xác định con đường tín hiệu protein kinase hoạt hóa phân bào (mapk) trong ung thư biểu mô tuyến giáp

Nhiều nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, thông tin tín hiệu được tiếp nhận qua thụ thể yếu tố phát triển biểu mô EGFR và protein tương tác với heparan sulfate HIP được truyền qua con đ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

PHAN THỊ MINH PHƯƠNG

XÁC ĐỊNH CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU PROTEIN

KINASE HOẠT HÓA PHÂN BÀO (MAPK)

TRONG UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN GIÁP

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Chuyên ngành: Miễn Dịch

Mã số: 62.72.04.20

HÀ NỘI – 2010

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng, biểu đồ

Danh mục các hình vẽ, ảnh

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về ung thư biểu mô tuyến giáp 4

1.2 Các con đường tín hiệu và quá trình phát sinh, phát triển ung thư 8

1.3 Protein tương tác với Heparansulfate (Heparan Sulfate Interacting Protein: HIP) và vai trò của HIP trong ung thư 23

1.4 Thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (Epidermal Growth Factor Receptor: EGFR) và vai trò của EGFR trong ung thư 31

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 Đối tượng nghiên cứu 35

2.2 Phương pháp nghiên cứu 36

2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 51

2.4 Quản lý thông tin, phân tích dữ liệu 52

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53

3.1 Kết quả tách chiết và độ tinh sạch RNA 53

3.2 Kết quả nghiên cứu sự tham gia của HIP trong ung thư biểu mô tuyến giáp 54

3.3 Kết quả nghiên cứu sự tham gia của EGFR trong ung thư biểu mô tuyến giáp 67

3.5 Kết quả sự hiện diện của các Protein ERK1 và ERK2 trên tế bào ung thư biểu mô nuôi cấy 75

Chương 4 BÀN LUẬN 79

4.1 Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA 79 4.2 Vai trò của Heparansulfate Interacting Protein (HIP) trong ung thư biểu mô tuyến giáp 80 4.3 Vai trò của EGFR trong ung thư biểu mô tuyến giáp 92 4.4 Tương quan giữa HIP và EGFR trong mô ung thư biểu mô tuyến giáp 104 4.5 Sự biểu lộ của các Protein ERK1 và ERK2 trên tế bào ung thư biểu

mô nuôi cấy 106

KẾT LUẬN 110 KIẾN NGHỊ 111 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 3.1 Độ tinh sạch và nồng độ của RNA tách chiết trên mẫu

nghiên cứu 54

Bảng 3.2 Mức độ sao chép của HIP ở mô bướu giáp keo và mô UTBM tuyến giáp 56

Bảng 3.3 Mức độ sao chép của HIP và kích thước u 60

Bảng 3.4 Mức độ sao chép của HIP và tình trạng di căn hạch 60

Bảng 3.5: So sánh mức độ sao chép của HIP theo giai đoạn ung thư 61

Bảng 3.6 Kết quả tách chiết protein và nồng độ protein 62

Bảng 3.7 Kết quả Western blot mức độ biểu lộ HIP 65

Bảng 3.8 Mức độ sao chép của EGFR ở mô bướu giáp keo và mô UTBM tuyến giáp 69

Bảng 3.9 Mức độ sao chép của EGFR và kích thước u 71

Bảng 3.10 So sánh mức độ sao chép của EGFR và tình trạng di căn hạch 72

Bảng 3.11 So sánh mức độ sao chép của EGFR theo giai đoạn ung thư 73

Biểu đồ 3.1: So sánh sự sao chép của HIP ở mô bướu giáp keo và mô ung thư tuyến giáp 57

Biểu đồ 3.2 So sánh mức độ sao chép của HIP ở mô bướu giáp keo và mô ung thư biểu mô tuyến giáp bằng RT-PCR định lượng 59

Biểu đồ 3.3 Mức độ biểu lộ HIP ở mô bướu giáp và mô ung thư theo loại mô học 65

Biểu đồ 3.4 Tương quan giữa mức độ sao chép và mức độ biểu lộ của HIP 66

Biểu đồ 3.5 So sánh sự sao chép của EGFR ở mô bướu giáp keo và mô ung thư tuyến giáp 70

Biểu đồ 3.6 Tương quan giữa HIP và EGFR trên mô ung thư biểu mô tuyến giáp nghiên cứu 74

Hình 1.1 Tuyến giáp và cấu trúc nang giáp 4

Hình 1.2 Con đường tín hiệu MAPK 13

Hình 1.3 Cấu trúc mô phỏng các vùng chức năng của HIP 25

Hình 1.4 Hoạt hóa EGFR bởi EGF 31

Hình 1.5 Con đường tín hiệu MAPK hoạt hoá bởi EGF 33

Hình 2.1 Quy trình tách chiết RNA từ mô tươi 38

Hình 2.2 Hình ảnh minh họa phương pháp Western blot 47

Hình 2.3 Sơ đồ phương pháp hoá mô miễn dịch với phức hợp Avidin-Biotin 49

Ảnh 3.1 Hình ảnh điện di kiểm tra RNA tách chiết từ mô tuyến giáp trên gel agarose 0,8%, điện thế 100V trong 10 phút 53

Ảnh 3.2 Kết quả phản ứng RT-PCR của gen HIP và GAPDH trên mô bướu giáp keo và mô ung thư biểu mô tuyến giáp 55

Ảnh 3.3 Kết quả phản ứng RT-PCR của gen HIP và GAPDH trên mô bướu giáp keo và mô ung thư 55

Ảnh 3.4 Kết quả RT-PCR định lượng đánh giá mức độ sao chép HIP ở mô bướu giáp keo và mô UTBM tuyến giáp sử dụng kỹ thuật điện di mao quản 58

Ảnh 3.5 Kết quả sao chép mRNA của HIP theo giai đoạn ung thư 61

Ảnh 3.6 Hình ảnh nhuộm Coomasie blue sau điện di SDS-PAGE protein tổng số tách chiết từ mô ung thư và bướu giáp keo 63

Ảnh 3.7 Kết quả Western blot đánh giá mức độ biểu lộ HIP ở mô ung thư và bướu giáp keo lành tính 64

Ảnh 3.8 Kết quả Western blot đánh giá mức độ biểu lộ HIP ở mô ung thư và mô bướu giáp keo lành tính 64

mô bướu giáp keo và mô ung thư biểu mô tuyến giáp 67 Ảnh 3.10 Kết quả phản ứng RT - PCR của gen EGFR và GAPDH trên

mô bướu giáp keo và mô ung thư biểu mô tuyến giáp 68 Ảnh 3.11 Kết quả phản ứng RT - PCR của gen EGFR và GAPDH trên

mô bướu giáp keo và mô UTBM tuyến giáp 68 Ảnh 3.12 Tế bào ung thư biểu mô nuôi cấy trong môi trường FBS sau 24h 75 Ảnh 3.13 Tế bào ung thư biểu mô nuôi cấy trong môi trường FBS 76 Ảnh 3.14 Nhuộm Coomasie blue sau điện di SDS-PAGE protein tổng

số tách chiết từ tế bào nuôi cấy 77 Ảnh 3.15 Kết quả Western blot xác định sự biểu lộ hai protein ERK1 và

ERK2 ở dòng tế bào ung thư biểu mô nuôi cấy 77 Ảnh 4.1 Hình ảnh các loại mô học của khối u tuyến giáp……… 99

bFGF Basic Fibroblast Growth Factor

(yếu tố phát triển nguyên bào sợi kiềm tính)

(ADN bæ sung)

(thô thÓ cña yÕu tè ph¸t triÓn biÓu m«)

(Kinase ®−îc ®iÒu hßa bëi tÝn hiÖu ngo¹i bµo)

(protein tương tác với Heparansulfate)

(Protein kinase ho¹t hãa ph©n bµo)

(Kinase cña protein kinase ho¹t hãa ph©n bµo)

(Phản ứng khuếch đại chuỗi)

(ung thư biểu mô tuyến giáp thể nhú)

(Phản ứng khuếch đại chuỗi với enzyme sao chép ngược)

(yÕu tè ph¸t triÓn chuyển dạng)

Chính vì thế, việc nghiên cứu tìm hiểu cơ chế bệnh sinh ung thư để từ

đó tìm ra phương pháp điều trị can thiệp là mối quan tâm hàng đầu của các nhà Y-Sinh học hiện nay Trong khuynh hướng nghiên cứu về cơ chế bệnh sinh ung thư nói chung và ung thư tuyến giáp nói riêng, các nhà khoa học

đi theo hai hướng tiếp cận chính: i) nghiên cứu về di truyền phân tử tế bào

nhằm tìm ra các gen gây ung thư hay các thương tổn của hệ di truyền tế

bào do các tác nhân tại chỗ hay các tác nhân bên ngoài; ii) nghiên cứu về

protein trong đó các protein màng là mục tiêu chính Các protein màng đóng vai trò quan trọng trong việc tiếp nhận, dẫn truyền tín hiệu tế bào-tế bào hay khoảng gian bào-tế bào Các kênh tín hiệu này có chức năng quan trọng trong quá trình trưởng thành, phát triển, biệt hóa và di truyền của tế bào Cho đến nay rất nhiều protein thuộc loại này tương ứng với nhiều kênh dẫn truyền tín hiệu khác nhau đã được phát hiện, trong đó có: thụ thể

của yếu tố phát triển biểu mô (EGFR) và protein tương tác với heparan sulfate (HIP) Sự thể hiện của các protein này phản ánh chặt chẽ tình trạng hoạt động của tế bào

