó tăng cờng sinh N-nitrosamines và có thể

dẫn tới ung th bàng quang (Lundberg và cs, 2004).

1.5.2 ảnh hởng của thừa sắt đến sức khỏe con ngời

Vai trò thiết yếu của sắt: Sắt là nguyên tố phổ biến trong tự nhiên, là một

thành phần quan trọng trong tổng hợp hemoglobin (chất vận chuyển oxy cho các tếbào trong cơ thể) và myoglobin (chất dự trữ oxy cho cơ thể) Ngoài ra sắt còn thamgia vào thành phần một số enzyme oxy hoá khử nh catalase, peroxydase và cáccytochrome (những chất xúc tác sinh học quan trọng trong cơ thể) Nó đóng vai tròquan trọng trong việc sản xuất ra năng lợng oxy hoá, vận chuyển oxy, hô hấp của tylạp thể và bất hoạt các gốc oxy có hại Tuy nhiên quá tải sắt trong cơ thể cũng gây ứđọng sắt tại các mô nh tim, gan, tuyến nội tiết , dẫn đến rối loạn trầm trọng chứcnăng các cơ quan này (Trần Thị Kiều My và Nguyễn Hà Thanh, 2006).

Tác hại của thừa sắt trong cơ thể hiện nay vẫn còn đang gây nhiều tranh

cãi Ngời ta cho rằng bộ não là mục tiêu chính của sự thừa sắt, sự tích lũy sắt trongmô não hoặc gây ra hoặc đóng góp vào việc sinh ra bệnh về thần kinh nh Parkinsonvà Alzheimer Sắt còn đợc coi nh là một chất gây ung th rất mạnh Và hiện nay ngờita đã có các bằng chứng chứng minh thừa sắt gây ra bệnh ung th gan Sắt d thừa lắng

đọng trong tim và các động mạch có thể gây nên các bệnh về tim cũng nh là phá vỡđộng mạch Sắt thừa lắng đọng trong lá lách sẽ phá vỡ sự bài tiết insuline và gây rabệnh đái tháo đờng nghiên trọng ở ngời lớn (ngời ta tìm thấy những lợp sắt lắngđọng trong các tế bào tụy ở ngời có bệnh đái đờng tuýp 2) (Moon, 2008)

Để có thể hấp thu đợc, sắt phải chuyển từ dạng ferric (Fe(III)) sang dạngferrous (Fe(II)) Pepsin tách sắt khỏi các hợp chất hữu cơ và chuyển thành dạng gắnvới các acid amin hoặc đờng Acid clohydric khử Fe(III) thành Fe(II) để hấp thu(Trần Thị Kiều My và Nguyễn Hà Thanh, 2006) Vì vậy nên lợng sắt d thừa trong n-ớc uống cho dù ở dạng Fe(II) hay Fe(III) đều gây nguy hiểm cho con ngời

1.6.ý nghĩa của việc nghiên cứu tính đa dạng di truyền và tiềm năng ứngdụng của các vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate

Với khả năng hô hấp kỵ khí bằng nitrate, vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitratecó thể tham gia vào quá trình loại bỏ nitơ trong các nguồn nớc thải hay nớc sinhhoạt có nồng độ nitơ cao Quá trình này diễn ra khi có mặt các hợp chất hữu cơ làmnguồn điện tử thích hợp để khử nitrate, ví dụ nh lactate, acetate hay methanol lànhững sản phẩm của quá trình phân giải chất hữu cơ cao phân tử Bên cạnh đó, khảnăng sinh trởng vô cơ sử dụng Fe(II) làm nguồn điện tử để khử nitrate là một u thếcủa nhóm vi khuẩn này so với các loài khử nitrate thông thờng Do tác động của vikhuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate, cùng một lúc ion Fe(II) và nitrate d trong nguồnnớc có thể đợc loại bỏ Khả năng ứng dụng của nhóm vi khuẩn này có ý nghĩa đốivới việc xử lý các nguồn nớc ngầm dùng cho sinh hoạt bị nhiễm sắt và nitơ ngấmxuống từ tầng nớc mặt.

