Xét nghiệm phế cầu (.pneumoniae)

Phế cầu khuẩn (Streptococcus pneumoniae còn được gọi là Diplococcus pneumoniae), là một thành viên phổ biến của hệ vi khuẩn chí vùng hầu họng, nhưng khi gặp điều kiện thuận lợi nó trở thành một tác nhân vi khuẩn gây nên các nhiễm trùng cấp tính nghiêm trọng ở trẻ nhỏ và ở người lớn tuổi.Phế cầu khuẩn có thể gây viêm mũihọng (nasopharyngitis), viêm tai giữa, viêm xoang, nặng hơn là viêm phế quảnphổi, viêm tiểu thuỳ phổi (thường xảy ra ở trẻ em, người lớn > 50 tuổi), viêm phổi thùy (thường xảy ra ở người 3050 tuổi), nhiễm khuẩn huyết dẫn tới viêm màng não, có thể gây viêm nội tâm mạc, viêm ngoại tâm mạc, hoặc gây apxe ở nhiều tổ chức khác trong cơ thể.

K Thu t xột nghi m ph c u (Streptococcus pneumoniae) PGS. TS. Phan Lờ Thanh Hng Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng Mục tiêu: Sau khoá học, học viên hiểu đợc: - Vai trò gây bệnh và những đặc tính của phế cầu - Cách lấy bệnh phẩm, bảo quản và vận chuyển về phòng thí nghiệm để phân lập phế cầu khuẩn. - Phơng pháp nuôi cấy phõn lp ph cu t cỏc loi bnh phm. - Nhng th nghim v tiờu chun nh danh ph cu. 1. Giới thiệu chung Phế cầu khuẩn (Streptococcus pneumoniae còn đợc gọi là Diplococcus pneumoniae), là một thành viên phổ biến của hệ vi khuẩn chí vùng hầu họng, nhng khi gặp điều kiện thuận lợi nó trở thành một tác nhân vi khuẩn gây nên các nhiễm trùng cấp tính nghiêm trọng ở trẻ nhỏ và ở ngời lớn tuổi. Phế cầu khuẩn có thể gây viêm mũi-họng (nasopharyngitis), viêm tai giữa, viêm xoang, nặng hơn là viêm phế quản-phổi, viêm tiểu thuỳ phổi (thờng xảy ra ở trẻ em, ngời lớn > 50 tuổi), viêm phổi thùy (thờng xảy ra ở ngời 30-50 tuổi), nhiễm khuẩn huyết dẫn tới viêm màng não, có thể gây viêm nội tâm mạc, viêm ngoại tâm mạc, hoặc gây apxe ở nhiều tổ chức khác trong cơ thể. Vỏ polysaccarit là cơ sở duy nhất cho sự phân loại và là yếu tố độc lực duy nhất đợc biết. Ngời ta đã nhận biết đợc hơn 90 typ huyết thanh tơng ứng với các cấu trúc vỏ của phế cầu. Vỏ của phế cầu là yếu tố độc lực quan trọng và có tính quyết định trong bệnh sinh. Vỏ ức chế sự thực bào, tạo điều kiện cho vi khuẩn tồn tại, nhân lên trong tổ chức vật chủ và sinh bệnh. Vỏ kích thích tạo kháng thể đặc hiệu loài, có tính bảo vệ vật chủ thông qua việc tăng khả năng thực bào, giết vi khuẩn ngay ở trong tế bào bởi các bạch cầu đa nhân. Phế cầu khuẩn (S. pneumoniae) là loại cầu khuẩn hình ngn nn thờng nối thành đôi hình mắt kính, nên còn thuộc nhóm liên cầu, bắt màu Gram dơng, có vỏ và không di động. ở môi trờng lỏng hay trong các tổ chức bệnh phẩm có thể xếp thành chuỗi ngắn và hãn hữu có thể đứng riêng rẽ một mình (thờng ở trong điều kiện và môi trờng kém dinh dỡng hoặc có nồng độ thấp của ion Mg ++ ). Hầu hết phế cầu khuẩn bắt màu