Các thụ thể trên bề mặt màng tế bào có vai trò tiếp nhận các tín hiệu điều hoà tăng sinh, biệt hóa tế bào từ các yếu tố có trong khoảng gian bào như EGF, trophin, cytokin, hormon… Tùy theo bản chất tín hiệu đến tế bào mà chúng có thể được dẫn truyền theo nhiều kênh dẫn truyền khác nhau như: Hedgehog; Wnt; PI3K; MAPK (mitogen activated protein kinase) Nhiều

nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, thông tin tín hiệu được tiếp nhận qua thụ

thể yếu tố phát triển biểu mô (EGFR) và protein tương tác với heparan sulfate

(HIP) được truyền qua con đường tín hiệu của MAPK mà dạng nguyên mẫu

của nó là các protein ERK1 và ERK2 [27], [144] Tín hiệu này sau đó được chuyển vào nhân tế bào, qua một loạt các phản ứng dây chuyền để tác động lên quá trình sao chép DNA và qua đó tham gia điều hoà sự tăng sinh và biệt hóa tế bào Nhiều đột biến của các yếu tố tín hiệu dọc theo con đường MAPK

đã được phát hiện trong ung thư biểu mô tuyến giáp Vì vậy ung thư biểu mô tuyến giáp là mô hình phù hợp cho việc thiết kế nghiên cứu này

Hoạt động của các con đường tín hiệuchịu sự điều hòa chặt chẽ bởi các yếu tố ở khoảng gian bào trong đó có các sản phẩm của quá trình đáp ứng miễn dịch như cytokin, interleukin, các peptid, yếu tố phát triển Chính vì vậy, việc nghiên cứu cơ chế phân tử của quá trình dẫn truyền tín hiệu trong ung thư nói chung và ung thư tuyến giáp nói riêng còn phải được đặt trong một cái nhìn tổng thể về sự điều hòa, đáp ứng miễn dịch tại chỗ hoặc toàn thân của cơ thể chủ [10] Đồng thời nghiên cứu con đường dẫn truyền tín hiệu

trong ung thư sẽ kích hoạt khả năng chọn lựa liệu pháp điều trị mới- liệu pháp

ngăn cản con đường dẫn truyền tín hiệu- giúp kiểm soát ung thư trong tầm

với của y học Vì vậy đề tài: “Xác định con đường tín hiệu protein kinase hoạt hóa phân bào (MAPK) trong ung thư biểu mô tuyến giáp” được tiến

hành với các mục tiêu sau:

1 Xác định sự sao chép và biểu lộ của protein tương tác với heparan sulfate (HIP) và thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (EGFR) ở mô ung thư biểu mô tuyến giáp

2 Xác định mối tương quan của HIP và EGFR ở mô ung thư biểu

mô tuyến giáp

3 Xác định sự biểu lộ của protein ERK1 và ERK2 ở tế bào ung thư biểu

mô nuôi cấy

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN GIÁP

1.1.1 Cấu trúc tuyến giáp

Tuyến giáp

Nhìn nghiêng Thùy bên

Nhìn thẳng

Eo

Tế bào nang

Nang

giáp

Chất keo

Thùy bên Tuyến giáp Tuyến cận giáp trên

Tuyến cận giáp dưới

T ế

Hình 1.1 Tuyến giáp và cấu trúc nang giáp [51]

Tuyến giáp gồm những đơn vị cấu tạo được gọi là nang tuyến giáp Nang tuyến giáp có đường kính khoảng 100-300 µm, chứa đầy các chất keo trong lòng nang Lòng nang được lót bởi một lớp tế bào hình khối đa diện hoặc hình trụ là tế bào nang (tiết ra tiền hormon tuyến giáp) xen kẽ với tế bào C (tiết ra hormon calcitonin tham gia điều hòa chuyển hóa calci) Tế bào C chiếm khoảng 1% tổng số lượng tế bào nang, là những tế bào lớn, hình cầu, sáng màu Hai loại tế bào nang và tế bào C đều có thể ác tính hóa để trở thành ung thư tuyến giáp với các thể loại tế bào học khác nhau [105]

1.1.2 Dịch tễ học ung thư biểu mô tuyến giáp

Ung thư biểu mô tuyến giáp là sự ác tính của lớp tế bào biểu mô chế tiết thành các nang tuyến Với một tỷ lệ gia tăng trên khắp thế giới, ung thư biểu

mô tuyến giáp đứng hàng thứ bảy trong số các loại ung thư phổ biến ở phụ nữ trong năm 2007 và là loại ung thư phổ biến nhất trong hệ thống nội tiết [45], [59].Ung thư tuyến giáp chiếm tỷ lệ 1% trong tổng số các loại ung thư Tỷ lệ này cao ở những nước có bệnh bướu cổ đơn thuần Điều này chứng tỏ ung thư tuyến giáp có liên quan tới các u lành tuyến giáp Một vài dân tộc trên thế giới

đã được xác định rõ là có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn Ở Hoa Kỳ, hàng năm ước tính có khoảng 22.000 trường hợp ung thư tuyến giáp mới mắc [27], [44] Ở Việt Nam, tỷ lệ ung thư tuyến giáp ở những địa phương có bệnh bướu giáp đơn thuần cao hơn những vùng khác Tỷ lệ bệnh này gia tăng ở những người

xạ trị vùng đầu cổ lúc trẻ Xạ trị sau tuổi 21có nguy cơ gây ra ung thư tuyến giáp ít hơn Khoảng 20% bệnh xảy ra ở những bệnh nhân có phình giáp hạt (đơn hay đa hạt) và khoảng 3% ở các bệnh nhân có u nang tuyến giáp Bệnh thường gặp ở mọi lứa tuổi song có hai đỉnh: một đỉnh thấp ở giai đoạn 7-20 tuổi và một đỉnh cao ở lứa tuổi 40-60, nữ cao hơn nam từ 2-3 lần và ở nam thì bệnh ít ác tính hơn [2], [13]

1.1.3 Phân loại ung thư biểu mô tuyến giáp

Người ta chia ung thư biểu mô tuyến giáp thành hai loại: thể biệt hóa và thể không biệt hóa Hai thể này khác nhau về tiến triển lâm sàng cũng như tiên lượng Thể biệt hóa thường gặp ở người trẻ, tiến triển chậm trong nhiều năm, nếu chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời sẽ cho kết quả tốt Ngược lại, thể không biệt hóa lại thường gặp ở người trên 60 tuổi, tiến triển nhanh và hiếm

có bệnh nhân sống quá 5 năm Xếp theo thể loại mô bệnh học, ung thư tuyến giáp có nhiều thể khác nhau: thể nhú (Papillary carcinoma), thể nang (Follicular carcinoma), tế bào Hurthle, thể tủy (Medullary carcinoma) và thể

không biệt hóa (Anaplastic carcinoma) Trong đó thể nhú hay gặp nhất, chiếm khoảng 80% tổng số ung thư tuyến giáp, thể nang chiếm 12% và thể tuỷ khoảng 6% Các thể ung thư khác như sarcom nguyên phát, u lympho ác tính hay ung thư tuyến giáp thứ phát do di căn từ nơi khác đến thì hiếm gặp Tỷ lệ sống sau 5 năm của ung thư giáp thể nhú là 80-90%, thể nang là 50-70% và thể tủy là 30-40% Trong khi đó tỷ lệ này ở thể không biệt hóa chỉ dưới 5% và

đa số các bệnh nhân thuộc thể này chết trong vòng một năm [33], [68], [142]

Tế bào C

Ung thư thể nhú

Phì đại lành tính

Ung thư thể tủy

Ung thư thể nang

Ung thư thể không biệt hóa

- Không có tính chất gia đình

- Có tính chất gia đình

Tế bào nang

Sơ đồ: Quá trình hình thành và tiến triển của ung thư tuyến giáp [105]

1.1.4 Các phương pháp phát hiện ung thư tuyến giáp

Trong một số trường hợp ung thư tuyến giáp có các triệu chứng như: khàn giọng, đau cổ và tuyến giáp to Ung thư tuyến giáp thường ở dạng những nhân cứng, do bệnh nhân tự phát hiện ra hoặc do người thân hay bạn bè phát hiện Điều quan trọng là phải chẩn đoán phân biệt giữa nhân giáp lành và nhân ung thư Các xét nghiệm cận lâm sàng định kỳ như xét nghiệm hóa sinh, siêu âm, xạ đồ giúp cung cấp các thông tin để theo dõi sự tiến triển của khối nhân giáp cứng

Xét nghiệm hormon tuyến giáp thường ít có giá trị và không giúp cho việc chẩn đoán phân biệt giữa phì đại tuyến giáp lành tính và ung thư giáp Tuy nhiên khi có triệu chứng cường giáp hoặc suy giáp thì thiên về u giáp lành tính Nồng độ thyroglobulin có giá trị một khi chẩn đoán ung thư giáp đã được khẳng định và không có giá trị trong việc chẩn đoán phân biệt giữa u giáp lành tính và ung thư Siêu âm giúp xác định thể tích tuyến giáp, số lượng

và kích thước của các nhân và giúp định hướng cho kỹ thuật chọc hút bằng kim nhỏ hoặc sinh thiết Một số hình ảnh siêu âm điển hình có thể giúp thầy thuốc lâm sàng nghĩ đến nhân giáp lành tính hoặc nhân ung thư Tuy nhiên chỉ một kỹ thuật siêu âm không cho phép chẩn đoán phân biệt hai thể loại bệnh lý trên Xạ đồ tuyến giáp giúp phân biệt nhân lạnh, nóng hay nhân ấm thông qua việc xác định độ tập trung iod trên film Khoảng 85% nhân giáp là nhân lạnh, 10% là nhân ấm và chỉ 5% thuộc nhân nóng Cần phải lưu ý rằng trong số trên thì 85% nhân lạnh, 90% nhân ấm và 95% nhân nóng đều là lành tính Mặc dù xạ đồ tuyến giáp có thể định hướng người thầy thuốc nghĩ đến nhân giáp lành tính hay ung thư, song chỉ một kỹ thuật này không thể đưa ra một chẩn đoán xác định cho bệnh nhân