Từ thực trạng ô nhiễm sắt và nitrate cũng nh ảnh hởng của chúng đến sứckhỏe con ngời cùng với vai trò của các vi khuẩn có khả năng làm giảm lợng sắt vànitrate trong môi trờng, những nghiên cứu về tính đa dạng di truyền và tiềm năngứng dụng của nhóm vi khuẩn này trong các biện pháp xử lý các vùng ô nhiễm sắt vànitrate là việc làm cần thiết Nghiên cứu này không chỉ bổ sung kiến thức khoa họcvề một nhóm vi khuẩn có khả năng oxy hóa Fe(II), khử nitrate mà còn đa ra nhữnggợi ý về hớng xử lý các nguồn nớc ô nhiễm kim loại nặng và chất hữu cơ Cho đếnnay, nhóm vi khuẩn này chỉ mới đợc tập trung nghiên cứu ở một số nớc châu Âu vớiđiều kiện tự nhiên hoàn toàn khác biệt với nớc ta Còn trong nớc thì cha có nghiêncứu nào đề cập đến nhóm vi khuẩn tiềm năng này

1.7.Các phơng pháp sinh học phân tử hiện đại đợc sử dụng trong các nghiêncứu về tính đa dạng và cấu trúc di truyền của quần xã vi khuẩn

1.7.1 DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

Một trong những kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại phổ biến đợc sử dụng đểđánh giá tính đa dạng di truyền của quần xã vi sinh vật không qua nuôi cấy hiện naylà kỹ thuật PCR-DGGE (Giovannoni và cs, 1990; Ward và cs, 1990) PCR-DGGEtiến hành với DNA của ribosome đợc Muyzer và cs công bố trong nghiên cứu vềsinh thái vi sinh vật năm 1993 Cho đến nay kỹ thuật này đợc biết đến phổ biếntrong nghiên cứu đa dạng di truyền vi sinh vật trong nhiều phòng thí nghiệm Ngàycàng có nhiều công bố về ứng dụng PCR-DGGE trong nghiên cứu đa dạng di truyềnvi sinh vật trong nhiều môi trờng sinh thái khác nhau nh trong đất (Norris và cs,2002; Avrahami, 2002; Nicol và cs, 2003), biển (Bano and Hollibaugh, 2002), sông(Sekiguchi và cs, 2002) và nớc hồ (Crump và cs, 2003) Ngoài ra sử dụng PCR-DGGE còn xác định đợc nhóm vi sinh vật u thế trong các mẫu môi trờng nghiên cứu(Bano và Hollibaugh, 2000)

Phơng pháp DGGE dựa trên việc di chuyển của các phân đoạn 16S rDNA đãđợc khuếch đại trên gel polyacrylamide có chứa chất biến tính Trong phơng phàynày, các phân đoạn DNA giống nhau về chiều dài nhng khác nhau về trình tự cáccặp bazơ có thể đợc phân tách (Fischer và Lerman, 1979) Trình tự giàu GC (còn gọilà kẹp GC) có thể đợc gắn vào một trong hai mồi trong phản ứng PCR để ổn địnhkhả năng biến tính của các phân đoạn trên gel polyacrylamide để có thể xác định đ-ợc 100% số trình tự có trong mẫu (Myers và cs, 1985; Sheffield và cs, 1989).DGGE cho phép xác định cả những vi sinh vật không thể phân lập và nuôi cấy đợc(Davies và cs, 2004).

