Vai trò của vi khuẩn oxy hóa Fe(II) trong quá trình khử nitrate ở Việt Nam

Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate

Những môi trờng này chứa quần xã vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate khoảng 103 - 5ì108 tế bào/g trầm tích tham gia vào chu trình oxy hóa - khử sắt. Vì quá trình oxy hóa Fe(II), khử nitrate không bị giới hạn bởi vùng tiếp xúc. Đáng chú ý là hầu hết các thí nghiệm làm giàu hay nuôi cấy vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate đã tiến hành đều phụ thuộc vào nguồn carbon hữu cơ (nh Na-acetate) (Straub và cs, 1996; Benz và cs, 1998), tức là điều.

Phơng pháp MPN đã cho thấy FOM dị dỡng chiếm 0,8% tổng số vi khuẩn khử nitrate và thờng gặp hơn so với FOM tự dỡng (Straub và cs, 1998). Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tự dỡng mới chỉ đợc biết đến với hai chủng Ferroglobus placidus, là một vi khuẩn cổ a nhiệt (Hafenbradl và cs, 1996) và chủng 2002, là vi khuẩn a ấm thuộc phân lớp β-Proteobacteria (Weber và cs, 2006 b).

Cơ chế phân tử của quá trình oxy hóa Fe(II) và các gen liên quan

Ferrooxidans, theo đó điện tử đợc chuyển rất nhanh từ Fe(II) đến rusticyanin nhờ xúc tác bởi enzyme (iron rusticyanin oxidoreductase). Tuy nhiên vào thời điểm đó các tác giả lại cha xác định đợc vị trí của cytochrome c (chất khử rusticyanin) và cách chuyển điện tử từ Fe(II) đi vào khoảng gian bào (nơi rusticyanin kh trú). Operon này bao gồm các gen mã hóa cho tất cả các protein liên quan đến chuỗi dẫn truyền điện tử từ Fe(II) tới O2 và chúng đợc điều hòa rất nghiên ngặt (Yarzábal và cs, 2004).

Những protein đợc mã hóa từ operon rus sẽ vận chuyển điện tử đến chất nhận điện tử cuối cùng là O2 lần lợt là cytochrome Cyc2, rusticyanin, cytochrome Cyc1, và cytochrome oxidase (aa3) (hình 4). Vị trí của cytochrome Cyc2 trên màng ngoài có liên quan trực tiếp đến quá trình vận chuyển một điện tử từ mỗi Fe(II) vào trong tế bào chứng minh rằng Fe(II) đợc sử dụng nh một nguồn năng lợng của A. Khó khăn trong việc nghiên cứu có thể là do môi trờng sống kỵ khí của những vi khuẩn quyết định hoặc là do trong môi trờng pH trung tính, cơ chất và sản phẩm của quá trình oxy hóa Fe(II) ít hòa tan gây khó khăn trong quá trình nghiên cứu sinh lý cũng nh di truyền hay cơ chế chuyển hóa diễn ra trong tế bào (Straub và cs, 2001).

Các phơng pháp sinh học phân tử hiện đại đợc sử dụng trong các nghiên cứu về tính đa dạng và cấu trúc di truyền của quần xã vi khuẩn

Quá trình này diễn ra khi có mặt các hợp chất hữu cơ làm nguồn điện tử thích hợp để khử nitrate, ví dụ nh lactate, acetate hay methanol là những sản phẩm của quá trình phân giải chất hữu cơ cao phân tử. Từ thực trạng ô nhiễm sắt và nitrate cũng nh ảnh hởng của chúng đến sức khỏe con ngời cùng với vai trò của các vi khuẩn có khả năng làm giảm lợng sắt và nitrate trong môi trờng, những nghiên cứu về tính đa dạng di truyền và tiềm năng ứng dụng của nhóm vi khuẩn này trong các biện pháp xử lý các vùng ô nhiễm sắt và nitrate là việc làm cần thiết. Nghiên cứu này không chỉ bổ sung kiến thức khoa học về một nhóm vi khuẩn có khả năng oxy hóa Fe(II), khử nitrate mà còn đa ra những gợi ý về hớng xử lý các nguồn nớc ô nhiễm kim loại nặng và chất hữu cơ.