Cho đến nay, chỉ có một xét nghiệm duy nhất giúp chẩn đoán phân biệt nhân giáp ung thư và nhân giáp lành là chẩn đoán tế bào học nhờ sinh thiết Nhân giáp thường dễ dàng chọc hút bởi kỹ thuật sử dụng kim nhỏ (fine needle aspiration biopsy: FNA) Có thể nói kỹ thuật sử dụng kim nhỏ là công cụ chẩn đoán hữu hiệu trong việc đánh giá tình trạng lâm sàng của các nhân tuyến giáp Tuy nhiên khoảng chừng 15-30% kết quả của phương pháp cho trả lời là

“nghi ngờ” hay “chưa xác định” [109] Các trường hợp “chẩn đoán nghi ngờ” thường là: ung thư thể nhú, các dạng khác nhau của ung thư thể tủy, loạn sản

tế bào Hurthle, hoặc các trường hợp tế bào học không điển hình khác Chính

vì vậy việc xác định từng trường hợp nhân giáp lành tính hay ác tính luôn là

vấn đề thử thách đối với các nhà tế bào học Hơn nữa, để phát hiện được tế bào ung thư, thường chỉ khi khối u đã thành hình rõ; vào thời điểm đó hiệu quả của sự can thiệp đều hạn chế Vì thế, trong những năm trở lại đây nhiều nhà nghiên cứu đã nghĩ đến xu hướng sử dụng kỹ thuật chẩn đoán sinh học phân tử nhằm phát hiện những biến đổi về gen sớm nhất trước khi có sự biến đổi về hình thái tế bào Do đó, việc tìm hiểu các biến đổi gen trong quá trình phát sinh ung thư là cần thiết giúp tìm ra các dấu ấn ung thư mới góp phần chẩn đoán sớm bệnh ung thư

Bằng kỹ thuật microarray sử dụng mô tuyến giáp lành tính đối chiếu với các dòng tế bào/mô ung thư tuyến giáp người ta đã phát hiện được khoảng

700 gen bị hoạt hóa và 220 gen bị ức chế ở các dòng tế bào ung thư giáp so với mô lành tính ở nhiều mức độ khác nhau Trong số đó, nhiều gen đã được biết đến và nghiên cứu khá kỹ lưỡng như: RET, BRAF, Ras, p53, UbcH10 (Cyclin-selective ubiquitin carrier protein) và CBX7 (Chromobox homolog 7) Các nhà khoa học sử dụng kỹ thuật PCR định lượng (real time PCR) để định lượng quá trình sao chép các gen này ở trong các thể mô ung thư tuyến giáp khác nhau nhằm mục đích phát triển các dấu ấn ung thư mới phục vụ cho chẩn đoán Kết quả cho thấy mức độ hoạt hóa/ức chế các gen này phụ thuộc vào mức độ ác tính của từng thể loại tế bào học Trong đó thể ung thư tuyến giáp không biệt hóa (anaplastic thyroid carcinoma) bao giờ cũng thể hiện rõ nét nhất [67], [105], [145]

1.2 CÁC CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU VÀ QUÁ TRÌNH PHÁT SINH, PHÁT TRIỂN UNG THƯ

Sự phát triển, biệt hóa và sống còn của các tế bào bình thường được điều hoà bởi một số lượng giới hạn các con đường tín hiệu mà trong đó phần nào liên kết với nhau Các con đường tín hiệu truyền và kết hợp các tín hiệu từ ngoại bào như: các yếu tố phát triển, hormon, các liên kết tế bào-tế bào, tế bào-khoảng gian bào thông qua các thụ thể trên màng tế bào đi vào bên trong

tế bào, rồi tiếp tục qua các protein dẫn truyền trong bào tương để đi vào nhân

tế bào Ở đây, chúng hoạt hóa các gen sao chép dẫn đến sự tăng sinh và biệt hóa tế bào Các loại protein tín hiệu, các protein màng, protein bào tương và protein nhân đều là sản phẩm của c-oncogen (proto-oncogen) trong điều kiện bình thường Khi có sự mất điều hoà hoạt động của chúng, các c-oncogen đột biến trở thành oncogen có thể làm xuất hiện ung thư và trong những tình huống này con đường tín hiệu sẽ trở thành “con đường tín hiệu sinh ung thư”

Sự hoạt động không phù hợp hoặc là sự bất hoạt của các con đường tín hiệu là yếu tố quyết định đối với sự tiến triển ung thư ở người Nhiều gen sinh ung thư và nhiều gen ức chế ung thư cũng hoạt động trong khuôn khổ “con đường tín hiệu sinh ung thư” này [104], [108]

Các con đường tín hiệu có thể được khái quát như sau:

- Các tín hiệu ngoại bào (GF, cytokin, hormon…)

- Các tín hiệu ở màng tế bào (thụ thể màng tế bào)

- Các tín hiệu ở bào tương (RAS, RAF, ERK của con đường MAPK; PDK và AKT của con đường PI3K; con đường WNT…)

- Các tín hiệu trong nhân tế bào (Jun, Myc…)

Trong khuôn khổ của đề tài này, con đường tín hiệu protein kinase hoạt hóa phân bào (MAPK) được nhấn mạnh

1.2.1 Con đường tín hiệu MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase)

1.2.1.1 Các thành viên của con đường tín hiệu MAPK

MAPK là một gia đình lớn của các protein kinase serine/threonine liên quan với nhiều hoạt động của tế bào như là tăng sinh, biệt hóa, chết tế bào Các protein tín hiệu ở bào tương qua con đường MAPK gồm có RAF, MEK

và protein ERK Ở tế bào bình thường, nó tiếp nhận các tín hiệu từ sự hoạt hóa các thụ thể tyrosin kinase (Receptor Tyrosine Kinase: RTKs) bởi yếu tố phát triển (Growth Factor: GF), rồi đi vào nhân tế bào hoạt hóa sự biểu lộ của gen Ngoài ra, MAPK cũng có thể được hoạt hóa bởi các kích thích nội bào và

ngoại bào khác Ở tế bào ung thư, tín hiệu MAPK thường được gia tăng Vì vậy con đường MAPK qua ERK được xem là “dòng thác phân bào cổ điển” [80], [118], [148]

Các protein ERK (Extracellular signal Regulated Kinase) là dạng

nguyên mẫu của MAPK Ở tế bào động vât có vú có hai loại ERK1 và ERK2

là đặc trưng của MAPK, có trọng lượng phân tử 44kD (ERK1) và 42kD (ERK2) Một số protein kinase khác ít liên quan hơn là ERK3, ERK5, ERK6

Con đường tín hiệu p44/42MAPK (ERK1/2) được hoạt hóa bởi đáp ứng của các kích thích ngoại bào bao gồm: các yếu tố phân bào, yếu tố phát triển, cytokin và là đích quan trọng trong chẩn đoán và điều trị ung thư Sau khi nhận kích thích, một dòng thác protein kinse hiệu ứng được khởi đầu, gồm có một MAPKinase kinase kinase (MAP3K), một MAPKinase kinase (MAP2K)

và một MAPK Nhiều MAP3K đã được xác định, bao gồm các thành viên của gia đình RAF MEK1 và MEK2 là MAP2K nguyên phát trong con đường này MEK1 và MEK2 hoạt hóa p44 (ERK1) và p42 (ERK2) thông qua việc phosphoryl hóa các acid amin Thr202/Tyr204 và Thr185/Tyr187 Một số đích cuối dòng thác của p44/42 cũng đã được xác định là p90RKS và Elk1 ERK1/2 bị ức chế bởi MAPK phosphates

1.2.1.2 Quá trình hoạt động của con đường tín hiệu MAPK

Con đường dẫn truyền tín hiệu RAF-MEK-ERK là dòng thác protein kinase được hoạt hóa bởi RAS Con đường này điều hoà sự phát triển, tăng sinh và biệt hóa tế bào đáp ứng với những kích thích từ các yếu tố phát triển, kháng thể, cytokin và hormon… [118] Qua con đường này RAS được cho là để thúc đẩy sự thay đổi về khung và hình dạng tế bào, sự kết dính và di chuyển tế bào Điều đó được thể hiện phổ biến ở các tế bào với RAS sinh ung thư [34],

[81], [148] Sự biến đổi RAS trong ung thư là do chức năng điều hoà nút của

nó ở một số con đường liên quan với các đặc tính thiết yếu của các tế bào ung

thư Trong số các tác dụng khác nhau này, sự hoạt hóa con đường ERK MAPK là quyết định nhất đối với sự kích thích tăng sinh tế bào ung thư cùng với sự biến đổi của RAS Một trong các lý luận của nguyên lý này chính là sự biến đổi loại trừ lẫn nhau của gen RAS và BRAF trong một số ung thư, nổi bật là trong u hắc tố [31]

Trong hoạt tính chuyển dạng của các gen sinh ung thư nguồn gốc virus (v-oncogen) thì RAS và RAF là chìa khóa cho khám phá này của Rapp và cộng sự [116] và chính RAF là yếu tố hiệu ứng đầu tiên được xác định của dòng tín hiệu được hoạt hóa từ RAS [24], [80]

Hoạt hóa RAF được khởi đầu bởi sự kết hợp RAS-GTP với vùng gắn RAS (RBD: RAS binding domain) nằm trong khu vực điều hoà N tận của kinase Sự thay đổi thích ứng và sự kết tập lên màng tế bào làm khởi động những biến đổi phosphoryl hóa RAF, điều đó kết hợp với việc kích thích hoạt tính serine/threonine kinase của RAF gây phosphoryl hóa liên tục và gây hoạt hóa MEK và ERK [71], [91] Ba protein RAF có chức năng ở người là A-RAF, B-RAF và C-RAF hoạt động phụ thuộc vào sự phosphoryl hóa của đoạn mang hoạt tính [24], [143] Mối thông tin liên lạc giữa RAF, MEK và ERK cần có protein kết nối, đó là một đồng dạng của RAF không

có hoạt tính kinase [91]

