15 2.2.3.2. Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên vỏ K Kháng nguyên K nằm ở bề mặt tế bào nên là nguyên nhân không tạo ra phản ứng ngƣng kết kháng nguyên O. Hiện nay ngƣời ta đã phát hiện hơn 100 loại kháng nguyên K (Øiskov et al, 1971) [9]. Kauffmann chia kháng nguyên K thành 3 nhóm dựa vào ảnh hƣởng của nhiệt độ đến phản ứng ngƣng kết, tính kháng nguyên và khả năng vi khuẩn gắn kết với kháng thể. a. Kháng nguyên K type L Là kháng nguyên vỏ có bản chất protein, giúp vi khuẩn có khả năng bám dính và cho phản ứng ngƣng kết với hồng cầu. Là kháng nguyên không chịu nhiệt, bị phá hủy sau khi đun nóng 100 o C trong 1h. Do đó, sau khi đun nóng huyễn dịch vi khuẩn có thể gây ngƣng kết với kháng huyết thanh O mà không gây ngƣng kết với kháng huyết thanh K. b. Kháng nguyên K type A Là kháng nguyên vỏ có bản chất là polysaccharide, vi khuẩn có kháng nguyên này khi mọc trên môi trƣờng sẽ cho khuẩn lạc dạng nhầy và chỉ cho kết quả ngƣng kết của kháng nguyên O sau khi huyễn dịch vi khuẩn đã đƣợc đun nóng 121 o C trong 2h. c. Ngoài ra còn một nhóm kháng nguyên K type B, nhƣng sự tồn tại của nhóm KN này chƣa đƣợc xác định chính xác. 2.2.3.3. Kháng nguyên lông roi H Là kháng nguyên có bản chất protein, không bền với nhiệt độ, bị hủy bởi cồn nhƣng đề kháng với formone. Kháng nguyên này có ở những dòng E. coli di động. Theo Morris J.A. (1985) và Sussman M. (1985), hiện nay ngƣời ta đã phát hiện đƣợc 56 loại kháng nguyên H (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Hải, 1999). 2.3. TÁCH KHÁNG THỂ BẰNG AMMONIUM SULFATE [10] [11] Kháng huyết thanh thu đƣợc không những chứa kháng thể mà còn có một số chất khác. Để tách kháng thể ra khỏi kháng huyết thanh ta có thể dùng phƣơng pháp sắc kí, kết tinh hay tủa trong muối… Phƣơng pháp tủa kháng thể trong amonium sulfate là một trong những phƣơng pháp phổ biến nhất để tách protein ra khỏi dung dịch. Trong dung dịch, protein liên kết với nƣớc bằng các liên kết hydrogen thông qua các nhóm ion tích điện của chúng. Khi ta thêm vào một lƣợng lớn các ion nhỏ, tích điện lớn nhƣ amonium hay sulfate thì 16 những nhóm này cạnh tranh với protein để gắn vào các phân tử nƣớc, do đó làm giảm khả năng hòa tan của protein và chúng kết tủa lại. Protein kết tủa có thể hòa tan lại trong môi trƣờng có nồng độ amonium sulfate thấp hơn. Khả năng kết tủa của các protein khác nhau thì khác nhau tùy thuộc vào số lƣợng và vị trí các nhóm cực tích điện, trọng lƣợng phân tử của protein, pH của dung dịch, nhiệt độ xảy ra sự kết tủa. Để tủa kháng thể ngƣời ta thƣờng sử dụng amonium sulfate (đôi khi dùng sodium sulfate). Nồng độ muối để kháng thể kết tủa ở các loài khác nhau thì khác nhau. Hầu hết các kháng thể của thỏ có thể kết tủa ở dung dịch muối bão hòa 40%, còn ở chuột phải từ 45-50%. Bởi vì hầu hết các thành phần khác của huyết thanh không kết tủa ở khoảng nồng độ muối này và không có sự khác biệt lớn giữa hai nồng độ trên nên nồng độ muối bão hòa 50% là mức thích hợp nhất cho hầu hết các ứng dụng khác nhau. Một điểm bất lợi của kháng thể tủa trong amonium sulfate bão hòa là kháng thể không đƣợc tinh sạch vì khi kết tủa ngoài kháng thể còn có các phân tử protein có trọng lƣợng phân tử lớn khác. Do đó, ngoài việc tủa trong muối amonium sulfate cần phải kết hợp với một số