1.7.2 FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)

FISH là một trong số những phơng pháp cho phép xác định nhóm phân loạicủa vi khuẩn trong mẫu mà không qua nuôi cấy bằng cách lai với các đầu dò gắnhuỳnh quang đặc hiệu cho rRNA và pháp hiện trên kính hiển vi huỳnh quang FISHứng dụng cho vi khuẩn lần đầu tiên đợc mô tả hai mơi năm về trớc (Giovannoni vàcs, 1988; Delong và cs, 1989; Amann và cs, 1990), và đợc đợc đánh dấu nh một bớctiến vợt bậc trong lĩnh vực sinh thái vi sinh vật Phơng pháp này chủ yếu dựa trêntrình tự của hệ tiểu đơn vị 16S rRNA, là trình tự đã đợc rất quan tâm trong nghiêncứu hệ thống phân loại của vi sinh vật (Woese và cs, 1990; Ludwig và Schleifer,1994) Đây là phơng pháp duy nhất cho phép quan sát tính đa dạng di truyền trựctiếp trong môi trờng qua các tế bào bắt cặp với đầu dò đặc hiệu khác nhau (Amannvà cs, 1995).

1.7.3 ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis)

ARDRA là phơng pháp phân tích các đoạn cắt giới hạn của 16S DNA sau khiđợc khuếch đại bằng phản ứng PCR ARDRA đợc sử dụng để phân tích quần xã vikhuẩn trong các môi trờng khác nhau (Moyer và cs, 1994; Martínez-Murcia và cs,1995; Lagacé và cs, 2004) Phơng pháp này còn đợc sử dụng để đánh giá nhanh sựbiến đổi về mặt di truyền trong quần xã qua thời gian hoặc là so sánh các quần xãtrong các điều kiện môi trờng khác nhau (Frederic và cs, 2000; Lagacé và cs, 2004)hay nghiên cứu đa dạng di truyền các chủng đơn trong quần xã vi sinh vật (Moyervà cs, 1994).

1.7.4 Giải trình tự tự động

Các máy đọc trình tự tự động hiện nay hoạt động dựa trên phơng pháp xácđịnh trình tự DNA (phơng pháp Dideoxy - hay còn gọi là phơng pháp gián đoạnchuỗi (chain-determination method)) đợc Sanger phát triển năm 1977 Nguyên tắccủa phơng pháp là sử dụng 1% ddNTP (dideoxynucleotide, không có nhóm 3'-OH)để làm ngừng phản ứng tổng hợp DNA một cách ngẫu nhiên Các đoạn nucleotidecó kích thớc dài ngắn khác nhau sẽ đợc tổng hợp A, T, G, C đợc đánh dấu huỳnhquang khác nhau sẽ đợc pháp hiện bằng detector tín hiệu huỳnh quang khi điện dimao quản 8 đến 16 kênh.

Chơng 2 - Nguyên vật liệu và phơng pháp nghiên cứu2.1.Nguyên vật liệu

2.1.1 Đối tợng nghiên cứu

Mẫu bùn và trầm tích đợc thu thập ở ba môi trờng sinh thái đại diện khácnhau: mẫu bùn đáy ao nớc ngọt và chân ruộng ngập nớc đợc thu ở ngoại thành HàNội, mẫu trầm tích nớc lợ đợc thu ở ven biển Vân Đồn - Quảng Ninh Mẫu chânruộng và trầm tích ven biển đợc thu thập trong các ống nhựa mica có nút cao su ởhai đầu cho phép khoan sâu tới 60 cm dới bề mặt trầm tích (hình 5) Mẫu đáy ao đợc

thu thập trong bình thuỷ tinh, sau đó bổ sung nớc vào toàn bộ thể tích để giảm thiểusự ảnh hởng của oxy không khí Mẫu đợc bảo quản ở nhiệt độ 4C cho đến khi tiếnhành các thí nghiệm tiếp theo.

Hình 5 Mẫu bùn và trầmtích thu thập ngoài môi trờng

tự nhiên, đợc đảm bảo kỵ khínghiêm ngặt.