MAPK tạo tín hiệu qua bào tương vào nhân và ở nhân nó kích thích các yếu tố điều khiển các tế bào ở trạng thái nghỉ trở thành tế bào ở trạng thái phân chia Trong nhân tế bào, hai phân tử rất quan trọng để điều khiển sự phát triển tế bào qua các giai đoạn phân chia tế bào là các cyclin và các enzym hoạt hóa phụ thuộc cyclin (cdks: cyclin dependent kinases) Nếu không có các cyclin thì các cdks không hoạt động được Tuy nhiên, cần phải có các cdks thì các cyclin mới làm cho các tế bào từ trạng thái nghỉ trở nên hoạt động và vì thế hoạt hóa quá trình phân chia tế bào Một trong những cyclin rất quan trọng

này là cyclin D Nó đóng vai trò quan trọng đặc biệt trong tiến trình phân chia

tế bào [8], [10], [79] Sự kết tập của cyclin D hình thành bước cuối cùng trong con đường liên kết hoạt hóa thụ thể yếu tố phát triển biểu mô và phân chia tế bào Khi MAPK đi vào trong nhân tế bào, nó gây kết tập cyclin D và tác động lên "chất kìm hãm sinh học" và khi sự kìm hãm sinh học bị bất hoạt thì tế bào buộc phải vận chuyển sang trạng thái phân chia hoạt động [78]

1.2.1.3 Vai trò con đường tín hiệu MAPK trong ung thư

Sự hoạt hóa liên tục con đường tín hiệu RAS-MEK-ERK là phổ biến đối với nhiều loại ung thư Xấp xỉ 15% ung thư ở người có sự biến đổi hoạt động của RAS [80] và biến đổi BRAF gần đây được xác định qua sàng lọc trên phạm

vi rộng các gen đột biến trong ung thư ở người [43] Đột biến thân của B-RAF liên quan với 60% các khối u hắc tố ác tính [39] và xảy ra với tần suất từ vừa đến cao ở các ung thư biểu mô đại trực tràng [114], ung thư biểu mô buồng trứng [130], ung thư phổi và ung thư biểu mô tuyến giáp thể nhú [29] Điều đó gợi ý rằng việc hoạt hóa biến đổi gen sinh ung thư BRAF như là yếu tố khởi động chủ chốt của các khối u ác tính Sự biến đổi BRAF và RAS được giới hạn một cách có ý nghĩa với các loại u tương tự và thông thường là theo cách loại trừ lẫn nhau Điều này cho phép các tác giả nghĩ rằng các gen này cùng trên một con đường tín hiệu sinh ung thư với nhau; đồng thời cũng gợi ý rằng RAS tác động gây hoạt hóa BRAF ở các loại hình ung thư này [103], [142]

Sự hoạt hóa con đường JNK MAPK (JNK: Jun kinase N tận- một con đường thành viên khác trong con đường tín hiệu MAPK) bởi RAS là một khía cạnh khác trong chức năng đa chiều của các protein này Sự tăng cường hoạt hóa của protein RAS ở tế bào bình thường có thể gây ngừng phát triển, chết theo chương trình hoặc suy yếu sự sao chép tế bào Ở một số loại tế bào, sự hoạt hóa RAS cũng có thể gây biệt hóa tế bào Chính vì thế, ngoài tác dụng tăng sinh tế bào, các protein RAS ở trạng thái hoạt hóa còn kích thích các đáp ứng khác, thậm chí cả việc chấm dứt tác dụng của chúng.Trong một vài trường

hợp, nó còn tạo ra phản ứng bảo đảm an toàn chống lại sự tăng sinh quá mức Tuỳ theo tình huống mà con đường JNK MAPK có thể hoạt động theo cách thức này [92], [121]

Như vậy khi các thụ thể yếu tố phát triển trên màng tế bào được hoạt hóa thì các protein RAS sẽ hoạt hóa hầu như liên tục, chúng làm trung gian cho nhiều hiệu ứng của hoạt động sinh lý hoặc là hoạt động sinh ung thư của các thụ thể tyrosin kinase (RTK), đặc biệt là hoạt động của con đường MAPK theo chiều của protein RAS Thực vậy, protein RAS làm trung gian không những cho các tín hiệu qua thụ thể tyrosine kinase mà còn liên quan đến việc đáp ứng của tế bào với các cytokin và hormon Ngược lại, thụ thể tyrosin kinase và các yếu tố khác điều chỉnh hoạt động của MAPK và các con đường ung thư khác nữa không chỉ thông qua RAS mà còn qua nhiều cơ chế khác nhau [34], [104], [134]

1.2.2 Các con đường tín hiệu khác

1.2.2 1.Con đường tín hiệu PI3K (Phosphoinositide3-Kinase)

Con đường tín hiệu PI3K thực hiện nhiệm vụ kiểm soát sự chuyển hóa tế bào, đặc biệt là vận chuyển và sử dụng glucose, nó kiểm soát sự điều hoà phát triển tế bào, đặc biệt là sinh tổng hợp protein và ngăn chặn sự chết tế bào theo chương trình Con đường này được kích hoạt bởi protein RAS và các thụ thể tyrosine kinase hoạt hóa Con đường tín hiệu PI3K được xem như là con đường tín hiệu ung thư vì thành phần ức chế chủ yếu của nó, PTEN, là một chất ức chế khối u cổ điển [140], [148]

Con đường PI3K thực sự đi qua protein kinase PDK1 và AKT Việc hoạt

hóa kết hợp PDK1 và AKT dẫn đến gia tăng tổng hợp protein Hiệu quả này

quan trọng trong hoạt động đồng hóa của insulin và yếu tố phát triển giống insulin (IGFs: Insulin-like growth factors) ở nhiều tế bào, nó cũng là điều kiện tiên quyết đối với việc tăng sinh tế bào và vì vậy là trung tâm của phát triển khối u [35], [140]

Sự phát triển tế bào bình thường liên quan với việc hoạt hóa đồng thời con đường MAPK và PI3K Cùng với nhau, 2 con đường này gây ra mọi thay đổi như là: tăng chuyển hóa, thúc đẩy tổng hợp protein, sắp xếp lại khung tế bào, ức chế các tín hiệu tiền chết theo chương trình và dĩ nhiên là cả sự kích

thích phát triển chu kỳ tế bào từ G1/G0 vào pha S [148] Tiếp sau sự di

chuyển của chúng vào nhân tế bào như một hiệu quả của hoạt hóa MAPK, hoạt hóa protein kinase ERK gây phosphoryl hóa một loạt các yếu tố hoạt hóa sao chép liên quan dến sự phát triển chu kỳ tế bào Hiệu ứng quan trọng của những sự kiện này là sự kích thích sao chép cyclin D Sự kết tập cyclin D điều khiển quá trình phát triển chu kỳ tế bào trong phần lớn thời kỳ G1 [79] Vì vậy, sự hoạt hóa đồng thời của cyclin D là điểm quan trọng của việc hiệp lực

giữa con đường MAPK và PI3K Và sự điều hoà Myc là điểm xa hơn nữa của

việc hiệp lực giữa hai con đường trên [148]

1.2.2.2 Con đường tín hiệu WNT

Có hơn 20 yếu tố thuộc vào gia đình yếu tố phát triển WNT ở người Chúng là các protein có trọng lượng phân tử khoảng 40kDa với >30% giống nhau Các protein được tiết ra sau khi được glycosyl hóa và liên kết đồng hóa trị với phần nửa ái mỡ của màng tế bào Do đó, các yếu tố này liên kết tốt với dịch ngoại bào và cắm lên màng tế bào làm hạn chế sự khuếch tán của chúng

Vì vậy, chúng được giới hạn hoạt động như các yếu tố cận tiết và tự tiết

Trong suốt quá trình phát triển, các protein WNT có xu thế làm phát triển và tạo hình thái cho nhiều tổ chức khác nhau, đặc biệt là cấu trúc biểu

mô hình ống và ống nhỏ ở thận và ruột Dĩ nhiên, yếu tố và con đường WNT tương tác với những con đường tín hiệu khác, ví dụ tương tác với con đường tín hiệu phụ thuộc Hedgehog trong phát triển của các chi [131] Các yếu tố WNT riêng lẽ duy trì mối liên quan với sự bình ổn của tổ chức trưởng thành và đặc biệt là để kiểm soát các khoang tế bào gốc, ví dụ ở đường tiêu hóa [90]

Hoạt động liên tục của con đường WNT chủ yếu là trong phát triển ung thư đại tràng Nó cũng quan trọng trong các ung thư khác, ví dụ ung thư biểu

mô tế bào gan Sự mất điều hoà của con đường WNT là do mất chức năng của các chất điều hoà âm tính (như là APC) hoặc bởi sự đột biến sinh ung thư hoạt hóa β-Catenin Vì vậy, APC và CTNNB1 (mã hóa cho β-Catenin) được xem như là chất ức chế khối u và chất sinh ung thư [107], [136]

1.2.2.3 Con đường tín hiệu Sonic Hedgehog (SHH)

Cũng như con đường WNT, con đường tín hiệu SHH góp phần hằng định tổ chức ở người trưởng thành, ngoài ra chúng còn liên quan đến việc duy trì quần thể tế bào gốc Có 3 protein Hedgehog ở người, đó là sonic Hedgehog (SHH), Desert Hedgehog (DHH) và Indian Hedgehog (IHH) Chúng tác động theo hình thức cận tiết Sự khuếch tán của chúng bị giới hạn bởi việc thay đổi

tính ái mỡ và trong trường hợp này là gắn ái lực với cholesterol Hedgehog

được nghiên cứu rõ nhất là về vai trò của chúng trong sự phát triển các chi, tuy nhiên chúng có vai trò quyết định đối với sự phát triển của nhiều cơ quan khác, như là não và tuyến tiền liệt

Yếu tố Hedgehog quan trọng nhất trong các mô trưởng thành là SHH Yếu tố Hedgehog gắn với thụ thể cơ trơn như là SMO1, khởi động con đường tín hiệu nội bào và cuối cùng dẫn đến sự hoạt hóa của yếu tố sao chép GLI

