CI Chloroform-isoamyl alcohol
2.2.3. Tách DNA tổng số từ mẫu bùn và trầm tích và chủng đơn
DNA tổng số của mẫu bùn và trầm tích từ các ống MPN đợc tách chiết theo phơng pháp do Zhou và cs, 1996 mô tả với cải biến về nồng độ đệm phosphate (tăng từ 100 mM lên 120 mM) trong đệm tách (gồm:100 mM Tris (pH 8);100 mM EDTA (pH 8); 120 mM Đệm phosphate (Na2HPO4/NaH2PO4); 1,5 M NaCl; 1% CTAB). Trộn 2 ml mẫu làm giàu từ ống MPN với 5,4 ml đệm tách DNA trong ống falcol (chịu dung môi). Phá tế bào bằng phơng pháp sốc nhiệt trong nitơ lỏng và bể ổn nhiệt ở 37oC, lặp lại 5 lần. Bổ sung 40 μl proteinase K (10 mg/ml), lắc ngang với tốc độ 225 vòng/phút trong 30 phút ở 37oC. Thêm 600 μl SDS (20%), ủ ở 65oC trong 2 giờ, 25 phút đảo lộn đầu một lần. Trộn đều kỹ với lợng tơng đơng PCI về thể tích. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Thu lấy phần dịch phía trên sang ống mới, trộn đều kỹ với lợng tơng đơng CI về thể tích. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Thu lấy phần dịch phía trên sang ống mới, bổ sung 0,6 lần thể tích isopropanol, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Ly tâm thu kết tủa DNA ở 12000 vòng/ phút trong 25 phút ở nhiệt độ phòng. Đổ phần dịch ở trên, rửa kết tủa với 10 ml ethanol 80%, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Đổ ethanol, để khô ở nhiệt độ phòng. Hòa tan DNA trong 50 μl nớc MQ đã khử trùng, chuyển DNA sang ống eppendorf 1,5 ml và giữ ở −20oC.
DNA genome của chủng đơn đợc tách theo phơng pháp của Marmur (1961). 1 ml dịch tế bào đợc ly tâm 5000 - 10000 vòng/ phút trong 5 phút, sau đó rửa với 1 ml đệm TE (pH 8) rồi hòa tế bào trong 0,5 ml 5 mM EDTA (pH 8). Thêm 50 μl lysozym (40 mg/ml), trộn đều, ủ trong bể ổn nhiệt ở 37oC trong 1 giờ. Thêm 50 μl SDS (20%) và 50 μl proteinase K (4 mg/ml), trộn đều và ủ trong bể ổn nhiệt ở 55oC trong 1 giờ. Thêm 400 μl PCI, trộn đều trong 1- 3 phút, ly tâm 15000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút. Chuyển lớp dịch trong ở trên sang ống eppendorf mới. Thêm 400
trong ở trên sang ống eppendorf mới. Thêm 1/10 thể tích dung dịch 3M Na-acetate (pH 5,2) và 2 lần thể tích dung dịch 2-propanol (đã để lạnh -20oC), trộn đều và giữ ở -20oC trong vòng 15 phút đến 1 giờ. Ly tâm 15000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút, chắt phần dịch phía trên để thu kết tủa DNA. Rửa DNA trong ethanol 70% (đã để lạnh -20oC) trong 1 phút, ly tâm 15000 vòng/ phút, đổ cồn, làm khô DNA ở nhiệt độ phòng. Hòa tan DNA trong 50 μl MQ vô trùng (hoặc đệm TE) và bảo quản tại −20°C cho các thí nghiệm tiếp theo.
Sản phẩm DNA đợc kiểm tra trên gel agarose 1% trong đệm TAE tại 100V trong thời gian 15 phút. Sau khi điện di, gel agarose đợc nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (5 mg/ml) trong 15 phút, sau đó rửa nớc và chụp ảnh dới tia UV trên máy GelDoc (BioRad).