Gram dơng song đôi khi trong quá trình thay đổi nuôi cấy có thể trở thành Gram âm, do vi khuẩn bị tự ly giải hoặc do các hoạt tính bề mặt bị tác động bởi muối mật (sodium deoxycholate hoặc sodium dodecylsulfat). Phế cầu khuẩn phát triển tốt trong các môi trờng lỏng và trên các môi trờng thạch Tryptocasein soy có bổ xung 5% máu (cừu, ngựa, thỏ) đã lấy hết tơ huyết. Trong môi trờng lỏng, phế cầu mọc có khuynh hớng khuyếch tán và lắng cặn khi môi trờng đã ngả sang axit. Không nên dùng máu ngời vì có thể có chất kháng sinh và các chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn.Trên môi trờng thạch máu 5% (cừu, thỏ), khuẩn lạc tròn bóng ớt do vi khuẩn có vỏ, không sắc tố, có khuynh hớng lõm ở giữa vì sự hoạt động của một enzym tự ly giải, đờng kính khuẩn lạc 0,5-1,5mm, xung quanh khuẩn lạc có quầng tan huyết alpha (màu xanh ve do tan huyết không hoàn toàn). Phế cầu phát triển tốt trong khí trờng có 5% CO 2 ở 37 O C, nếu không có tủ ấm CO 2 có thể dùng chuông thuỷ tinh kín và đốt nến, với cách này cũng tạo đợc khí trờng có CO 2 nhng chỉ dới 5% và vi khuẩn vẫn phát triển đợc. Phế cầu có thể tồn tại trong đờm khô vài ngày đến vài tháng, trong môi trờng canh thang có 20% glycerin và ở nhiệt độ âm sâu (-70 0 ) phế cầu tồn tại 1 2 năm, nhng dễ bị diệt bởi các chất sát khuẩn thông th- ờng v nhiệt độ 60 0 C trong 30 phút. Trong thời gian ngắn, nhiệt độ giữ chủng thích hợp l 18 - 30 0 C. 2. Kỹ thuật lấy bệnh phẩm, bảo quản và vận chuyển về phòng thí nghiệm: 2.1. Các loại bệnh phẩm + Bệnh phẩm đờng hô hấp: có thể l đờm, d ch hút tỵ hầu, dịch hút nội khí quản, tăm bông ngoáy tỵ hầu, tăm bông ngoáy họng, . + Bệnh phẩm từ tổ chức bị bệnh: dịch não tủy, máu 2.2. Cách lấy bệnh phẩm: 2.2.1.Chất dịch đờng hô hấp: trong những trờng hợp viêm phổi, viêm phế quản, viêm phế quản phổi + Đờm: nếu là ngời lớn, đờm đợc lấy vào buổi sáng sớm, ho và khạc sâu, đờm đợc giữ ở hộp vô khuẩn rồi chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng vài giờ, có thể giữ ở 4 0 C trong vòng 24 giờ . + Dịch tỵ hầu (mũi-họng): Lấy bằng tăm bông: nếu bệnh nhân không khạc đợc hoặc là trẻ nhỏ, dùng tăm bông cán thép mảnh mềm lấy chất dịch ở ngã ba mũi - họng theo đờng mũi (dịch tỵ hầu): đa tăm bông vào sâu bằng một nửa khoảng cách tính từ cánh mũi đến dái tai cùng phía, vê nhẹ rồi rút ra. Chú ý, nếu cha vào đủ độ sâu đã có vật cản không đợc cố lấy mà phải làm lại ở mũi bên kia. Tăm bông phải đảm bảo không dễ bị tụt đầu bông vào khí quản và cán làm bằng kim loại mềm không gỉ không dễ gẫy khi thực hiện thao tác. Lấy bằng máy hút chân không nhẹ: cách này thay thế cho cách ngoáy tỵ hầu ở trên. Dùng ống thông plastic nhỏ mềm đa sâu qua lỗ mũi một khoảng cách bằng khoảng cách từ đỉnh mũi đến ống tai ngoài của bệnh