Trình tự giàu GC (còn gọi là kẹp GC) có thể đợc gắn vào một trong hai mồi trong phản ứng PCR để ổn định khả năng biến tính của các phân đoạn trên gel polyacrylamide để có thể xác định đ- ợc 100% số trình tự có trong mẫu (Myers và cs, 1985; Sheffield và cs, 1989). FISH là một trong số những phơng pháp cho phép xác định nhóm phân loại của vi khuẩn trong mẫu mà không qua nuôi cấy bằng cách lai với các đầu dò gắn huỳnh quang đặc hiệu cho rRNA và pháp hiện trên kính hiển vi huỳnh quang. Phơng pháp này chủ yếu dựa trên trình tự của hệ tiểu đơn vị 16S rRNA, là trình tự đã đợc rất quan tâm trong nghiên cứu hệ thống phân loại của vi sinh vật (Woese và cs, 1990; Ludwig và Schleifer, 1994).

Nguyên vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên vật liệu

Mẫu chân ruộng và trầm tích ven biển đợc thu thập trong các ống nhựa mica có nút cao su ở hai đầu cho phép khoan sâu tới 60 cm dới bề mặt trầm tích (hình 5). - Hóa chất sử dụng trong phơng pháp quang phổ xác định hàm lợng sắt II, mangan II và nitrate: hydroxylamine hydrochloride, formaldehyde, ammonia, phenanthroline, ammonium acetate, disulfofemic. Biểu hiện dơng tính có thể là sự có mặt của khí trong các ống lên men, độ đục của môi trờng, sự biến đổi màu của môi trờng hay sự thay đổi pH tùy thuộc vào các trờng hợp khác nhau (USDA, 2008; Downes và Ito, 2001).

Môi trờng dịch thể kỵ khí hoàn toàn có thành phần khoáng tơng ứng với nớc ngọt (dùng cho mẫu bùn từ đáy ao và chân ruộng ngập nớc) hoặc nớc lợ (dùng cho mẫu trầm tích ven biển Vân Đồn - Quảng Ninh) (bảng 1). Thí nghiệm MPN đợc tiến hành với dãy pha loãng đến 10- 8 với thể tích 10% bùn đáy hoặc trầm tích trong môi trờng khoáng nớc ngọt hay nớc lợ, thí nghiệm đợc tiến hành với 3 dãy pha loãng, mẫu đợc đảm bảo kỵ khí hoàn toàn và ủ trong tủ ấm tại 28oC trong 8 tuần. Việc phân lập đợc tiến hành theo phơng pháp pha loãng trên dãy ống thạch bán lỏng (1%) với môi trờng có thành phần tơng tự nh môi trờng dùng trong phơng pháp MPN (Widdel và Bak, 1992).

Sau khi điện di, gel agarose đợc nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (5 mg/ml) trong 15 phút, sau đó rửa nớc và chụp ảnh dới tia UV trên máy GelDoc (BioRad). Phân tích đa dạng di truyền các chủng đơn bằng phơng pháp ARDRA ARDRA đợc sử dụng để nghiên cứu mức độ đa dạng về di truyền của vi sinh vật dựa trên phân tích kết quả xử lý gen 16S rDNA bằng enzyme giới hạn (Ravenschlag và cs, 1999). Để tạo tính ổn định cho việc phân tách các trình tự DNA trên gel điện di biến tính, kẹp GC gồm 40 bp (CGC CCG CCG CGC GCG GCG GCC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G) đợc gắn vào.

Sau khi điện di, gel polyacrylamide đợc nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (5 mg/ml) trong 30 phút, sau đó rửa nớc và chụp ảnh dới tia UV trên máy GelDoc (BioRad). Trình tự gen sau đó đợc phân tích, so sánh với trình tự 16S rDNA của các loài có liên quan hiện đã công bố trên Database DDBJ/EMBL/GenBank sử dụng phần mềm BLAST Search. - Để nhuộm đối chứng, nhỏ 50 àl dung dịch DAPI lên mỗi mẫu, giữ 3 phút trong tối, sau đó rửa nhanh trong nớc cất và rửa trong cồn 80% trong vài giây rồi để khô.

Mẫu vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate đợc nuôi cấy trong môi trờng kỵ khí dạng dịch thể chứa Fe(II) (10 mM) và nitrate (5 mM) trong bình serum đậy kín bằng nút cao su. Trong thí nghiệm xác định khả năng oxy hóa Mn(II) của vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate, Mn(II) đợc sử dụng để thay thế Fe(II) làm chất cho điện tử trong môi trờng nuôi cấy. Kết quả của phép đo có thể bị ảnh hởng bởi ion Mn và Cu. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. b) Phơng pháp trắc quang với thuốc thử acid disulfofemic, định lợng nitrate (Lê Đức, 2004). Nguyên lý: Ion NO3− tác dụng với acid disulfofemic tạo thành nitrodisulfofemic, chất này phản ứng với ammonia (NH3) đặc tạo thành phức có màu vàng, xác định đợc ở bớc sóng 410 nm.