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất đợc sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật đều là những hóa chấtcó tiêu chuẩn chất lợng cao của các hãng cung cấp lớn nh Merck, Sigma Hoá chấtvà một số kit dùng cho phân tích sinh học phân tử do các hãng Bioneer-Hàn Quốc,Fermentas-Đức, Qiagen-Mỹ, ABI-Mỹ, BioRad-Mỹ cung cấp

- Hóa chất sử dụng nuôi cấy vi khuẩn: Các chất khoáng (bảng 1), vi lợng (bảng 2),

vitamine (bảng 2), chất cho điện tử (FeSO4 và MnSO4), chất nhận điện tử (NaNO3),khí N2 và CO2.

- Hóa chất sử dụng trong phơng pháp quang phổ xác định hàm lợng sắt II, mangan

II và nitrate: hydroxylamine hydrochloride, formaldehyde, ammonia,phenanthroline, ammonium acetate, disulfofemic

- Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm sinh học phân tử: Hóa chất cần thiết để tách

DNA, PCR, tinh sạch sản phẩm PCR, điện di biến tính, giải trình tự.

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

Nghiên cứu đợc thực hiện tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học ĐHQGHN, sử dụng các thiết bị chuyên môn dùng trong vi sinh vật học, sinh họcphân tử và hoá phân tích đạt tiêu chuẩn quốc tế.

Bể ổn nhiệt Jeio Tech, Hàn Quốc- Máy đo pH Horiba, Nhật Bản- Máy ly tâm Eppendorf, Đức - Máy PCR Eppendorf, Đức - Máy điện di ngang Nyx Technik, Mỹ

- Máy DGGE DcodeTM universal Mutation Detection System BioRad, Mỹ

- Máy GelDoc BioRad, Mỹ

- Máy đo quang phổ UV-Vis (GBC instrument, úc)- Kính hiển vi quang học Olympus, Nhật Bản- Kính hiển vi huỳnh quang Zeiss, Đức

Và một số thiết bị cần thiết khác đợc sử dụng trong quá trình nuôi cấy vikhuẩn kỵ khí nh bình N2, CO2, ống nghiệm nút xoáy, bình serum và nút cao su.

2.2.Phơng pháp nghiên cứu

Các phơng pháp, nội dung nghiên cứu đợc sử dụng trong đề tài đợc tóm tắtbằng sơ đồ thí nghiệm thể hiện ở hình 6.

Cắt băng, thôi gel, giải trình tự

ARDRA 16S rDNA

Giải trình tự các nhóm chínhNghiên cứu hoạt

tính sinh học

Khả năng ứng dụng

Cắt băng, thôi gel, giải trình tự

ARDRA 16S rDNA

Giải trình tự các nhóm chínhNghiên cứu hoạt

tính sinh học

Khả năng ứng dụng

α-Proteobacteriaβ-Proteobacteriaγ-Proteobacteria

2.2.1 Xác định số lợng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate

Bảng 1 Môi trờng khoáng kỵ khí nớc ngọt và nớc lợ cho vi khuẩn oxyhóa Fe(II), khử nitrate (Ratering, 1999).

Chuẩn pH = 6,5 bằng NaOH

Số lợng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate đợc xác định thông qua phơngpháp MPN (American Public Health Association, 1969) Phơng pháp này đợc xâydựng dựa trên phép pha loãng mẫu và số lợng ống dơng tính (sinh trởng) và âm tính(không sinh trởng) trong các dãy pha loãng Biểu hiện dơng tính có thể là sự có mặtcủa khí trong các ống lên men, độ đục của môi trờng, sự biến đổi màu của môi trờnghay sự thay đổi pH tùy thuộc vào các trờng hợp khác nhau (USDA, 2008; Downesvà Ito, 2001)