phƣơng pháp khác nếu yêu cầu kháng thể cuối cùng phải đƣợc tinh sạch hoàn toàn. 2.4. HỒI CHẾ KHÁNG THỂ BẰNG PHƢƠNG PHÁP THẨM TÍCH [7] Một trong các phƣơng pháp cổ điển để loại muối ra khỏi protein kháng thể là thẩm tích. Dung dịch protein đƣợc chứa trong bao thẩm tích làm bằng cellulose có thắt nút ở hai đầu. Bao này đƣợc đặt trong cốc lớn chứa dung dịch đệm có ái lực thấp và để ở nhiệt độ lạnh có khuấy trộn vừa phải. Trên bao thẩm tích có những lỗ nhỏ cho phép những phân tử muối có kích thƣớc nhỏ đi ra ngoài còn các phân tử protein kháng thể có kích thƣớc lớn đƣợc giữ lại trong bao thẩm tích. Sự khuếch tán các phân tử muối vào trong dung dịch đệm thẩm tích vẫn tiếp tục cho đến khi nồng độ muối bên trong và bên ngoài bao thẩm tích đạt trạng thái cân bằng (thƣờng khoảng 5-6 giờ). Nếu sau khi đạt trạng thái cân bằng mà dung dịch protein chƣa loại hết muối thì ta đặt bao thẩm tích trên vào một dung dịch đệm mới và cứ tiếp tục nhƣ thế cho đến khi loại hết muối ra khỏi dung dịch protein. Trong quá trình thẩm tích, ngoài muối còn có các chất chuyển hóa có kích thƣớc nhỏ nhƣ ATP, coenzyme… cũng bị loại ra khỏi bao thẩm tích. 17 Hình 2.8 Trên bao thẩm tích có các lỗ nhỏ cho phép các phân tử muối đi ra ngoài còn KT bị giữ lại. (http://www.bio.mtu.edu/campbell/bl482/lectures/lec5/482w52.htm) 2.5. PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ [2] [5] 2.5.1. Các lực liên kết kháng nguyên – kháng thể (KN-KT) Sự liên kết một paratop của KT với một epitop của KN tƣơng ứng đƣợc thiết lập và duy trì nhờ các lực hấp dẫn có năng lƣợng nhỏ (<10 Kcal/mol) nhƣng không phải là liên kết cộng hóa trị. Các lực liên kết KN-KT: Lực tĩnh điện giữa các nhóm COO - và NH 3 + đối diện nhau của acid amin trong các chuỗi polypeptid. Các liên kết hydro giữa các nguyên tử H + và N - hoặc O - Các liên kết kị nƣớc giữa các acid amin kị nƣớc. Lực Van der Waals do sự di động của các điện tử giữa hai phân tử . 2.5.2. Các đặc tính chung của sự liên kết KN-KT Sự liên kết KN-KT có 3 đặc điểm là: phản ứng phát nhiệt, có tính đặc hiệu và thuận nghịch Phản ứng phát nhiệt Sự liên kết giữa các KN-KT là một phản ứng phát nhiệt, giải phóng ra năng lƣợng từ khoảng 2 đến 40 Kcal/mol. 18 Tính đặc hiệu Tính đặc hiệu của phản ứng KN-KT thể hiện ở chỗ một vị trí paratop của KT chỉ kết hợp với một epitop của KN do đó nếu ta biết một trong hai yếu tố của phản ứng KN-KT thì có thể nhận biết đƣợc yếu tố còn lại. Tuy nhiên tính đặc hiệu của phản ứng chỉ là tƣơng đối. Tính chất thuận nghịch Phức hệ KN-KT có thể bị phân li do nhiệt, môi trƣờng acid (pH<3), hoặc do môi trƣờng có lực ion cao. Do đó có thể rửa chiết để tách riêng KT in vitro ngay cả khi phức hệ KN-KT đƣợc hình thành in vivo. 2.5.3. Phản ứng ngƣng kết KN-KT Vì KT hòa tan trong dung dịch nên đặc tính của phản ứng KN-KT phụ thuộc rất lớn vào hình dạng KN. Nếu KN ở dạng hạt (vi khuẩn hoặc hồng cầu) kết hợp với KT tƣơng ứng sẽ tạo thành các hạt ngƣng kết thấy đƣợc bằng mắt thƣờng. 