nhân để hút dịch. + Tăm bông ngoáy họng: đè lỡi, dùng tăm bông vô khuẩn đã đợc làm ẩm bằng nớc muối sinh lý (vô khuẩn) chà sát 2 hốc amidan, thành sau họng (sau lỡi gà). Tránh không đợc chạm vào lỡi, răng, mặt trong má và lỡi gà. Sau đó phải cắm tăm bông vào môi trờng vận chuyển (T-I) nu cha cy ngay hoặc nếu phải vận chuyển 2.2.2.Dịch não tuỷ: trong trờng hợp nghi viêm màng não, dùng kim chọc tủy sống vô khuẩn lấy ít nhất 1 ml nớc não tủy, đựng trong ống nghiệm đã tiệt trùng. 2.2.3.Máu: trong trờng hợp bệnh nhân có sốt cao, nghi viêm màng não, viêm phổi cấp, dùng bơm kim tiêm vô khuẩn lấy ít nhất 3ml máu tĩnh mạch (trẻ nhỏ), 5ml đến 10ml (ngời lớn) cho ngay vào bình canh thang não-tim (brain-heart infusion) hoặc trypticase soy có bổ xung máu động vật 5%, chất chống hình thành áo máu 0,025% SPS (sodium polyanethole sulfonate) và có thể thêm chất hấp phụ kháng sinh resins, đợc pha theo tỷ lệ 1 phần máu 10 phần canh thang, hoặc sử dụng chai cấy máu do các hãng thơng mại pha chế sẵn. Việc pha loãng máu trong canh thang nuôi cấy theo tỷ lệ 1/10 cũng đã có tác dụng làm giảm các chất ức chế vi khuẩn hoặc kháng sinh có trong máu bệnh nhân. Chú ý: động tác và quá trình lấy máu, cấy máu phải đảm bảo thật vô khuẩn trong một quy trình kín. Tốt nhất, kim lấy máu đợc nối trực tiếp vào bình môi trờng qua một ống cao su hay plastic vô khuẩn. sát trùng vị trí lấy máu bằng cồn iốt. 2.2.4. Các bệnh phẩm khác: mủ amiđan, mủ tai giữa, dịch chọc phổi, chọc hút và đựng trong các ống nghiệm vô khuẩn 2.3. Vận chuyển và bảo quản Phế cầu cũng là một vi khuẩn nhạy cảm và dễ chết ở ngoại cảnh, vì vậy tốt nhất các bệnh phẩm nên đợc chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 2 giờ, hoặc không quá 6 giờ và có thể giữ ở nhiệt độ 4-8 0 C nhng không quá 24h. Nếu quá trình luân chuyển từ 2- 4 giờ bệnh phẩm có thể đợc cấy ngay hoặc tăng sinh trớc trong canh thang (tryptocasein soy hoặc hỗn hợp não tim BHI có 5% máu) 2 giờ ở 37 0 C, nếu thời gian chuyển bệnh phẩm từ 4-8 giờ bệnh phẩm nên đợc ủ trong canh thang ít nhất là 2 giờ rồi mới cấy ra thạch máu 5%. Chú ý: bệnh phẩm đợc lấy bằng tăm bông, nếu có điều kiện nuôi cấy ngay, bệnh phẩm chỉ cần giữ trong nớc muối sinh lý. Nếu không có điều kiện cấy ngay, bệnh phẩm phải đợc giữ trong môi trờng bảo quản 3. Kỹ thuật xác định phế cầu trong phòng thí nghiệm: 3.1. Nguyên vật liệu và trang thiết bị: 3.1.1. Môi trờng và sinh phẩm cho nuôi cấy phân lập: + Thạch máu cừu hoặc thỏ 5%: mua sẵn hoặc tự pha chế (phụ lục) + Thạch máu thỏ tơi 7%: tự pha chế (không có trên thị trờng thơng mại) +Canh thang giàu dinh dỡng: canh thang Trypticase soy hoặc Brain-Heart Infusion (BHI) có 5% Fildes Enrichment (BD BBL Co.,) hoặc có 5% máu động vật. + Khoanh giấy Optochin (Bio-Rad) + Muối mật (deoxycholate) + Nớc muối sinh lý (NaCl 0,85%) + Dung dịch Acetein (N-acetyl- L- cystine), để xử lý bệnh phẩm đờm + Bộ nhuộm Gram + Cồn 70 0 3.1.2. Dụng cụ và trang thiết bị cho nuôi cấy phân lập + Que cấy dung tích 1l và 10l + Các loại ống nghiệm thủy tinh 15 20ml + ống nghiệm nhựa (cryotube và eppendorf bảo quản mẫu và ly tâm) + Giá để ống nghiệm + ống hút nhựa 1ml (có quả bóp) dùng một lần + Lam kính và lamen + Đèn cồn + Kính hiển vi + Máy Vortex (máy trộn) + Máy ly tâm thờng (4000 10.000 vòng) + Tủ ấm CO2 hoặc tủ ấm thờng + bình kín (để đốt đợc nến) 3. 2. Xét nghiệm trực tiếp: 3.2.1. Nhuộm Gram: nói chung, theo phơng pháp thông thờng, xét nghiệm trực tiếp các bệnh phẩm từ họng, mũi thờng ít giá trị trong việc xác định căn nguyên gây bệnh vì lẫn nhiều loại vi khuẩn và cũng có thể đó chỉ là vi khuẩn chí (sng cng sinh), chỉ các tiêu bản của các bệnh phẩm là máu, dịch não tủy hay các dịch cơ thể có bản chất là vô trùng mới có giá trị trong chẩn đoán căn nguyên phế cầu. Nhuộm Gram tiêu bản đờm có giá trị xác định căn nguyên phế cầu khi số lợng bạch cầu đa nhân tăng lên (nếu trên 25 bạch cầu đa nhân và dới 25 tế bào biểu mô trên tổng số 100 tế bào ở vi trờng) và thấy có vi khuẩn phế cầu (hình lỡi mác hay ngọn nến thờng nối đôi, cũng có thể đứng đơn lẻ, bắt màu Gram dơng) ở bên trong hoặc cả bên ngoài tế bào bạch cầu thì có thể định hớng chẩn đoán phế cầu là tác nhân gây viêm đờng hô hấp. Phế cầu bắt màu Gram dơng nhng tính chất này có thể bị mất do bệnh phẩm để quá lâu, hoặc môi trờng không đủ chất dinh dỡng hay bệnh nhân đã dùng nhiều kháng sinh. Nếu là đờm nên dàn tiêu bản nhuộm soi trớc khi xử lý đờm với hóa chất làm lỏng đờm để nuôi cấy. Ph ơng pháp nhuộm Gram a/ Chuẩn bị thuốc nhuộm: + Thuốc nhuộm tím gentian: Tím gentian, dung dịch bão hòa trong cồn 95 o : 10 ml Axit phenic 1 ml Nớc cất 100 ml Lắc đều lọc qua giấy. + Dung dịch lugol: Iod 1 g Kali Iodua 2 g Nớc 5 ml Nghiền tan trong cối, rồi thêm nớc cho đủ 200 ml + Thuốc nhuộm Fucsin kiềm: Fucsin kiềm, dung dịch bão hòa trong cồn 95 o C: 10 ml Axit phenic: 5 ml Nớc cất 100 ml Lắc đều, lọc qua giấy. b/ Cách nhuộm: - Dàn tiêu bản, để khô tự nhiên. Cố định tiêu bản trên phiến kính bằng cách hơ cao trên ngọn lửa đèn cồn, kiểm tra độ nóng (nhẹ vừa phải trên mu bàn tay). Chú ý: nóng quá, hoặc hơ lâu, vi khuẩn sẽ biến dạng - Đổ thuốc nhuộm tím gentian lên trong 1 phút, rửa nớc - Đổ dung dịch lugol lên trong 1 phút, hất bỏ đi. - Tẩy màu bằng cồn 90 o tới khi bạc màu - Rửa qua nớc - Đổ thuốc nhuộm Fucsin lên trong 1 phút - Rửa qua nớc - Thấm giấy hoặc để khô ở không khí c/ Đọc kết quả: Vi khuẩn Gram dơng: màu tím (tím gentian) Vi khuẩn Gram âm: màu đỏ (đỏ Fucsin) Các vi khuẩn thuộc loại Gram dơng có chất protein kiểu