Đã có nhiều bằng chứng về sự giao thoa giữa con đường SHH và WNT bên trong tế bào [104], [131]

Theo Brandon Wainwright và cộng sự [28] khi phân tích sự biến đổi gen

ở những bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào đáy của da, hội chứng Gorlin, đã xác định gen patched như là một chất ức chế khối u Patched là một thụ thể của gia đình phối tử hedgehog và con đường này bị phá vỡ khi có sự thay đổi của các loại khối u bao gồm não, đường tiêu hóa, tuỵ và phổi Khi nghiên cứu

để xác định vai trò của con đường phát triển của da, Brandon Wainwright đã chứng minh một hoạt động không mong đợi của hedgehog trong điều hoà thành phần tế bào gốc của biểu mô Tác giả cũng đã khảo sát được sự điều hoà tế bào gốc hệ thần kinh bị chi phối bởi con đường patched/ hedgehog này Việc hiểu biết mối tương tác giữa con đường hedgehog và những con đường khác như là Wnt và Notch trong hệ thống này sẽ cho phép xác định đặc tính tế bào gốc và vai trò của nó trong nền tảng tế bào của khối u [77]

1.2.2.4 Con đường tín hiệu NOTCH

Con đường NOTCH được tìm thấy đầu tiên ở ruồi giấm và ngày càng được nghiên cứu nhiều hơn về chức năng của nó trong việc phát triển các mẫu sinh vật Ngày nay, NOTCH được khẳng định là một con đường tín hiệu sinh ung thư ở người và được xem như là một tác nhân trong bệnh lý thần kinh Alzheimer Đáng chú ý là cả việc ức chế và tăng hoạt động của con đường

NOTCH đều có thể khởi động sự tiến triển ung thư Sự nhập nhằng này hoàn toàn chưa từng xảy ra đối với con đường tín hiệu sinh ung thư khác Điều mâu thuẩn này liên quan đến sự nhạy cảm rõ ràng với liều lượng của nó mà sự

nhạy cảm đó xuất phát từ chức năng sinh học của NOTCH [97], [112]

Cũng giống như các con đường tín hiệu WNT và SHH, con đường tín hiệu NOTCH kiểm soát khoang tế bào gốc và tế bào tiền thân Một cách chính xác hơn, chức năng đặc trưng của nó là điều hoà việc quyết định số phận các

tế bào nhị phân Điều này bao gồm việc quyết định hoặc là một tế bào duy trì một tổ chức tiền thân hoặc là đi đến biệt hóa tận cùng, như là lớp tế bào đáy của biểu bì [112], [148]

Ở những tế bào ung thư, protein NOTCH có chức năng như là gen sinh ung thư Tín hiệu NOTCH hoạt động liên tục làm xuất hiện phần lớn các tiền lympho bào không phù hợp theo hướng biệt hóa thành tế bào T; vì vậy chúng trở nên ác tính bởi các biến đổi xa hơn nữa Tương tự, sự tăng cường hoạt động của NOTCH hợp tác với protein ung thư của virus như là kháng nguyên

T SV40 trong u trung biểu mô và HPV E6 và E7 trong ung thư cơ quan sinh dục Trong những trường hợp này, hiệu quả ức chế của tín hiệu NOTCH lên chu kỳ tế bào bị loại bỏ bởi protein ung thư của virus trong khi chức năng duy trì tế bào tiền thân của nó vẫn hoạt động và góp phần làm mở rộng khối u [112], [148]

Như vậy, một số con đường tín hiệu trong điều kiện sinh lý bình thường

là hệ thống điều hoà quá trình tăng sinh và biệt hóa của các tế bào trong cơ

thể Tuy nhiên, khi các con đường này hoạt hóa quá mức hoặc bị bất hoạt sẽ

gây nên một số biến đổi về đặc tính của tế bào theo hướng ác tính như là tăng sinh không kiểm soát được, ngăn chặn sự biệt hóa, giảm sự chết theo chương trình, thay đổi cấu trúc mô

1.2.3 Các con đường tín hiệu trong ung thư biểu mô tuyến giáp

Sự phát triển tế bào tuyến giáp đòi hỏi tác động phối hợp của TSH, hoạt động theo hướng AMP vòng và tín hiệu của yếu tố phát triển, hoạt động chủ yếu qua MAPkinase và PI3K [69] Vì vậy, điều đó phù hợp với thực tế rằng những biến đổi của các yếu tố hiệu ứng dọc theo các con đường tín hiệu tương ứng đóng vai trò nổi bật trong bệnh sinh của ung thư tuyến giáp Chẳng hạn như là các u tuyến của tuyến giáp có khả năng tự trị thường phối hợp với những biến đổi hoạt động của thụ thể Thyrotropin (TSH) hoặc Gsα dẫn đến sự hoạt hóa liên tục adenylyl cyclase Những khối u lành tính này hiếm khi tiến triển thành ác tính Ngược lại, trong ung thư biểu mô tuyến giáp thể nhú, có nhiều thực nghiệm chứng minh vai trò trung tâm của những biến đổi dẫn đến

sự hoạt hóa liên tục các yếu tố dọc theo con đường MAPK trong bệnh sinh của bệnh lý này [57]

1.2.3.1 Sắp xếp lại gen sinh ung thư RET như là dấu xác nhận gen học của ung thư tuyến giáp

Tai nạn nhà máy phản ứng nguyên tử Chernobyl gây hậu quả là giải phóng một lượng lớn các hợp chất phóng xạ vào bầu khí quyển, tiếp đó là sự gia tăng đáng kể tỷ lệ mắc ung thư tuyến giáp thể nhú ở trẻ em trong khu vực

Ở những vùng nhiễm phóng xạ cao nhất, sự gia tăng tỷ lệ mắc bệnh cao hơn

100 lần so với trước đó Phân tích gen của ung thư thể nhú ở trẻ em bị phơi nhiễm phóng xạ sau vụ Chernobyl cho thấy rằng có liên quan với gen sinh ung thư RET trong bệnh sinh của ung thư này [49], [70], [99]

Nhiều bằng chứng chứng tỏ rằng RET là bước khởi đầu then chốt trong bệnh sinh ung thư tuyến giáp: 1) chiếu xạ tế bào ung thư biểu mô tuyến giáp không biệt hóa ở người hoặc tế bào tuyến giáp thai người trong thực nghiệm (in vitro) đều gây ra sự sắp xếp lại RET theo kiểu phụ thuộc vào liều lượng Những quan sát này chứng tỏ rằng phóng xạ có thể trực tiếp gây ra sự sắp xếp

lại RET dẫn đến biểu hiện khác thường của gen sinh ung thư [55]; 2) một tỷ lệ

có ý nghĩa của các ổ cực nhỏ sâu kín của ung thư tuyến giáp thể nhú biểu lộ phản ứng miễn dịch của RET và mRNA của RET được xác định bằng RT-PCR [139]; 3) Phân tích DNA từ ung thư biểu mô thể nhú ở trẻ em phơi nhiễm phóng xạ cho thấy RET tăng [101] Điều này chứng minh rằng ion hóa chất phóng xạ, yếu tố nguy cơ chủ yếu đối với sự phát triển của ung thư biểu

mô tuyến giáp thể nhú, có thể trực tiếp kích thích các yếu tố tái tổ hợp RET và kết nối các yếu tố môi trường với sự khởi phát khối u thông qua con đường tín hiệu này

1.2.3.2 Đột biến của BRAF là biến đổi gene phổ biến nhất trong ung thư biểu mô tuyến giáp thể nhú

Yếu tố tín hiệu RAF thuộc con đường tín hiệu MAPK có ba đồng dạng là A-RAF, B-RAF và C-RAF Đồng dạng C-RAF được biểu lộ khắp nơi trong khi B-RAF biểu lộ ở mức cao hơn trong các tế bào tạo máu, thần kinh và tinh hoàn [42]; B-RAF là đồng dạng nổi trội ở các tế bào nang giáp Mặc dù tất cả các đồng dạng RAF đều hoạt hóa MEK nhưng chúng được hoạt hóa một cách khác nhau bởi RAS Theo Peyssonnaux C và cộng sự thì B-RAF có ái tính cao hơn với MEK1 và 2 và có nhiều khả năng phosphoryl hóa MEK hơn các đồng dạng RAF khác [42], [104] Nghiên cứu của Pierlorenzo và của Ciampi R khẳng định: trong ung thư biểu mô tuyến giáp có sự sắp xếp lại của BRAF [105] Theo Kimura E.T và cộng sự [68] đột biến BRAF là biến đổi về gen phổ biến nhất trong ung thư biểu mô tuyến giáp thể nhú và đột biến này không tìm thấy trong bất kỳ loại khối u ác tính thể nang hay thể biệt hóa nào khác Nhóm tác giả này và một số tác giả khác [101], [141] đã phát hiện rằng không có sự chồng chéo trong ung thư biểu mô tuyến giáp thể nhú với đột biến RET, BRAF hoặc đột biến RAS, mà tất cả những biến đổi đó hiện diện trong khoảng 70% trường hợp của ung thư biểu mô tuyến giáp thể nhú (Papillary

Thyroid Carcinoma: PTC) Các đột biến BRAF có thể xảy ra sớm trong sự phát triển của PTC vì chúng xuất hiện trong PTC vi thể [43] Hơn nữa, PTC với đột biến BRAF có nhiều đặc điểm ác tính hơn, thường gặp hơn trong giai đoạn xâm lấn ngoài tuyến và ở một giai đoạn tiến triển hơn Trong ung thư biểu mô không biệt hóa mà tiến triển từ các ung thư biểu mô thể nhú trước đó thì có sự đột biến BRAF phổ biến một cách có ý nghĩa, trong khi không thấy

sự gia tăng này ở các ung thư biểu mô không biệt hóa tiến triển từ các ung thư biểu mô thể nang trước đó [43], [145] Phát hiện này chỉ ra rằng đột biến BRAF có lẽ là một sự kiện khởi đầu khối u theo cách khác trong ung thư biểu

mô tuyến giáp thể nhú và cũng cho thấy rằng với kiểu gen này (BRAF) sẽ mang lại một tiên lượng xấu cho bệnh nhân