2.5.3.1. Phản ứng ngƣng kết KN-KT xảy ra theo 2 pha Pha thứ nhất: đặc trƣng bởi sự gắn phần Fab của KT với các quyết định KN trên bề mặt KN dạng hạt nên không nhìn thấy đƣợc bằng mắt thƣờng. Pha này xảy ra nhanh đƣợc gọi là pha đặc hiệu hay pha không nhìn thấy. Pha thứ hai: đặc trƣng bởi sự liên kết chéo của các kháng thể đa hóa trị, các KN dạng hạt đa hóa trị để tạo thành dạng khối đủ lớn có thể quan sát bằng mắt thƣờng. Pha này xảy ra chậm hơn và theo nguyên lí lí hóa đơn thuần, nên còn gọi là pha không đặc hiệu hay pha nhìn thấy đƣợc. Mạng lƣới ngƣng kết chỉ có thể hình thành đối với các KT có ít nhất hai hóa trị. KT IgG khó xảy ra phản ứng ngƣng kết hơn so với KT IgM, vì IgG chỉ có hai vị trí gắn kết với KN trong khi đó IgM có tới năm vị trí liên kết với KN. Khả năng ngƣng kết của IgM cao hơn 100 lần so với IgG. 19 (A) Không xảy ra khi cả hai vị trí của IgG đều gắn vào một thể vi khuẩn. (B) Xảy ra khi IgG trở thành cầu nối giữa các thể vi khuẩn. (C) Rất dễ xảy ra khi kháng thể là loại IgM. Hình 2.9 Phản ứng ngƣng kết do kháng thể tạo nên (trích dẫn liệu của Lê Văn Hùng, 2002) [2] 2.5.3.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng ngƣng kết KN-KT pH Thời gian và nhiệt độ ủ KT IgM phản ứng tốt ở 4 – 22 o C KT IgG phản ứng tốt ở 37 o C. Nồng độ KN và KT Lực ion (nồng độ của muối): nếu giảm lực ion thì sự hấp thụ KT đƣợc tăng cƣờng. Trở ngại do sự sắp xếp các phân tử trong không gian (Steric Hindrance): khi các KN khác nhau nằm sát nhau thì các KT tƣơng ứng với mỗi loại KN có thể cản trở sự gắn kết do sự cạnh tranh với các phân tử khác. 2.6. PROTEIN A Protein A là một loại protein bề mặt của thành tế bào Staphylococcus aureus có khối lƣợng phân tử 42 kDa. Nó gắn với vùng hằng định của immunoglobulin. Phân tử này có thể gắn với KT ở hai vị trí Fcγ (vùng hằng định của IgG liên quan đến chức 20 năng phản ứng lại kích thích) và Fab (đoạn Ig chịu trách nhiệm cho việc nhận biết KN). Protein A gắn vào vùng hằng định thứ hai và thứ ba trên mảnh Fc của chuỗi nặng (Deisenhofer, 1981) nên mỗi phân tử IgG có hai vị trí gắn với protein A. Bởi vì mỗi protein A có 4 vị trí có thể gắn kết với IgG (Sjödahl, 1997) nên sự kết hợp hai dạng protein này tạo ra nhiều dạng phức hợp khác nhau. Không phải tất cả các immunoglobulin gắn protein A với cùng ái lực. KT của ngƣời, thỏ và chuột lang gắn với ái lực mạnh nhất và giảm dần ở heo, chuột, ngựa, bò cái (Kronvall et al. 1970; Goudswaard et al. 1978). KT từ dê, chuột (rat), gà, chuột đồng (hamster) gắn với lực yếu hơn nhiều. Ngoài ra trong một loài các lớp immunoglobulin khác nhau gắn protein A cũng với ái lực khác nhau. Ví dụ trong lớp IgG của ngƣời thì IgG 1 , IgG 2 , IgG 4 gắn protein A với ái lực cao trong khi đó IgG 3 gắn với ái lực rất yếu. Tƣơng tự ở chuột IgG 2a gắn với ái lực cao, IgG 2b , IgG 3 gắn với ái lực trung bình còn IgG 1 gắn với ái lực rất yếu (Ey et al, 1978). Nhƣng sự khác biệt này không quan trọng đối với KT đa dòng vì trong kháng huyết thanh đa dòng có chứa tất cả các phân lớp của IgG chống lại KN. Sự gắn kết KT với protein A đƣợc ứng dụng để tinh sạch KT bằng phƣơng pháp sắc kí. Protein A đƣợc gắn vào giá đỡ bằng cyanogen bromide đƣợc cung cấp bởi nhà sản xuất ( ví dụ: protein A – Sepharose CL- 4B; Pharmacia). Mỗi ml phức hợp trên có thể gắn với 10-20 mg IgG (tƣơng đƣơng với 1-2 ml kháng huyết thanh). Kháng thể gắn với protein A chủ yếu là nhờ các tƣơng tác kị nƣớc (Deisenhofer, 1981) và có thể bị phá vỡ ở pH thấp. Ngoài ra sử dụng KT gắn với protein A để thực hiện phản ứng ngƣng kết với KN thì hạt ngƣng kết sẽ lớn hơn rất nhiều lần so với khi không có protein A. Hình 2.10 Kháng thể IgG gắn với protein A của S. aureus. http://www.cvm.uiuc.edu/courses/ vp331/Staphylococci/proteinA.gif 21 PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 3.1.1. Thời gian: từ 2/2005 đến 8/2005 3.1.2. Địa điểm Phòng Miễn dịch viện Pasteur Tp. HCM Bệnh xá Thú y Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM Phòng thí nghiệm Vi Sinh. 