magic ribonucleat. Chất này khi gặp những thuốc màu thuộc loại pararosanilin (nh tím getian chẳng hạn) và chất iod kết lại thành một hợp chất không bị phá hủy bởi cồn. Do đấy, khi dùng cồn để tẩy màu, những vi khuẩn Gram dơng không bị ảnh hởng. 3.2.2. Thử nghiệm "Quellung": phản ứng Quellung dơng tính xảy ra khi kháng thể đặc hiệu loài (type-specific antiserum) gắn với thành phần polysaccarit của vỏ phế cầu, gây nên sự thay đổi chỉ số khúc xạ của vỏ khi ánh sáng chiếu vào mà ta nhìn thấy dễ dàng dới dạng "phình vỏ". Hình ảnh quan sát thấy là: tế bào vi khuẩn bắt màu xanh đen, xung quanh tế bào có một quầng với đờng viền sắc nét, đó là gờ ngoài của vỏ (do ánh sáng xuyên qua vỏ sáng hơn vùng tế bào phế cầu). Các vi khuẩn hoặc ở dạng đơn, nối đôi, hoặc chuỗi ngắn đều có thể có phản ứng Quellung. Bằng thử nghiệm này, phế cầu khuẩn có thể đợc xác định trực tiếp từ các dịch cơ thể (dịch não tuỷ, dịch phúc mạc, dịch hút nội khí quản hoặc đờm) hay từ 1 khuẩn lạc đơn. Kỹ thuật đợc thực hiện nh sau: đặt một giọt nhỏ (10l) hay 1 ăng (1-2mm) dịch cơ thể, canh thang nuôi cấy hay huyền dịch vi khuẩn (khuẩn lạc của nuôi cấy 16-24 giờ ở 35-37 0 C/5%C02, pha trong nớc muối sinh lý tạo độ đục tơng đơng 0,5 Mc Farland) lên phiến kính sạch. Nhỏ tiếp 1 giọt (khoảng 10l) hay 1 ăng đầy (10l) kháng huyết thanh, trộn kỹ. Nhỏ tiếp 1 ăng đầy (10l) dung dịch xanh methylene bão hoà, trộn kỹ. Phủ lamen lên hỗn hợp trên, sau 10 phút, quan sát hiện tợng phình vỏ của phế cầu bởi tác động của kháng huyết thanh đặc hiệu bằng kính hiển vi với vật kính dầu. Chú ý: phản ứng chỉ xảy ra khi có sự tơng quan về lợng giữa kháng nguyên (vi khuẩn) và kháng thể (kháng huyết thanh), do đó để tránh âm tính giả do d thừa kháng nguyên, nên chuẩn bị các phiến kính sao cho mỗi một vi trờng chỉ chứa từ 50-100 tế bào, lợng tế bào tối u nhất để quan sát là 25-50 tế bào vi khuẩn trong một vi trờng. Trong thử nghiệm Quellung, phế cầu khuẩn đợc xác định với một bộ kháng huyết thanh. Kháng huyết thanh có thể là một tập hợp của 90 loại kháng thể đặc hiệu tơng ứng với 90 loại phế cầu khuẩn có cấu trúc vỏ khác nhau (omniserum) còn gọi là kháng huyết thanh đa giá, hoặc tập hợp của một số kháng thể đặc hiệu loài hay nhóm và trong mỗi tập hợp có 4-7 loại kháng huyết thanh đơn giá (58 loại trong tổng số 90 thuộc về 20 nhóm kháng huyết thanh mà mỗi nhóm bao gồm từ 2-4 loại). Hiện nay ngời ta đã biết rõ 46 loại hay nhóm phế cầu khuẩn khác nhau và hơn 90% các chủng phế cầu phân lập đợc từ máu hay dịch não tuỷ đều thuộc về 1 trong 23 loại hay nhóm phế cầu khác nhau mà đã đợc chọn để sản xuất vắc xin phòng bệnh do phế cầu. Do vậy, tại một số phòng thí nghiệm ngời ta thờng dùng 12 nhóm kháng huyết thanh (12 pooled sera) để xác định loại hay nhóm các chủng phế cầu phân lập đợc từ máu và dịch não tuỷ. Khi xác định typ huyết thanh hay thực hiện thử nghiệm Quellung nên tuân theo hớng dẫn của Hãng sản xuất và theo mục đích dịch tễ học để chọn kháng huyết thanh. Có thể có mặt các kháng thể gây phản ứng chéo trong omniserum nên phải có sự kiểm tra hình thái học của khuẩn lạc và vi khuẩn cũng nh tính bắt màu Gram của các chủng đợc thử nghiệm. 