Luận văn : THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli part 7 potx

Định tính Khi tiêm kháng nguyên lần đầu thì khoảng 7 ngày sau kháng thể xuất hiện trong huyết thanh nhưng ở hàm lượng thấp nên khó phát hiện được bằng phương pháp thông thường đặc biệt

0 500 1000 1500 2000

mũi nhắc lại 3 mũi nhắc lại 4

thời điểm lấy máu

Huyết thanh

HT hấp phụ E68

Biểu đồ 4.6 Trung bình hiệu giá kháng thể ngưng kết trong huyết thanh được

hoặc không được hấp phụ ở qui trình dài ngày

4.2 THẢO LUẬN

4.2.1 Định tính

Khi tiêm kháng nguyên lần đầu thì khoảng 7 ngày sau kháng thể xuất hiện trong huyết thanh nhưng ở hàm lượng thấp nên khó phát hiện được bằng phương pháp thông thường đặc biệt là phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính có độ nhạy rất thấp Kháng thể chỉ được phát hiện bằng phương pháp này khi nồng độ kháng thể lên đến đỉnh điểm (khoảng 12-15 ngày sau khi tiêm kháng nguyên)

Ở qui trình ngắn ngày, kháng thể chỉ phát hiện được trong huyết thanh sau mũi nhắc lại lần 2 (sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày) 14 ngày là thời gian đủ để hàm lượng kháng thể trong máu lên cao nên có thể phát hiện bằng phản ứng ngưng kết Kháng thể vẫn tiếp tục tồn tại trong máu ở các mũi nhắc lại tiếp theo (khoảng cách giữa 2 mũi nhắc lại cách nhau 5 ngày) Trong KHT của lần lấy máu cuối cùng (15 ngày sau khi tiêm mũi nhắc lại cuối cùng) vẫn còn sự hiện diện của kháng thể

Ở qui trình dài ngày, kết quả phản ứng ngưng kết trên phiến kính với KHT sau khi tiêm mũi gây mẫn cảm và các mũi nhắc lại 1,2 không rõ ràng Có thể kháng thể xuất hiện trong KHT sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày nhưng do hàm lượng kháng thể trong huyết thanh còn thấp nên khó phát hiện được Ở các mũi nhắc lại thứ 3 và thứ 4 thì phản ứng ngưng kết cho kết quả rõ hơn Có thể do tiêm nhắc lại cùng một loại kháng nguyên vào cơ thể giúp tăng cường việc chọn lọc các dòng kháng thể có ái lực cao với kháng nguyên phát triển tạo ra các kháng thể có ái lực mạnh hơn và nhiều hơn

Để tăng cường khả năng đáp ứng miễn dịch, mũi gây mẫn cảm nên tiêm thêm vi khuẩn lao và vaccine ho gà vì hai loại kháng nguyên này kích thích sự tổng hợp một số cytokin cần thiết giúp kích thích miễn dịch mạnh hơn Ngoài ra, sử dụng tá chất cũng làm tăng cường khả năng đáp ứng miễn dịch

4.2.2 Định lượng

4.2.2.1 Qui trình ngắn ngày

Kháng thể phát hiện trong kháng huyết thanh sau mũi nhắc lần 2 (14 ngày sau khi tiêm mũi mẫn cảm) Do số lượng KHT thu được sau mũi nhắc lại lần 2, lần 3 quá ít không đủ để định lượng nên không thể xác định được hiệu giá kháng thể ngưng kết sau mũi nhắc lại lần 2, lần 3 mà chỉ định lượng được KHT sau mũi nhắc lại lần 4 (tiêm lần

cuối) ở các thời điểm khác nhau (5, 10, 15 ngày sau khi tiêm mũi nhắc lại cuối cùng)