Sự biến đổi gen BRAF có thể minh chứng rằng BRAF là dấu ấn quan trọng của kiểu hình lâm sàng và mô bệnh học của ung thư biểu mô tuyến giáp thể nhú, nó trở thành một dấu ấn chẩn đoán và tiên lượng có giá trị, BRAF giúp phân biệt ung thư biểu mô tuyến giáp thể nhú với các thể ung thư giáp khác Dựa vào việc sử dụng các chất ức chế protein BRAF, các nghiên cứu này sẽ mang lại hy vọng cải thiện thời gian sống nhiều hơn nữa cũng như mang lại triển vọng điều trị lạc quan hơn cho bệnh nhân ung thư tuyến giáp [64], [110] Theo Paul T.C và cộng sự [103] việc khám phá rằng các biến đổi hoạt tính gen sinh ung thư BRAF xảy ra trong 2/3 các u hắc tố ác tính và ở tần suất cao trong các loại ung thư khác khẳng định tầm quan trọng của con đường tín hiệu RAS-RAF-MEK-ERK trong việc khởi động bệnh sinh ung thư

1.2.3.3 Các biến đổi của con đường RAF-MEK-ERK và thể loại ung thư tuyến giáp

Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy ung thư biểu mô tuyến giáp liên quan với việc hoạt hóa liên tục các yếu tố thuộc con đường tín hiệu RET-RAS-RAF-MAPK, con đường được tạo nên hoặc bởi sự hình thành các gen

sinh ung thư RET, đột biến điểm RAS, hoặc bởi sự biến đổi BRAF đáng chú

ý nhất [68], [84], [89], [111] Sự biến đổi RAS hiếm gặp trong ung thư biểu

mô tuyến giáp thể nhú (5-10%), trong khi biến đổi BRAF hay sắp xếp lại RET được phát hiện trong khoảng 70% dạng ung thư này và hai dạng biến đổi BRAF và RET hiếm khi chồng chéo với nhau trong cùng một dạng ung thư [33], [57], [67], [68], [129] Các biến đổi gen thường gặp trong ung thư biểu

mô thể nang bao gồm các biến đổi RAS (50%) và sự sắp xếp lại PPAR-γ Đột biến điểm RET là biến đổi chủ yếu trong tiến triển của ung thư biểu mô tuyến giáp thể tuỷ Trong ung thư thể không biệt hóa thì đột biến RAS, đặc biệt là đột biến p53 là thường gặp Nhiều trong số các đột biến này được thăm dò như những “đích trị liệu” đối với ung thư tuyến giáp [50], [105], [128]

PAX8-1.2.4 Con đường dẫn truyền tín hiệu và triển vọng về trị liệu ung thư

Ung thư biểu mô tuyến giáp thể nhú là bệnh lý ác tính tuyến giáp phổ biến nhất Mặc dù ung thư thể loại này thường có một tiên lượng thuận lợi nhưng đối với các bệnh nhân có khối u di căn và xâm lấn, không giữ iod phóng xạ kéo dài thường có tiên lượng không tốt Những biến đổi của thụ thể tyrosin kinases RET và của các yếu tố hiệu ứng tín hiệu nội bào RAS và BRAF đã được chứng minh là hiện diện trong hơn 70% trường hợp ung thư

tuyến giáp Những biến đổi này tăng lên vào giai đoạn sớm của phát triển ung

thư và có lẽ là quan trọng trong việc duy trì khối u Do đó, những hợp chất ức chế hoạt tính kinase của các yếu tố dẫn truyền dọc theo con đường này có thể chứng tỏ hiệu quả trong việc điều trị các dạng tiến triển của bệnh [57] Vì vậy, ung thư biểu mô tuyến giáp thể nhú là mô hình phù hợp cho việc thiết kế các đích liệu pháp mới

1.2.4.1 Điều trị ung thư bằng các tác nhân dược lý có khả năng ức chế hoạt động protein ung thư

Qua những trình bày ở các phần trên chúng ta thấy rằng các protein tyrosin kinase điều hoà những con đường tín hiệu-con đường điều khiển các hoạt động thiết yếu của tế bào: tăng sinh, biệt hóa, sống còn của tế bào- nên khi chúng bị biến đổi sẽ góp phần trong tiến triển của ung thư Vì vậy nhiều bằng chứng cho thấy việc khóa chức năng của các protein sinh ung thư hoạt hóa sớm trong quá trình tiến triển ung thư có thể có những hứa hẹn đặc biệt trong việc điều trị bệnh lý này [46] Do đó những protein này cần được ưu tiên chọn lựa như các “đích” phân tử trong trị liệu Cách thức trị liệu này sẽ chặn đứng con đường hoạt hóa không phù hợp ở các tế bào ung thư trong khi không gây tổn hại cho các tế bào bình thường

Những thành công đáng chú ý gần đây của cách thức trị liệu này gồm có

u tuỷ mạn tính phụ thuộc BCR-ABL, ung thư máu dòng lympho cấp [46], u tế bào đệm ống tiêu hóa phụ thuộc KIT và PDGFRA [45], hội chứng tăng bạch cầu ái toan phụ thuộc PDGFRA [40] và ung thư biểu mô tuyến của phổi phụ thuộc EGFR [61] Tuy nhiên, trong ung thư phổ biến là những biến đổi tiềm

ẩn hoặc là sự đứt gãy nhiều gen khác nhau mà mỗi một nguyên nhân đều có thể đóng vai trò trong bệnh sinh của ung thư Điều đó làm cho việc chọn lựa các đích phân tử trong điều trị ung thư là một quyết định khó khăn [65]

1.2.4.2 Ung thư biểu mô tuyến giáp thể nhú là ứng cử viên thích hợp cho liệu pháp nhắm trúng “đích”

Phần lớn bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến giáp thể nhú đều được chữa khỏi bằng cách kết hợp phẫu thuật với iod phóng xạ và điều trị kéo dài với liều hormon giáp trên mức sinh lý để ức chế sản xuất TSH nội sinh Tuy nhiên, những bệnh nhân với bệnh cảnh xâm lấn hoặc di căn thì không đáp ứng

với iod phóng xạ nên có tiên lượng xấu hơn, cho nên những protein kinase liên quan đến bệnh sinh ung thư của ung thư biểu mô tuyến giáp thể nhú trở thành những cái đích trị liệu hấp dẫn Mới đây, việc phát hiện biến đổi của BRAF và RET ở những tổ chức giáp hút sinh thiết bằng kim nhỏ (FNAB: Fine Neddle Aspiration Biopsies) đã được sử dụng thành công như một công

cụ phân tử trợ giúp để cải thiện chẩn đoán trước mổ của ung thư biểu mô tuyến giáp thể nhú [55], [139] Hơn nữa 70% ung thư tuyến giáp thể nhú có đột biến hoặc là của RET/PTC, RAS hoặc là của BRAF và những yếu tố tín hiệu dọc theo con đường này có lẽ là những vị trí tiếp cận về dược lý học để ngăn chặn con đường tín hiệu MAPkinase Vì vậy việc ức chế hoạt động của dòng thác tín hiệu RET-RAS-RAF-MAPK bởi các chất ức chế phân tử nhỏ đã trở thành một mũi tiếp cận đầy hứa hẹn để điều trị ung thư tuyến giáp [57], [106], [126] Như một tác nhân ức chế thụ thể tyrosin kinase, sunitinib có thể

ức chế sự tự phosphoryl hóa RET và bước đầu được chứng minh có hiệu quả đối với bệnh nhân ung thư tuyến giáp trong nghiên cứu lâm sàng pha I [37]

1.3 PROTEIN TƯƠNG TÁC VỚI HEPARANSULFATE (Heparan sulfate Interacting Protein: HIP) VÀ VAI TRÒ CỦA HIP TRONG UNG THƯ 1.3.1 Sự phát hiện ra HIP

Heparin và heparansulfate (HP/HS) là đại phân tử mang điện âm với mức độ sulfate hóa rất cao Vì vậy, chúng có khả năng tương tác với nhiều loại protein trong các quá trình sinh học khác nhau Các protein có khả năng liên kết đặc hiệu với HP/HS được xếp vào nhóm “protein gắn ái lực với HP/HS” Các protein này đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành và duy trì cấu trúc, chức năng của khoảng gian bào, thông qua đó chúng điều hòa quá trình liên kết tế bào-tế bào, quá trình phát triển, phân chia, biệt hóa tế bào

Vì vậy, nghiên cứu đặc điểm sinh học, cấu trúc và chức năng của các protein

này có thể giúp làm sáng tỏ cơ chế của các mối tương tác xảy ra trong quá trình phân chia, phát triển và biệt hóa của tế bào sống

Năm 1990, Wilson và Carson D.D., tiếp đến năm 1992 Raboudi và Carson D.D đã nhận thấy HSBP (Heparansulfate binding protein) có ái lực

cao trên bề mặt tế bào biểu mô tử cung chuột Sử dụng mô hình nghiên cứu in

vitro với dòng tế bào RL95 (dòng tế bào ung thư biểu mô tử cung) và JAR

(dòng tế bào ung thư buồng trứng), các tác giả đã chỉ ra rằng: quá trình liên kết tế bào-tế bào thông qua sự tương tác giữa HSPG (Heparansulfate proteo glycans) và HSBP trên bề mặt hai dòng tế bào này Sau đó ba phân đoạn peptid, sản phẩm thủy phân bởi protease của HSBP trên bề mặt dòng tế bào RL95 được giải trình tự và một protein mới thuộc nhóm HSBP được phát hiện

và được đặt tên là Heparansulfate Interacting Protein (viết tắt là HIP)