Môi trờng dịch thể kỵ khí hoàn toàn có thành phần khoáng tơng ứng với nớcngọt (dùng cho mẫu bùn từ đáy ao và chân ruộng ngập nớc) hoặc nớc lợ (dùng cho

mẫu trầm tích ven biển Vân Đồn - Quảng Ninh) (bảng 1) Thí nghiệm MPN đợc tiến

hành với dãy pha loãng đến 10- 8 với thể tích 10% bùn đáy hoặc trầm tích trong môitrờng khoáng nớc ngọt hay nớc lợ, thí nghiệm đợc tiến hành với 3 dãy pha loãng,mẫu đợc đảm bảo kỵ khí hoàn toàn và ủ trong tủ ấm tại 28oC trong 8 tuần Sự pháttriển của vi khuẩn trong ống MPN đợc ghi nhận thông qua sự thay đổi màu môi tr-ờng từ trắng đục (màu của Fe(II)) sang vàng nâu (màu của Fe(III))

2.2.2 Phân lập vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II), khử nitrate

ống MPN ở nồng độ pha loãng cao nhất có vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khửnitrate phát triển đợc sử dụng để làm nguồn phân lập các khuẩn lạc đơn Việc phânlập đợc tiến hành theo phơng pháp pha loãng trên dãy ống thạch bán lỏng (1%) vớimôi trờng có thành phần tơng tự nh môi trờng dùng trong phơng pháp MPN (Widdelvà Bak, 1992) ống thạch bán lỏng sau khi bổ sung nguồn vi sinh vật (10%) từ ống

MPN (nguồn phân lập) đợc sục khí N2 và ủ ở t thế đảo ngợc đầu tại 28oC trong bóngtối Khuẩn lạc đơn phát triển trong các ống pha loãng đợc tách bằng pipet Pasteur vàchuyển sang môi trờng dịch thể thích hợp (nớc ngọt hay nớc lợ).

2.2.3 Tách DNA tổng số từ mẫu bùn và trầm tích và chủng đơn

DNA tổng số của mẫu bùn và trầm tích từ các ống MPN đợc tách chiết

theo phơng pháp do Zhou và cs, 1996 mô tả với cải biến về nồng độ đệm phosphate(tăng từ 100 mM lên 120 mM) trong đệm tách (gồm:100 mM Tris (pH 8);100 mMEDTA (pH 8); 120 mM Đệm phosphate (Na2HPO4/NaH2PO4); 1,5 M NaCl; 1%CTAB) Trộn 2 ml mẫu làm giàu từ ống MPN với 5,4 ml đệm tách DNA trong ốngfalcol (chịu dung môi) Phá tế bào bằng phơng pháp sốc nhiệt trong nitơ lỏng và bểổn nhiệt ở 37oC, lặp lại 5 lần Bổ sung 40 μl proteinase K (10 mg/ml), lắc ngang vớitốc độ 225 vòng/phút trong 30 phút ở 37oC Thêm 600 μl SDS (20%), ủ ở 65oC trong2 giờ, 25 phút đảo lộn đầu một lần Trộn đều kỹ với lợng tơng đơng PCI về thể tích.Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng Thu lấy phần dịch phía trênsang ống mới, trộn đều kỹ với lợng tơng đơng CI về thể tích Ly tâm 6000 vòng/phúttrong 10 phút ở nhiệt độ phòng Thu lấy phần dịch phía trên sang ống mới, bổ sung0,6 lần thể tích isopropanol, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ Ly tâm thu kết tủa DNAở 12000 vòng/ phút trong 25 phút ở nhiệt độ phòng Đổ phần dịch ở trên, rửa kết tủavới 10 ml ethanol 80%, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ phòng Đổethanol, để khô ở nhiệt độ phòng Hòa tan DNA trong 50 μl nớc MQ đã khử trùng,chuyển DNA sang ống eppendorf 1,5 ml và giữ ở 20oC.

DNA genome của chủng đơn đợc tách theo phơng pháp của Marmur (1961).