Hiệu giá kháng thể ngưng kết trong kháng huyết thanh giảm dần qua các lần lấy máu Hiệu giá kháng thể ngưng kết cao nhất ở đợt lấy máu lần 1 (5 ngày sau khi tiêm mũi nhắc lại cuối cùng) và thấp nhất ở đợt lấy máu lần 3 (15 ngày sau khi tiêm mũi nhắc lại cuối cùng) Đáp ứng miễn dịch giảm dần có thể do việc ngừng cung cấp kháng nguyên Qui trình ngắn ngày không tạo đáp ứng miễn dịch đủ mạnh và kéo dài Với cùng một liều tiêm, ở lần lấy máu thứ nhất, hiệu giá kháng thể ngưng kết của thỏ 1 và thỏ 2 bằng nhau Nhưng ở lần lấy máu thứ 2, thứ 3 hiệu giá kháng thể ngưng kết của thỏ 2 cao hơn thỏ 1 có lẽ do ở mỗi cá thể có sức đề kháng, trạng thái thể chất

và thần kinh của cơ thể khác nhau nên khả năng đáp ứng miễn dịch cũng khác nhau

4.2.2.2 Qui trình dài ngày

Thông thường hiệu giá kháng thể ngưng kết trong kháng huyết thanh ở các mũi nhắc lại sau phải cao hơn mũi nhắc lại trước nhưng ta thấy hiệu giá kháng thể ngưng kết của thỏ 3 ở các mũi nhắc lại lần 3 và lần 4 bằng nhau có thể do đáp ứng miễn dịch của thỏ 3 đã đạt đến ngưỡng cao nhất nên không tăng lên nữa hoặc do thỏ bị bệnh nên sức để kháng giảm làm giảm đáp ứng miễn dịch, ngoài ra việc tiêm thuốc trị bệnh thỏ cũng ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch

Ở mũi nhắc lại lần 3, hiệu giá kháng thể ngưng kết thỏ 3 (liều tiêm mẫn cảm 1ml) cao hơn thỏ 4 (liều tiêm mẫn cảm 1,5 ml) Điều đó chứng tỏ liều tiêm 1 và 1,5 ml không ảnh hưởng lớn đến đáp ứng miễn dịch mà phụ thuộc chủ yếu vào khả năng đáp ứng miễn dịch của từng cá thể

Ở thỏ 4, hiệu giá kháng thể ngƣng kết ở mũi nhắc lại lần 4 cao hơn mũi nhắc lại lần 3 rất nhiều so với thỏ 3 Điều này cho thấy đặc điểm cá thể giữ vai trò nhất định trong đáp ứng miễn dịch với các yếu tố kháng nguyên xâm nhập

Ở cả hai qui trình ngắn ngày và dài ngày, hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh nguyên cao hơn hiệu giá kháng huyết thanh đã tủa với ammonium sulfate và thẩm tích Điều này có thể do trong quá trình tủa và rửa tủa thì một số protein kháng thể bị biến tính hoặc bị trôi mất

So với qui trình ngắn ngày, qui trình dài ngày cho lƣợng kháng thể cao (tăng dần

ở các lần lặp lại) Do đó nếu gây miễn dịch để thu kháng huyết thanh nên chọn qui trình dài ngày vì thu đƣợc lƣợng KHT nhiều hơn (có thể lặp lại đến mũi nhắc lại thứ 7)

và kháng thể tạo ra có ái lực cao với kháng nguyên hơn Tuy nhiên số thú thí nghiệm chƣa nhiều vì vậy việc lặp lại là cần thiết để có những kết luận chắc chắn hơn