1.3.2 Cấu trúc và chức năng sinh học của HIP

Năm 1996, Liu và cộng sự [75] sử dụng kỹ thuật PCR sao chép ngược (RT-PCR) với các cặp mồi được thiết kế từ trình tự mã hóa các acid amin của các phân đoạn peptid của HIP để tổng hợp chuỗi DNA bổ sung (cDNA) Kết quả cho thấy trình tự nucleotid của HIP giống L29 (một protein kiềm gắn với ribosome) cDNA của HIP mã hóa phân tử protein có chiều dài 159 acid amin với trọng lượng phân tử 24kDa, pI là 11,75 Bằng kỹ thuật Northern blot, các tác giả cũng đã xác định mRNA của HIP có chiều dài là 1,3 kb [60], [75] Chính nhóm các tác giả Liu và cộng sự, đến năm 1997, đã xây dựng mô hình nghiên cứu thực nghiệm invitro để nghiên cứu chức năng sinh học của HIP Đồng thời các tác giả này cũng đã tổng hợp và tinh chế thành công protein tái tổ hợp nhờ công nghệ gen, từ đó nghiên cứu các chức năng sinh học của HIP Nhiều chức năng sinh học của HIP đã được công bố trong đó có: (1) Tham gia quá trình liên kết tế bào-tế bào; (2) Gắn đặc hiệu và chọn lọc với HP/HS; và (3) Tham gia điều hòa quá trình đông máu [76]

Hình 1.3 Cấu trúc mô phỏng các vùng chức năng của HIP

Một nghiên cứu khác của Marchetti D và cộng sự đã công bố: HIP ức chế enzym Heparanase qua đó làm tăng cường mối liên kết tế bào-tế bào Mối liên kết này bị ức chế bởi HP/HS và một số HSPG [82] Đồng thời tác giả cũng đã chứng minh vai trò của HIP trong quá trình làm tổ của trứng sau khi

đã thụ tinh Sự làm tổ của trứng trên bề mặt tế bào biểu mô tử cung bị ức chế bởi kháng thể kháng HIP [82]

1.3.3 Vai trò của HIP trong ung thư

1.3.3.1 Cơ chế phân tử của HIP trong ung thư

Khoảng gian bào đóng một vai trò đặc biệt trong quá trình phát triển của

mô Đây chính là nơi lưu giữ các yếu tố phát triển, các chất ức chế, các ion và rất nhiều các protein, enzyme với các chức năng khác nhau [15] Trong quá trình phát triển của mô, khoảng gian bào luôn được đổi mới và tân tạo Tại

đây có cân bằng động giữa sự lưu giữ và giải phóng các chất Mọi tác nhân làm thay đổi cân bằng này đều phản ánh tình trạng phát triển hay thoái hóa, sinh lý hay bệnh lý của tế bào và mô Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng: những tác nhân gây ra sự giải phóng các yếu tố phát triển từ khoảng gian bào đều dẫn đến việc thúc đẩy sự phát triển của tế bào [17], [18]

Đã có nhiều công trình nghiên cứu khẳng định rằng HIP điều hoà sự phát triển tế bào thông qua việc tác động lên quá trình cân bằng động giữa sự lưu trữ và giải phóng bFGF (basic fibroblast growth factor) từ khoảng gian bào [17], [18], [138] Những kết quả này gợi ý rằng tác dụng sinh học của HIP lên quá trình phát triển tế bào chính là nhờ khả năng cạnh tranh với bFGF trên các receptor bề mặt của yếu tố phát triển này [17], [76], [137] Như vậy, việc tăng cường giải phóng bFGF từ khoảng gian bào chứ không phải tăng cường tổng hợp bFGF từ trong tế bào chính là nguyên nhân chính dẫn đến hiện tượng tăng khả năng kích thích phân bào của yếu tố phát triển này [17], [18]

Khi nghiên cứu khả năng ức chế sự phát triển dòng tế bào sợi của HIP,

Tạ Thành Văn và cộng sự nước ngoài đã phát hiện rằng phân tử HIP toàn vẹn

có khả năng ức chế một cách đặc hiệu sự phát triển của dòng tế bào sợi nuôi cấy; tuy nhiên chỉ với một phân đoạn peptid của HIP gồm 16 axit amin lại không có hoạt tính sinh học này, mặc dù đoạn peptid này có ái lực cao nhất với HP/HS trong toàn bộ chiều dài của HIP Trong khi đó, khi phân đoạn này liên kết với BSA thì phức hợp peptid-BSA thể hiện hoạt tính ức chế mạnh [19] Điều này một lần nữa chứng minh cho giả thuyết là: hoạt tính ức chế sự phát triển tế bào của HIP thông qua tác dụng điều hoà sự cân bằng động bFGF

ở trạng thái hoạt động (tự do) và trạng thái không hoạt động (lưu trữ) ở khoảng gian bào và trên bề mặt tế bào

Sử dụng dòng tế bào sợi phân lập từ mô lợi bình thường và mô lợi phì đại của các bệnh nhân ghép tạng điều trị bằng thuốc ức chế miễn dịch

cyclosporine A (CsA) làm mô hình nghiên cứu thực nghiệm, các nghiên cứu cho thấy HIP tham gia điều hòa sự phát triển tế bào thông qua việc điều hòa quá trình lưu giữ và giải phóng bFGF từ khoảng gian bào Trong quá trình này CsA được phát hiện là nguyên nhân gây tăng quá trình tổng hợp DNA của các tế bào sợi [32], [95]

Tiếp tục khảo sát sự tổng hợp HIP ở mô lợi bình thường và mô lợi phì đại của bệnh nhân ghép tạng sử dụng CsA Kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả Tạ Thành Văn cho thấy HIP ức chế sự phát triển của dòng tế bào sợi phân lập từ mô lợi phì đại và mô lợi bình thường [16], [17], [18] Vậy một câu hỏi được đặt ra về vai trò của HIP trong sự phát triển của mô lợi phì đại? Các yếu

tố phát triển tế bào gắn đặc hiệu với HP/HS trong đó có bFGF có vai trò thúc đẩy sự tăng sinh phì đại của mô lợi ở những bệnh nhân sử dụng CsA Tế bào sợi từ mô lợi phì đại và mô lợi bình thường giống nhau về hình thái và sự đáp ứng với bFGF Điều đó cho thấy ảnh hưởng của CsA lên sự phát triển của dòng tế bào này chỉ có tính chất nhất thời Từ những kết quả nghiên cứu thu được cho phép tác giả đưa ra kết luận rằng tác dụng kích thích phân bào của CsA được thực hiện thông qua con đường giải phóng bFGF từ khoảng gian bào, chuyển từ dạng dự trữ sang dạng tự do (dạng hoạt động) Do HIP có khả năng cạnh tranh với bFGF trên vị trí gắn ở chuỗi HP/HS ở bề mặt tế bào hoặc trong khoảng gian bào nên giảm tổng hợp HIP sẽ làm giảm lượng bFGF ở dạng tự do Điều này làm hạn chế tốc độ phân chia của tế bào sợi Để khẳng định điều này, tác giả tiếp tục đi sâu nghiên cứu tìm hiểu con đường tín hiệu phân bào nào mà HIP phát huy tác dụng ức chế Kết quả cho thấy HIP ức chế một cách đặc hiệu khả năng hoạt hóa MAPK đặc biệt là thể phosphoryl hóa Erk-1 con đường tín hiệu của bFGF ở dòng tế bào sợi, trong khi HIP không phát huy tác dụng trên Erk-2 Kết quả này chứng minh cho giả thiết rằng HIP

có tác dụng ức chế sự phát triển dòng tế bào sợi phân lập từ mô lợi phì đại và

sự ức chế đó thông qua con đường tín hiệu MAPK mà bFGF phát huy tác dụng [18]

Một số nghiên cứu khác về HIP trên các mô ung thư khác nhau của tác giả Tạ Thành Văn và cộng sự trong nước cũng đã đưa ra những bằng chứng khoa học chứng minh HIP có khả năng cạnh tranh với yếu tố phát triển tế bào (bFGF) ở vị trí gắn trên phân tử heparansulfate ở khoảng gian bào Sự tổng hợp “dư thừa” của HIP ở mô ung thư đã làm giải phóng mạnh mẽ các yếu tố phát triển tế bào lưu giữ ở khoảng gian bào Thông qua các con đường tín hiệu khác nhau trong đó có MAPK, yếu tố phát triển sẽ hoạt hóa các thụ thể trên bề mặt màng tế bào của các con đường tín hiệu này và thông tin sẽ được truyền từ bề mặt màng vào trong bào tương và trong nhân tế bào để thúc đẩy mạnh mẽ quá trình phân bào [98]

1.3.3.2 HIP và các loại ung thư

Cho đến nay, vai trò nòng cốt của sự tăng cường biểu lộ gen HIP trong việc tăng sinh tế bào và bệnh sinh ung thư được ủng hộ mạnh mẽ qua nhiều công trình nghiên cứu Hầu hết các kết quả nghiên cứu đều chứng minh rằng HIP được tăng cường tổng hợp ở một số dòng tế bào và mô ung thư ở cả mức

độ mRNA và protein đặc biệt là tại tế bào biểu mô Hơn nữa, mức độ biểu lộ HIP phụ thuộc vào giai đoạn phát triển và biệt hóa của các dòng tế bào ung

thư [56], [137], [138],

Theo tác giả Carson D.D sự tổng hợp của HIP liên quan đến các dòng tế bào ung thư vú người đặc biệt là các dòng tế bào có độ ác tính và di căn cao Cùng với công trình đó, bằng việc sử dụng kỹ thuật hóa miễn dịch mô với kháng thể kháng HIP, các tác giả khác đã tiếp tục chứng minh HIP protein được tăng cường tổng hợp tại tế bào biểu mô HIP được phát hiện cả trên tế

bào biểu mô vú bình thường lẫn trên ung thư vú in situ Điều này gợi ý rằng

HIP đảm nhận vai trò trung gian đối với vùng tương tác phụ thuộc HS giữa tế

bào biểu mô vú bình thường và tế bào biểu mô vú ác tính với các tế bào khác, cũng như với các thành phần của khoảng gian bào [56]

