CI Chloroform-isoamyl alcohol
2.2.5.Phơng pháp điện di biến tính DGGE
Hình 7. Vị trí các mồi trên gen 16S rDNA ở Lactobacillus plantarum. Khuếch đại đoạn gen 16S rDNA (550 bp): Vùng V3 - V5 của gen 16S rDNA với độ dài 550 bp (hình 7) đợc khuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi GM5F (CCT ACG GGA GGC AGC AG) và 907R (CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT) (Muyzer và cs, 1993). “Touch-down” PCR (bảng 5) đợc sử dụng để tăng độ đặc hiệu và giảm sự hình thành các sản phẩm phụ. Để tạo tính ổn định cho việc phân tách các trình tự DNA trên gel điện di biến tính, kẹp GC gồm 40 bp (CGC CCG CCG CGC GCG GCG GCC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G) đợc gắn vào đầu 5’ của mồi GM5F.
Bảng 5. Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR cho DGGE.
Thành phần phản ứng Thể tích
H2O MQ 27 10x Taq buffer 5 BSA (3 mg/ml) 5 MgCl2 (20 mM) 4 dNTP (2,5 mM mỗi loại) 4 Mồi GM5F-GC (50 pmol/μl) 1 Mồi 907R (50 pmol/μl) 1 DNA khuôn 2 Taq polymerase (5 u/μl) 1 Tổng thể tích phản ứng 50
Taq polymerase đợc đa vào phản ứng sau bớc biến tính đầu tiên ở 94○C trong 1 phút khi nhiệt độ đạt 80○C. Nhiệt độ gắn mồi đợc đặt cao hơn 10○C so với nhiệt độ lý thuyết (tức là 65○C). Sau mỗi chu kỳ, nhiệt độ gắn mồi giảm đi 0,5○C cho tới khi đạt tới 55○C, ở nhiệt độ này phản ứng tiến hành thêm 15 chu kỳ. Thời gian kéo dài chuỗi của mồi là 3 phút.
DGGE: Điện di đợc tiến hành trên gel polyacrylamide 6% với dải biến tính urea/formamid từ 30% đến 60%. Quá trình điện di đợc thực hiện bằng bộ điện di DcodeTM System (BioRad) trong đệm TAE, ở nhiệt độ 60°C, tại 200 V, trong 3,5 giờ. Sau khi điện di, gel polyacrylamide đợc nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (5 mg/ml) trong 30 phút, sau đó rửa nớc và chụp ảnh dới tia UV trên máy GelDoc (BioRad).
Thôi gel: Băng điện di đợc cắt, rửa và thôi trong nớc qua đêm tại 4°C. Dịch thôi DNA đợc dùng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR nh chu trình nhiệt của phản ứng PCR cho DGGE (bảng 5) với cặp mồi GM5F (không có kẹp GC) và 907R. Sản phẩm PCR tiếp theo đợc tinh sạch bằng kít và giải trình tự.