CI Chloroform-isoamyl alcohol
3.5.Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate từ các mẫu nghiên cứu
Song song với các phơng pháp phân tích đa dạng và cấu trúc di truyền quần xã vi khuẩn không qua bớc phân lập và nuôi cấy nh phơng pháp PCR-DGGE và FISH đã tiến hành ở phần trên, chúng tôi tiếp tục tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate đại diện với mục đích (i) đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần xã vi sinh vật thông qua phân lập và nuôi cấy; (ii) nghiên cứu chi tiết các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và tìm hiểu khả năng ứng dụng của các chủng đại diện và (iii) xác định vị trí phân loại và định danh khoa học cho các chủng đại diện đó.
Hình 13. Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate đại diện tại các môi tr- ờng nghiên cứu. (A) - Phân lập chủng đơn thông qua phơng pháp ống thạch kỵ khí
bán lỏng; (B) - Nuôi cấy chủng đơn vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate trong môi trờng dịch thể ở điều kiện kỵ khí hoàn toàn.
Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate đợc phân lập theo phơng pháp pha loãng trên dãy ống thạch bán lỏng (1%) đến độ pha loãng 10-8 (Widdel và Bak, 1992) (hình 13A). Các khuẩn lạc đơn đợc phân lập dựa trên sự khác nhau về hình dạng, kích thớc khuẩn lạc. Mỗi khuẩn lạc đợc tách ra và nuôi cấy kỵ khí trong môi trờng dịch thể chứa Fe(II) (10 mM) và nitrate (5 mM) trong bình serum có nút cao su (hình 13B). 12 khuẩn lạc đơn đợc chọn lọc và phân lập từ các ống MPN ở độ pha loãng cao nhất có vi khuẩn phát triển (bảng 8) là đại diện cho vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate chiếm đa số tại ba môi trờng nghiên cứu. Nguồn gốc phân lập, ký hiệu tên chủng và đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 12 chủng đơn đợc trình bày chi tiết ở bảng 8 dới đây.
Bảng 8. Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate phân lập đợc từ các môi trờng nghiên cứu. IN1 - IN12: 12 chủng đơn phân lập đợc từ các mẫu nghiên cứu.
Nguồn phân lập Tên
chủng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
Bùn chân ruộng lúa ngập nớc ở Cổ IN1 Hình tròn, bề mặt nhẵn, kích thớc 1-2 mm IN2 Hình tròn, bề mặt không nhẵn, kích thớc 0,25-0,5 mm IN3 Hình tròn, bề mặt xù xì, kích thớc 0,25-0,5 mm IN4 Hình tròn, bề mặt xù xì, kích thớc 1-2 mm Trầm tích nớc lợ tại biển Vân Đồn, IN5 Hình tròn, bề mặt nhẵn, kích thớc 0,25 mm IN6 Hình bầu dục, bề mặt nhẵn, kích thớc 0,25-0,5 mm IN7 Hình tròn, bề mặt xù xì, kích thớc 0,8 mm
IN8 Hình tròn tia, mật độ tế bào ở ngoài ít hơn phía trong, kích thớc 1-1,5 mm
Bùn đáy ao nớc ngọt ở Cổ Nhuế,
IN9 Hình tròn, bề mặt xù xì, kích thớc 0,5-1 mm IN10 Hình tròn không đều, kích thớc 0,5-1 mm IN11 Hình tròn, bề mặt nhẵn, kích thớc 0,2-0,3 mm IN12 Hình đĩa lồi hai mặt, kích thớc 2-2,5 mm