Bằng phương pháp lai loại trừ để thu nhận các gen được biểu lộ một cách khác biệt trong ung thư biểu mô đại trực tràng, Wang Y và cộng sự [146]

đã phát hiện HIP tăng cường biểu lộ trong ung thư biểu mô đại trực tràng và tương quan với tình trạng biệt hóa và di căn Nghiên cứu trên 53 bệnh nhân ung thư đại trực tràng ở Singapore, tác giả nhận thấy rằng 70% trường hợp có

tỷ số biểu lộ HIP ở mô ung thư so với mô lành là > 2 Sự biểu lộ HIP ở mô polyp tương tự như ở mô ung thư, điều này chỉ ra rằng gia tăng tổng hợp HIP

có lẽ là một nhân tố sớm trong bệnh sinh ung thư Tương tự, sự biểu lộ HIP còn liên quan đến tình trạng biệt hóa ở các dòng tế bào ung thư biểu mô đại trực tràng Sự biểu lộ HIP cao hơn một cách có ý nghĩa khi tế bào có xu hướng biệt hóa Nghiên cứu này chỉ ra rằng HIP là một phân tử quan trọng để kết dính tế bào-tế bào và tế bào-khoảng gian bào Sự tăng cường biểu lộ HIP

có thể là một nhân tố sớm trong bệnh sinh ung thư và sự tăng biểu lộ của nó

có thể làm dễ dàng cho việc phát triển và xâm lấn tại chỗ HIP là một dấu ấn đầy hứa hẹn của sự phát triển tế bào không bình thường ở đại tràng và là một dấu ấn tiên lượng của ung thư biểu mô đại trực tràng [146]

Cũng trong thời gian này nhóm các tác giả người Ý đứng đầu là GS Alfredo Fusco đã phát hiện ra rằng gen mã hóa HIP và HIP protein cũng được tăng cường sao chép ở các dòng tế bào và mô ung thư tuyến giáp Cả lượng mRNA và protein HIP đều được xác định là phụ thuộc vào quá trình phát triển, biệt hóa và di căn của dòng tế bào ung thư tuyến giáp [98]

Tại Việt Nam, bắt đầu từ năm 2005, nhóm nghiên cứu của tác giả Tạ Thành Văn lần đầu tiên tiến hành đánh giá mức độ sao chép của HIP ở mô ung thư vú Nhóm nghiên cứu đã đưa ra những bằng chứng về sự khác biệt đáng kể mức độ sao chép mRNA của HIP ở mô ung thư vú người Việt Nam so với mô

u xơ vú đơn thuần Đặc biệt, mức độ sao chép này lại phụ thuộc vào giai đoạn tiến triển của khối u [6], [7] Năm 2006, trong một nghiên cứu thăm dò, tác giả

Tạ Thành Văn và cộng sự cũng đã phát hiện được: sự sao chép của HIP tăng cường trong mô ung thư tuyến tiền liệt trong khi không phát hiện được hoặc chỉ phát hiện được rất thấp ở mô u xơ tuyến tiền liệt [9] Những phát hiện này một lần nữa khẳng định rằng HIP tăng cường sao chép ở các tế bào biểu mô trưởng thành, đặc biệt là gia tăng trong mô ung thư, trong khi đó sao chép rất kém hoặc thậm chí không sao chép ở các mô liên kết và tế bào sợi

Đến năm 2007, cũng nhóm tác giả này đã nghiên cứu một cách có hệ thống hơn để đánh giá mức độ sao chép của HIP trong nhiều thể loại ung thư khác nhau, với các thể loại tế bào học và các giai đoạn tiến triển khác nhau Các tác giả đã phát hiện HIP không chỉ được tăng cường sao chép ở mô ung thư vú [6], mô ung thư tuyến tiền liệt [9] mà ở cả mô ung thư tuyến giáp và

mô ung thư đại trực tràng [4] Đặc biệt qua nhận xét sơ bộ ban đầu nhóm tác giả phát hiện được mức độ sao chép của HIP còn phụ thuộc vào thể loại mô học của các loại hình ung thư

Nhóm nghiên cứu cũng đã thành công trong việc triển khai ứng dụng kỹ thuật Reverse Transcript Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) định lượng

và bán định lượng để đánh giá mức độ sao chép của HIP Cho đến nay, nhóm nghiên cứu này đi sâu khảo sát một cách có hệ thống về sự có mặt của HIP không những ở mức độ mRNA mà cả ở mức độ protein trong một số thể loại ung thư ở các giai đoạn khác nhau và so sánh với các mô chứng tương ứng Kết quả nghiên cứu cũng khẳng định rằng mức độ biểu lộ protein HIP ở mô ung thư cao hơn nhiều so với mô đối chứng

Ngoài ra kháng thể kháng HIP cũng đã được tổng hợp để triển khai ứng dụng kỹ thuật nhuộm hóa miễn dịch mô định lượng (so màu) nhằm mục đích nghiên cứu khả năng ứng dụng của HIP như một dấu ấn ung thư để góp phần chẩn đoán bệnh ung thư [1]

1.4 THỤ THỂ YẾU TỐ PHÁT TRIỂN BIỂU MÔ (Epidermal Growth Factor Receptor: EGFR) VÀ VAI TRÒ CỦA EGFR TRONG UNG THƯ 1.4.1.Giới thiệu về thụ thể yếu tố phát triển biểu mô

Thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (EGFR) là receptor tyrosine kinase (RTK) đầu tiên đã được phát hiện bởi Carpenter và cộng sự vào năm 1978 Phần lớn các nguyên lý và các mô hình hoạt động của RTK đều được thiết lập lần đầu tiên cho EGFR [127] Tiếp sau EGFR, 3 thành viên nữa của gia đình thụ thể này được xác định đó là ErbB2 (HER2/neu), ErbB3 (HER3) và ErbB4

(HER4) [117] Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng các thụ thể này đều được hoạt

hóa bởi EGF, TGFα và 10 phối tử đầy tiềm năng khác [62] (hình 1.4)

Giống như tất cả các RTK, gia đình EGFR được cấu tạo gồm một vùng gắn với phối tử ngoại bào, tiếp đó là vùng xuyên màng và một vùng nội bào

có hoạt tính enzyme tyrosine kinase Enzyme tyrosine kinases là enzyme xúc tác việc vận chuyển phosphate từ ATP đến tyrosine cư trú trong các polypeptide Chính sự phosphoryl hóa này là hoạt động sống của tế bào Bộ gen người chứa khoảng 90 protein tyrosine kinases và 43 gen giống protein tyrosine kinases mà sản phẩm của chúng sẽ điều hoà sự tăng sinh, sống còn,

sự biệt hóa, chức năng và sự vận động tế bào Vì vậy hoạt động của chúng thường được kiểm soát và điều hòa rất chặt chẽ Sự rối loạn hoạt động của enzym tyrosin kinase do đột biến hay các thay đổi di truyền khác có thể gây ra mất điều hòa hoạt động của enzym này và hậu quả là tế bào trở thành ác tính [22], [30], [38], [41]

Hình 1.4 Hoạt hóa EGFR bởi EGF [148]

Khu vực

nội bào

Khu vực

ngoại bào

1.4.2 Sự điều hoà hoạt động bình thường EGFR

EGFR làm trung gian cho nhiều đáp ứng tế bào trong các tiến trình sinh học bình thường và trong tình trạng bệnh lý Rối loạn hoạt động của enzyme tyrosine kinase hoặc sai lệch hoạt động của các thành phần chủ chốt của con đường tín hiệu sẽ dẫn đến các bệnh lý nghiêm trọng như là ung thư, đái đường, thiếu hụt miễn dịch và bệnh lý tim mạch Những nghiên cứu về cấu trúc gần đây đã phát hiện được phân tử cơ bản gắn kết đặc hiệu với phối tử và khi phối tử gắn kết sẽ làm phân cực thụ thể như thế nào Sự phân cực thụ thể được làm trung gian bởi các tương tác thụ thể-thụ thể mà trong đó một vùng nhô ra từ thụ thể lân cận có thể gián tiếp gây phân cực và hoạt hóa thụ thể [127]

Khi vắng mặt các phối tử (ví dụ EGF, TGF) thì các thụ thể yếu tố phát triển biểu mô không phosphoryl hóa, chúng ở dạng đơn phân và vùng kinase của chúng bị bất hoạt EGFR trở nên hoạt hóa khi phối tử gắn với vùng ngoại bào, kết quả làm phân cực thụ thể, phá vỡ tương tác tự ức chế cạnh màng và

tự phosphoryl hóa tyrosin điều hoà vòng hoạt hóa của kinase [122] Điều này làm thay đổi điều kiện cư trú của acid amin then chốt, bằng cách đó làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme Sau khi hoạt hóa, việc tự phosphoryl hóa để lộ những vị trí gắn kết với protein của con đường tín hiệu, làm tập trung chúng trên màng; điều đó khởi đầu một dòng thác phản ứng tế bào mà kết quả là làm tăng sự phân chia tế bào và ảnh hưởng đến các khía cạnh khác của sự tiến triển ác tính của khối u: tân sinh mạch, di căn và ức chế chết theo chương trình [30], [52]

EGFR hoạt hóa kích thích bước tiếp theo của con đường tín hiệu đó là hoạt hóa protein RAS, đến lượt mình, protein này khởi động một làn sóng phosphoryl hóa làm kích hoạt enzym protein kinase hoạt hóa phân bào (MAPK)

Tín hiệu tyrosin kinase được kết thúc một phần qua hoạt động của tyrosin phosphatase, một enzyme thuỷ phân tyrosyl phosphate và phần khác