3.3. Nuôi cấy phân lập: 3.3.1 Qy trình phân lập: tùy theo từng loại bệnh phẩm để có các cách xử lý và nuôi cấy phù hợp. + Bệnh phẩm đờng hô hấp: nếu đặc cần làm lỏng đờm hoặc dịch đ- ờng hô hấp bằng dung dịch Acetein (N-acetyl-L-cysteine) ở tỷ lệ đờm/dung dịch = 5/1 và dùng máy khuấy vortex làm lỏng đờm trớc khi nuôi cấy. Sau đó, nên pha loãng tiếp bệnh phẩm ít nhất 10 lần trong nớc muối sinh lý trớc khi nuôi cấy. Hiệu quả nhất trong phân lập vi khuẩn gây bệnh đờng hô hấp nếu ta sử dụng phơng pháp cấy đếm đối với các mẫu bệnh phẩm đờng hô hấp để phát hiện và phân biệt các vi khuẩn gây bệnh nói chung và phế cầu khuẩn nói riêng với các thành phần vi khuẩn chí ở đờng hô hấp. + Dịch não tủy: nên cấy song song vào thạch máu 5% (Tryptocasein soy hoặc thạch não tim BHI có bổ xung 5% máu đã lấy hết sợi tơ huyết) và vào canh thang tăng sinh (bổ sung 5% máu thỏ hay cừu) ủ 37 0 C/5% C02/16-24h. Trong trờng hợp đĩa thạch máu cấy trực tiếp bệnh phẩm âm tính, phải cấy chuyển từ canh thang tăng sinh ra thạch máu ở các ngày thứ 2,3 và 7. Để có thể phân lập đợc cả loại vi khuẩn khó tính nh H. influenzae, có thể cấy bệnh phẩm lên thạch sôcôla hoặc sử dụng thạch máu thỏ tơi 7% (ngoài phế cầu khuẩn và một số loại vi khuẩn khác, thạch máu thỏ tơi 7% có khả năng phân lập đợc cả H. influenzae) + Máu: trong trờng hợp có sốt hoặc nghi nhiễm khuẩn huyết, cấy máu theo một chu trình kín vô khuẩn. Tuỳ theo bệnh nhân là trẻ nhỏ hay ngời lớn, lấy từ 3-10ml máu tĩnh mạch cấy vào bình canh thang não-tim (brain-heart infusion) hoặc trypticase soy có bổ xung máu động vật 5%, chất chống hình thành áo máu 0,025% SPS (sodium polyanethole sulfonate) và có thể thêm chất resins (có tác dụng hấp phụ các chất diệt khuẩn hay kháng sinh có trong máu bệnh nhân) theo tỷ lệ 1 phần máu 10 phần canh thang, sau đó ủ ở 37 0 C/5% C02/16-24 giờ, nếu dơng tính cấy chuyển sang các môi trờng thạch (thạch máu động vật 5%, hoặc 7%). Một số môi trờng nuôi cấy phát hiện phế cầu khuẩn: - Thạch máu 5% có Gentamycin [5mcg/ml]: chỉ cho phế cầu phát triển. - Thạch máu 5% không có Gentamycin: tìm phế cầu, liên cầu, tụ cầu và một số trực khuẩn Gram âm - Thạch máu thỏ 7% phát hiện cả phế cầu và H. influenzae Cỏc mụi trng nuụi cy tỡm ph cu c ấm trong khí trờng 37 0 C/5% C0 2 từ 16 - 24 giờ. Nếu không có tủ ấm CO2, đặt các hộp lồng vào chuông thủy tinh kín