4.2.3 Xử lí để tăng độ nhạy kháng huyết thanh

Phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính là phản ứng có độ nhạy rất thấp, chỉ phát hiện đƣợc kháng thể trong KHT ở nồng độ cao Do đó để tăng độ nhạy nhằm xác định chính xác hơn sự hiện diện của kháng thể trong huyết thanh ta có thể cho kháng

thể gắn với protein A của S aureus

Protein A trên thành vi khuẩn S aureus có khả năng gắn với IgG của thỏ rất tốt

Khi cho kháng thể đã gắn với protein A phản ứng với kháng nguyên thích hợp thì

kháng thể cùng với S aureus ngƣng kết với kháng nguyên do đó hạt ngƣng kết sẽ lớn hơn nhiều lần so với kháng thể không gắn protein A Do đó việc gắn kháng thể với protein A của S aureus sẽ làm tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết

Tuy vậy tỉ lệ kết hợp giữa kháng huyết thanh và S aureus cũng tác động đến kết

quả của phản ứng ngƣng kết Thử nghiệm cho thấy tỉ lệ thích hợp giữa KHT và dịch vi

khuẩn S aureus trong nghiên cứu là 1:4 với nồng độ S aureus là 1014 tế bào/ ml

4.2.4 Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh

Khi đƣa kháng nguyên vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể tạo ra kháng thể chống lại các quyết định kháng nguyên (các epitop) Nếu kháng nguyên có một quyết định KN thì cơ thể chỉ tạo ra một loại kháng thể đặc hiệu với quyết định KN đó Nếu KN có nhiều quyết định KN khác nhau thì ứng với một quyết định KN thì cơ thể sẽ tạo ra một

KT phù hợp

Vi khuẩn E coli là kháng nguyên gồm nhiều quyết định KN khác nhau, trong đó

có một số quyết định KN giống nhau cho tất cả các chủng E coli Kháng thể tạo ra sẽ

có một số kháng thể đặc hiệu cho tất cả các chủng E coli do đó việc định tính kháng thể kháng một chủng E coli nào đó sẽ không chính xác

Chủng O139:K82 (H28) và chủng K88+ (E68) đều thuộc nhóm E coli gây bệnh

trên heo nên chúng có một số yếu tố kháng nguyên giống nhau Do đó khi dùng chủng E68 để hấp phụ huyết thanh sẽ loại đi kháng thể chung cho E68 và H28 nên trong huyết thanh chỉ còn lại các kháng thể đặc hiệu cho H28 Vì vậy việc thực hiện phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh đã hấp phụ E68 sẽ cho hiệu giá thấp hơn

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 KẾT LUẬN

1 Kháng thể ngưng kết phát hiện được trong kháng huyết thanh sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày

2 Hiệu lực gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên biến đổi tùy theo qui trình gây miễn dịch

3 Khoảng cách giữa 2 lần tiêm nhắc kháng nguyên E coli trên thỏ là 28 ngày tạo

hiệu giá kháng thể ngưng kết cao hơn so với khoảng cách giữa 2 lần tiêm nhắc

là 5 ngày

4 Để tăng độ nhạy của phản ứng ngưng kết trên phiến kính KHT có thể được xử lí

gắn với S aureus (nồng độ 1014 tế bào/ ml) và tỉ lệ thể tích KHT : S aureus là

1:4

5 Xử lí kháng huyết thanh bằng cách kết tủa và thẩm tích làm giảm đáng kể hiệu giá kháng thể ngưng kết của kháng huyết thanh

5.2 ĐỀ NGHỊ

1 Với qui trình ngắn ngày cần định lượng KHT sau mũi nhắc lại thứ 2, thứ 3 để xác định thời điểm kháng thể trong KHT nhiều nhất

2 Nên thử nghiệm sử dụng chất bổ trợ để tăng cường khả năng đáp ứng miễn dịch của thỏ

3 Lặp lại thí nghiệm với số lượng thú thí nghiệm lớn hơn để đánh giá chính xác hơn hiệu quả đáp ứng miễn dịch ở hai qui trình trên

PHẦN 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần tiếng việt

1 Nguyễn Ngọc Hải, 1999 Phân lập vi khuẩn E coli gây bệnh phù trên heo sau

cai sữa và khảo sát khả năng nhạy cảm của chúng đối với một số kháng sinh

Luận án Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp, Đại học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam

2 Lê Văn Hùng, 2002 Giáo trình miễn dịch học thú y NXB Nông Nghiệp,

TP.HCM 191 trang

3 Đỗ Ngọc Liên, 2004 Miễn dịch học cơ sở NXB Đại học Quốc gia, Hà Nội tr

3-119

4 Đỗ Ngọc Liên, Thực hành hóa sinh miễn dịch NXB Đại học Quốc gia Hà Nội

5 Nguyễn Như Thanh, 1996 Miễn dịch học NXB Nông Nghiệp Hà Nội

6 Bộ môn miễn dịch - sinh lí bệnh trường đại học Y Hà Nội, 1997 Miễn dịch học

NXB Y học Hà Nội

Phần tiếng Anh

7 Cooper G Terrance, 1977 The Tools of Biochemistry John Wiley & Sons,

New York, USA p 257-277, 355-405

8 Dress W D Immunization of experimental animals Applications of

Immunological Methods in Biomedical Sciences, Volume 1 (Edited by D M

Weir, Co-editors L A Herzenberg, Caroline black well, Leonone A Herzenberg) Black well Scientific Publications p 8.1-8.18

9 Gross J R and Rowe B., 1985 Serotyping of Escherichia coli The Virulence

of Escherichia coli (M Sussman) Academic Press, London, England p

345-356

10 Harlow Ed and Lane David, 1988 Antibodies: a laboratory manual Cold

Spring Harbor Laboratory p 92-137, 286-299

11 Mahler R Henry and Cordes H Eugene, 1967 Biological chemistry Harper &

Row, New YorK, USA p 63-69

12 Sojka J W., M.R.C.V.S, 1965 Escherichia coli in domestic animals and

poultry Commonwealth Agricultural Bureaux Farham Royal, Bucks, England

p 205-212

13 Tizar Ian R., 1992 Immunology: an introduction, Third Edition Sauders

College Publishing, New York, USA p 13-25, 112-128, 167-189, 219-236

Internet

http://www.bio.mtu.edu/campbell/bl482/lectures/lec5/482w52.htm

http://www.uccs.edu/~rmelamed/MicroFall2002/Chapter%2017/Antibody%20Ti me%20Course.jpg

http://www.accessexcellence.org/ RC/VL/GG/antiBD_mol.html

http://www.cvm.uiuc.edu/courses/vp331/Staphylococci/proteinA.gif

PHẦN 7 PHỤ LỤC

Thành phần môi trường TSB (Tryptone Soya Broth) tổng hợp:

Popaic digest of soyabean meal 3 g/l

pH = 7,3 ± 0,2 (ở 25oC)

Pha chế: cân 30g bột TSB hòa trong 1l nước cất, đun sôi cho tan sau đó đem hấp khử trùng 121oC trong 15 phút Nếu pha môi trường TSA thì bổ sung thêm 17,5g agar

Thành phần đệm PBS 10X

NaH2PO4.2H2O 10,14g

Na2HPO4.12H2O 51,93g

Pha đệm: cân tất cả thành phần trên hòa tan trong nước cất để được 1l dung dịch đệm PBS 10X

Pha PBS 1X: 100 ml đệm PBS 10X + 900 ml nước cất  1000 ml PBS 1X

Pha amonium sulfate bão hòa 100%S: cân 767g (NH4)2SO4 hòa trong 1l nước cất Hỗn hợp được khuấy từ có đun nóng cho tan hết muối, bảo quản ở nhiệt độ phòng

Pha amonium sulfate bão hòa 45%S:

450 ml (NH4)2SO4 100%S + 550 ml PBS 1X  1000 ml (NH4)2SO4 45%S

Hình 7.1 Thỏ nuôi thí nghiệm Hình 7.2 Lấy máu tĩnh mạch tai

Hình 7.3 Tiêm dưới da