1 ml dịch tế bào đợc ly tâm 5000 - 10000 vòng/ phút trong 5 phút, sau đó rửa với 1ml đệm TE (pH 8) rồi hòa tế bào trong 0,5 ml 5 mM EDTA (pH 8) Thêm 50 μllysozym (40 mg/ml), trộn đều, ủ trong bể ổn nhiệt ở 37oC trong 1 giờ Thêm 50 μlSDS (20%) và 50 μl proteinase K (4 mg/ml), trộn đều và ủ trong bể ổn nhiệt ở 55oCtrong 1 giờ Thêm 400 μl PCI, trộn đều trong 1- 3 phút, ly tâm 15000 vòng/phút ở4oC trong 15 phút Chuyển lớp dịch trong ở trên sang ống eppendorf mới Thêm 400μl CI, trộn đều, ly tâm 15000 vòng/phút tại 4oC trong 15 phút Chuyển lớp dịchtrong ở trên sang ống eppendorf mới Thêm 1/10 thể tích dung dịch 3M Na-acetate(pH 5,2) và 2 lần thể tích dung dịch 2-propanol (đã để lạnh -20oC), trộn đều và giữ ở-20oC trong vòng 15 phút đến 1 giờ Ly tâm 15000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút,chắt phần dịch phía trên để thu kết tủa DNA Rửa DNA trong ethanol 70% (đã đểlạnh -20oC) trong 1 phút, ly tâm 15000 vòng/ phút, đổ cồn, làm khô DNA ở nhiệt độ

phòng Hòa tan DNA trong 50 μl MQ vô trùng (hoặc đệm TE) và bảo quản tại 20Ccho các thí nghiệm tiếp theo

Sản phẩm DNA đợc kiểm tra trên gel agarose 1% trong đệm TAE tại 100Vtrong thời gian 15 phút Sau khi điện di, gel agarose đợc nhuộm trong dung dịchethidium bromide (5 mg/ml) trong 15 phút, sau đó rửa nớc và chụp ảnh dới tia UVtrên máy GelDoc (BioRad).

2.2.4 Phân tích đa dạng di truyền các chủng đơn bằng phơng pháp ARDRA

ARDRA đợc sử dụng để nghiên cứu mức độ đa dạng về di truyền của vi sinhvật dựa trên phân tích kết quả xử lý gen 16S rDNA bằng enzyme giới hạn(Ravenschlag và cs, 1999) Gen 16S rDNA (xấp xỉ 1500 bp) của các chủng đơn đợckhuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F (AGA GTT TGA TCC TGGCTC AG) và 1492R (GGT TAC CTT GTT ACG ACT T) với thành phần và chu trìnhphản ứng ở bảng 3.

Bảng 3 Phản ứng PCR gen 16S rDNA.

Thành phần phản ứng Thể tích(μl)

Enzym HaeIII (hoặc MspI) (Fermentas) 1 μl (10 u/μl)

Trộn đều và ly tâm nhanh, sau đó ủ hỗn hợp phản ứng tại 37oC trong 3 giờ

2.2.5 Phơng pháp điện di biến tính DGGE

Hình 7 Vị trí các mồi trên gen 16S rDNA ở Lactobacillus plantarum.

Khuếch đại đoạn gen 16S rDNA (550 bp): Vùng V3 - V5 của gen 16S

rDNA với độ dài 550 bp (hình 7) đợc khuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặpmồi GM5F (CCT ACG GGA GGC AGC AG) và 907R (CCG TCA ATT CCT TTRAGT TT) (Muyzer và cs, 1993) “Touch-down” PCR (bảng 5) đợc sử dụng để tăngđộ đặc hiệu và giảm sự hình thành các sản phẩm phụ Để tạo tính ổn định cho việcphân tách các trình tự DNA trên gel điện di biến tính, kẹp GC gồm 40 bp (CGCCCG CCG CGC GCG GCG GCC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G) đợc gắn vàođầu 5’ của mồi GM5F.

Bảng 5 Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR cho DGGE.