và đốt 1 ngọn nến, khi nến tắt cũng tạo đợc khí trờng có CO2, sau đó đặt chuông vào tủ ấm 37 0 C, tuy nhiờn ph cu cng cú th phỏt trin trong iu kin khụng cú CO 2 . Sau 16-24 giờ, quan sát trên môi trờng thạch máu thấy các khuẩn lạc của phế cầu khuẩn có vỏ: tròn, dẹt, nhỏ (0,5-1,5mm), không màu, có xu hớng lõm giữa, xung quanh khuẩn lạc có quầng tan huyết màu xanh (kiểu tan huyết alpha). Nếu quan sát khuẩn lạc ở thời gian sớm hơn ( 14h) có thể thấy khuẩn lạc cha bị lõm giữa mà lại có đỉnh (là đặc điểm để phân biệt giữa phế cầu có vỏ và không có vỏ). Lấy một khuẩn lạc cấy thuần lại trên một đĩa thạch máu khác, ủ ấm 37 0 C/5% CO2/16 giờ, ngày tiếp theo làm thêm các thử nghiệm sau để khẳng định (nếu chỉ thấy thuần một loại khuẩn lạc thì không cần cấy thuần mà có thể làm luôn các bớc khẳng định). 3.3.2. Các thử nghiệm xác định: Thử nghiệm Optochin (nhạy cảm với optochin): Cấy dày lên một đĩa thạch máu 5% vi khuẩn nghi ngờ là phế cầu, sau đó đặt khoanh giấy optochin d = 6mm (chứa 5àg (mcg) chất ethylhydrocupreine) lên, ủ 35-37 O C/5% CO 2, Sau 16-24 giờ nếu xung quanh khoanh giấy không có vòng vô khuẩn có nghĩa đó chỉ là viridans streptococci, nếu có vòng vô khuẩn có đờng kính 14mm là dơng tính (là phế cầu), nếu vòng vô khuẩn từ 9-13mm phải làm thêm thử nghiệm tan trong muối mật. Thử nghiệm tan trong muối mật (Bile solubility): 1/ Từ nuôi cấy thuần và mới (16-24 giờ), tạo 0,5 ml canh khuẩn trong n- ớc muối sinh lý tơng đơng độ đục > 0,5 Mc Farland. 2/ Chia đôi canh khuẩn vào 2 ống nghiệm (0,25ml/1 ống), sau đó cho tiếp vào 1 ống canh khuẩn 0,25ml NaCl 0,9%, ống kia cho 0,25ml muối mật 10% (deoxycholate), lắc nhẹ, ủ 35-37 0 C/ 2 giờ. 3/ Theo dõi sự ly giải tế bào vi khuẩn trong ống có muối mật sau 2 4 giờ ủ, nếu ống có muối mật trở nên trong, hết đục là dơng tính. Nếu thực hiện trực tiếp thử nghiệm tan trong muối mật với khuẩn lạc nghi ngờ ở trên thạch máu, phải sử dụng dung dịch sodium deoxycholate 2-10%, đọc kết quả sau 15-20 phút nếu là phế cầu khuẩn, khuẩn lạc sẽ biến mất hoặc dẹt hẳn xuống do bị ly giải, trong khi khuẩn lạc khác thuộc nhóm liên cầu nhng không phải phế cầu không bị muối mật tác động. Thử nghiệm ng ng kết trên phiến kính: Dựa trên nguyên lý của phản ứng kết hợp kháng nguyên vỏ của phế cầu với kháng thể đặc hiệu tơng ứng tạo sự ngng kết. Trên thị trờng thơng mại các sinh phẩm sử dụng cho thử nghiệm ngng kết trên phiến kính luôn có sẵn, giúp cho việc xác định các khuẩn lạc nghi ngờ có phải là phế cầu hay không. Ví dụ, bộ kit Slidex Pneumo của Vitek Systems Inc. hay Pneumoslide của BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD. Phải thực hiện theo đúng hớng dẫn của Nhà sản xuất. 3.3.3. Xác định typ huyết thanh: Hiện nay đã xác định đợc 90 typ huyết thanh của các chủng phế cầu có vỏ gây bệnh. Ngời ta đã xếp thành 9 nhóm kháng huyết thanh đa giá, đợc ghi theo thứ tự bằng chữ cái in hoa từ A đến I, mỗi nhóm có từ 4-7 kháng huyết thanh đơn giá đặc hiệu. + Thử nghiệm Quellung (nh trên): xác định đợc typ huyết thanh của phế cầu (theo nhóm, hoặc theo typ đơn). + Ph ơng pháp định typ huyết thanh: qua các bớc sau [...]