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Thu nhận và tinh sạch kháng thể. Hiệu quả đáp ứng miễn dịch theo các quy trình tiêm khác nhau: ngắn ngày và dài ngày. 3.3. VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM Thỏ: 6 con Vi khuẩn E.coli gây bệnh phù đầu ở heo (chủng O139:K82 hay H28), vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy trên heo (K88 + hay E68). Vi khuẩn Staphylococcus aureus Hoá chất môi trƣờng Muối amonium sulfate (NH 4 ) 2 SO 4 NaH 2 PO 4 .2H 2 O Na 2 HPO 4 .12H 2 O Natri clorua NaCl Sodium azide NaN 3 PBS Môi trƣờng TSB Thiết bị và dụng cụ Máy khuấy từ Máy li tâm Syringe loại 1 ml, 20 ml 22 Ống falcon 50 ml 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ 3.4.1.1. Chuẩn bị dịch tiêm Dịch vi khuẩn đƣợc chuẩn bị theo sơ đồ 3.1 Sơ đồ 3.1 Qui trình tạo dịch huyền phù kháng nguyên E. coli (theo rskov, 1977) 3.4.1.2. Tiêm thú thí nghiệm Đƣờng tiêm: tiêm dƣới da Hàm lƣợng vi khuẩn khoảng 10 9 CFU/ml dịch tiêm. Thỏ thí nghiệm đƣợc tiêm theo 2 qui trình ngắn ngày và dài ngày. Bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày qua bảng 3.1 và 3.2 Nuôi E. coli chủng gốc (O139:K82) trong môi trƣờng canh TSB Cấy trên đĩa petri môi trƣờng thạch TSA ủ 37 o C qua đêm ủ 37 o C qua đêm Rửa trong 10 ml nƣớc muối sinh lí Dịch rửa Li tâm bỏ dịch nổi (4000 vòng/phút trong 30 phút) Rửa trong 10 ml nƣớc muối sinh lí Li tâm bỏ dịch nổi Hòa tan trong nƣớc muối chứa 0,3 % (v/v) formalin Dịch huyền phù kháng nguyên E. coli Hòa tan trong nƣớc muối sinh lí, điều chỉnh sao cho đạt nồng độ 10 9 tế bào/ml để 4 o C qua đêm Li tâm bỏ dịch nổi 23 3.4.1.3. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: qui trình ngắn ngày gây đáp ứng miễn dịch (qui trình 1) Số thỏ thí nghiệm: 2 con (thỏ 1 và 2) Bảng 3.1 Gây miễn dịch thu kháng thể theo qui trình ngắn ngày (theo rskov, 1977) Ngày Tiêm (ml) Lấy máu (ml) 0 1 Mũi gây mẫn cảm 1 0,5 4 1 Mũi nhắc lại 1 5 1 9 1 Mũi nhắc lại 2 10 2 14 1 Mũi nhắc lại 3 15 2 19 1 Mũi nhắc lại 4 20 2 25 40 30 40 35 Lấy hết Các lần lấy máu 1 ml để kiểm tra sự hiện diện của kháng thể trong kháng huyết thanh bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính. Thí nghiệm 2: qui trình dài ngày gây đáp ứng miễn dịch (qui trình 2) Số thỏ thí nghiệm: 4 con (thỏ 2,3,4 và 5) . dịch vi khuẩn có thể gây ngƣng kết với kháng huyết thanh O mà không gây ngƣng kết với kháng huyết thanh K. b. Kháng nguyên K type A Là kháng nguyên vỏ có bản chất là polysaccharide, vi khuẩn. (chủng O139:K82 hay H28), vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy trên heo (K88 + hay E6 8). Vi khuẩn Staphylococcus aureus Hoá chất môi trƣờng Muối amonium sulfate (NH 4 ) 2 SO 4 NaH 2 PO 4 .2H 2 O. giữ lại. (http://www.bio.mtu.edu/campbell/bl482/lectures/lec5 /48 2w52.htm) 2.5. PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ [2] [5] 2.5.1. Các lực liên kết kháng nguyên – kháng thể (KN-KT) Sự liên kết