DGGE: Điện di đợc tiến hành trên gel polyacrylamide 6% với dải biến tính

urea/formamid từ 30% đến 60% Quá trình điện di đợc thực hiện bằng bộ điện diDcodeTM System (BioRad) trong đệm TAE, ở nhiệt độ 60C, tại 200 V, trong 3,5 giờ.Sau khi điện di, gel polyacrylamide đợc nhuộm trong dung dịch ethidium bromide

(5 mg/ml) trong 30 phút, sau đó rửa nớc và chụp ảnh dới tia UV trên máy GelDoc(BioRad)

Thôi gel: Băng điện di đợc cắt, rửa và thôi trong nớc qua đêm tại 4C Dịch

thôi DNA đợc dùng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR nh chu trình nhiệt củaphản ứng PCR cho DGGE (bảng 5) với cặp mồi GM5F (không có kẹp GC) và 907R.Sản phẩm PCR tiếp theo đợc tinh sạch bằng kít và giải trình tự.

2.2.6 Giải trình tự gen 16S rDNA và dựng cây phân loại

Gen 16S rDNA của các chủng đơn (1500 bp) và sản phẩm PCR từ các băngđiện di biến tính (550 bp) sau khi tinh sạch bằng kít tinh sạch sản phẩm PCR(Bioneer - Hàn Quốc) đợc tiến hành phản ứng đọc trình tự với ABI Prism BigDyeTerminator cycle sequencing kit và đọc trình tự trên máy tự động 3110 AvantAppied Biosystems Trình tự gen sau đó đợc phân tích, so sánh với trình tự 16SrDNA của các loài có liên quan hiện đã công bố trên DatabaseDDBJ/EMBL/GenBank sử dụng phần mềm BLAST Search Cây phân loại đợc dựngtheo phơng pháp neighbour-joining (Saitou và Nei, 1987), trong đó định dạng cây đ-ợc tiến hành dựa trên 1000 phép so sánh đa chiều (Felsenstein, 1985).

2.2.7 Phơng pháp FISH

FISH (Fluorescence in situ hybridization) là phơng pháp lai sử dụng các đầudò thích hợp bắt cặp với rRNA nhằm xác định phả hệ của vi sinh vật trong quần xãmột cách trực tiếp, không qua bớc phân lập và nuôi cấy (Amann và cs, 1992)

Chuẩn bị hóa chất: Formaldehyde 37% PBS 10

Bảng 6 Các đầu dò sử dụng trong nghiên cứu.Tên đầu

Đối tợng bắt

cặpTrình tự (5’ 3’)

Formamide (%)

)

ALF968 Proteobacteria

- Hoà 0,5 g mẫu đất hoặc bùn trong 1,5 ml PBS 1.

- Bổ sung formaldehyde vào mẫu tới nồng độ 2 - 4% và cố định ở 4C trong thờigian ít nhất là 30 phút nhng không quá 24 giờ.

- Ly tâm, loại phần dịch và rửa lại cặn tế bào bằng PBS 1.

- Ly tâm, loại PBS 1 và bổ sung 1,5 ml hỗn hợp dung dịch etanol/PBS (1:1).- Bảo quản tế bào đã cố định tại 20C.

Bảng 7 Chuẩn bị đệm lai và đệm rửa.

độ cuối2 ml đệm lai50 ml đệm rửa

Lai với đầu dò:

- Lấy 15 - 20 l mẫu hoà với 2 ml nớc cất vô trùng và đa tế bào trên màngpolycarbonate (0,2 μm).

- Để khô mẫu trong không khí và bảo quản trong hộp kín tại 20C cho đến khi sử dụng.- Chia màng thành các phần nhỏ để tiến hành lai (một màng có đờng kính 25 mm cóthể chia làm 6 - 10 phần sử dụng cho các đầu dò khác nhau) Dùng bút chì đánh dấumẫu (bằng số).

- Chuẩn bị 2 ml đệm lai trong ống eppendorf (bảng 7).

- Chuẩn bị dung dịch đầu dò: trộn 2 l đầu dò với 18 l đệm lai trong ống eppendorf0,5 ml, giữ trong đá, tránh ánh sáng.

- Đặt một miếng giấy thấm vào ống falcone 50 ml, đổ phần đệm lai còn lại vào ống.