... thị kính X10 và vật kính X 40, điều chỉnh ánh sáng để thấy rõ hiện tợng "phình" của vỏ phế cầu bởi phản ứng với kháng huyết thanh Khi đã có dơng tính với kháng huyết thanh đa giá, thử lần lợt với các kháng huyết thanh đơn giá trong nhóm để xác định typ huyết thanh của chủng phế cầu đợc thử 4 Tiêu chuẩn xác định phế cầu: + Hình thể khuẩn lạc trên môi trờng thạch máu 5% (có hay không có gentamycin): tròn,... xỏc nh ph cu? Kế hoạch bài giảng TT Nội dung 1 2 Thời gian (phút) Giới thiệu về 60 vi sinh vật (phế cầu) và nội dung thực tập Cách lấy 60 mẫu bệnh phẩm, bảo quản và vận chuyển 3 Giới thiệu 60 nội dung thực tập đã đợc chuẩn bị sẵn dạng giáo cụ trực quan (về phế cầu) 4 Nuôi cấy, 120 phân lập vi khuẩn phế cầu từ bệnh phẩm hô hấp và dịch não tủy PP giảng Powerpoin t Vật liệu giảng dạy Máy tính, hoặc bảng,... bị môi trờng nuôi cấy, phân lập phế cầu khuẩn: 1.1 Môi trờng thạch máu 5%: TSA + 5% máu (cừu, ngựa, thỏ) Thạch máu 5% là môi trờng cơ bản đợc dùng để nuôi cấy cũng nh xác định các tính chất của phế cầu (thử nghiệm optochin) Tiêu chuẩn chất lợng: Thạch máu 5% phải đảm bảo có màu đỏ tơi, nếu có màu đỏ đen (do cho máu vào khi thạch còn quá nóng) hoặc loãng (do tỷ lệ hồng cầu trong máu thấp), nên loại bỏ... Hiền Anh Tiêu bản Câu 3 nhuộm Gram, các loại đĩa môi trờng có khuẩn lạc, các thử nghiệm định danh *Hớng dẫn Các loại Câu 2,3 thực hành sinh *Phân tích phẩm, kết quả dụng cụ *Giải đáp tiêu hao thắc mắc PGS TS Phan Lê Thanh Hơng Ths Nguyễn T Hiền Anh Tài liệu tham khảo: 1 Hoàng Thủy Long (1991) Phế cầu khuẩn Kỹ thuật Xét nghiệm Vi sinh vật Y học Nhà XBVH, 54-59 2 Keizo Matsumoto and Tsuyoshi Nagatake... thuần Thạch máu 5% Nhuộm Gram xem hinh thể vi khuẩn Thử nghiệm optochin (+): d 14mm (): 9 < d < 13mm Tan trong muối mật 10% (khi 9 . Health Organization (1999). Identification of Streptococcus pneumoniae. Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by N. meningitidis, S. pneumoniae and H. influenzae. 27-30. Phụ lục 1 hay không. Ví dụ, bộ kit Slidex Pneumo của Vitek Systems Inc. hay Pneumoslide của BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD. Phải thực hiện theo đúng hớng dẫn của Nhà s n xuất. 3.3.3. Xác định. XBVH, 54-59. 2. Keizo Matsumoto and Tsuyoshi Nagatake (1994). Identification of Streptococcus pneumoniae. Clinical Microbiology of Respiratory Infections. Nagasaki University, 31-32 3. World Health