Luận văn : THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli part 3 pptx

6 2.1.4.3. Kháng nguyên a. Tính lạ của kháng nguyên Điều kiện quan trọng để một kháng nguyên có tính sinh miễn dịch cao là sự khác biệt chủng loài giữa túc chủ và kháng nguyên. Trong miễn dịch dịch thể, kháng nguyên càng lạ với túc chủ bao nhiêu, khả năng sinh miễn dịch càng cao bấy nhiêu. Còn trong miễn dịch qua trung gian tế bào, chỉ cần sự khác nhau giữa các cá thể cũng gây đáp ứng miễn dịch cao. b. Cấu tạo hóa học của kháng nguyên  Protein và polysaccharide Là 2 nhóm kháng nguyên thông thƣờng nhất vì các vỏ vi khuẩn hoặc các độc tố là các protein hoặc glycoprotein. Chúng đều cho tính miễn dịch cao khi ở dạng hòa tan hay liên kết trong các cấu trúc phức tạp. Đặc tính kháng nguyên của nhiều loại glycoprotein trƣớc hết đƣợc biểu hiện bởi các phần gốc đƣờng của chúng. Protein ở dạng kết tụ (aggregation) gây đáp ứng miễn dịch tốt hơn protein ở dạng hòa tan.  Lipid và acid nucleic Là 2 nhóm kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch kém. Thông thƣờng, lipid chỉ biểu hiện tính kháng nguyên khi ở dạng kết hợp với polysaccharide hoặc protein… c. Kích thước của phân tử kháng nguyên Kháng nguyên có kích thƣớc lớn và cấu trúc càng phức tạp thì chúng càng dễ bị đại thực bào phát hiện và xử lí nên có tính sinh miễn dịch cao, những kháng nguyên có cấu trúc phân tử nhỏ dễ bị đại thực bào bỏ qua nên có tính sinh miễn dịch thấp. Ngoài ra, các KN có kích thƣớc nhỏ có thể gắn với các protein mang để tạo đáp ứng miễn dịch. d. Khả năng bị chuyển hóa của phân tử kháng nguyên Sự chuyển hóa kháng nguyên trong cơ thể vật chủ là yếu tố quan trọng cho tính sinh miễn dịch, vì khi đƣợc chuyển hóa các kháng nguyên dễ bộc lộ các quyết định KN ra ngoài. Các phân tử không bị phân hủy bởi tế bào (không đƣợc tế bào nhận biết và cải biến) thì không gây ra đáp ứng miễn dịch. 7 Ví dụ: D-amino acid là một kháng nguyên yếu vì enzyme của động vật hữu nhũ không phân hủy amino acid dạng này. e. Liều lượng kháng nguyên Nếu lƣợng kháng nguyên quá ít thì không đủ gây đáp ứng miễn dịch. Ngƣợc lại nếu lƣợng kháng nguyên nhiều quá sẽ gây ức chế miễn dịch. Ở các mũi nhắc nên giảm lƣợng kháng nguyên 2 – 3 lần so với gây mẫn cảm để tăng ái lực của kháng thể cần tạo nên. f. Đường xâm nhập của kháng nguyên vào cơ thể Kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch mạnh nhất khi chúng đƣợc tiêm trực tiếp vào hạch bạch huyết vùng kheo của thú. Tuy nhiên cách này đòi hỏi trình độ tay nghề cao. Tiêm kháng nguyên nhiều mũi dƣới da, trong da hoặc tiêm một mũi trong bắp thịt đƣợc áp dụng rộng rãi hơn vì đơn giản dễ thực hiện và cho kết quả mong muốn. Ngoài ra với các kháng nguyên mạnh (vi khuẩn, virus, tế bào…) khi đƣa vào đƣờng mạch máu có thể dễ dàng gây ra đáp ứng miễn dịch. Nhƣng với kháng nguyên hòa tan thì phải có qui trình gây đáp ứng miễn dịch thích hợp, tốt nhất là tiêm trong da, dƣới da và phải tiêm nhắc lại nhiều lần. g. Hiệu ứng cộng lực kháng nguyên Nếu cùng một lúc gây mẫn cảm nhiều loại kháng nguyên cho con thú thì kháng thể đặc hiệu đƣợc sinh ra tƣơng ứng với mỗi loại kháng nguyên sẽ ít nhất ngang bằng hoặc nhiều hơn khi kháng nguyên đó kích thích một mình. Hiện tƣợng này gọi là sự cộng lực kháng nguyên hay cộng kích thích kháng nguyên. Tuy nhiên cũng có trƣờng hợp cùng một lúc gây mẫn cảm cho thú với hai loại kháng nguyên: một liều mạnh, một liều nhẹ thì con thú có thể chỉ phản ứng với kháng nguyên liều mạnh. Hiện tƣợng này gọi là sự cạnh tranh kháng nguyên, chỉ xảy ra ở hai kháng nguyên có cấu trúc hóa học gần giống nhau. 2.1.4.4. Qui trình gây miễn dịch Qui trình gây miễn dịch có ảnh hƣởng lớn đến đáp ứng miễn dịch đối với phân tử kháng nguyên. Cùng một loại kháng nguyên, gây miễn dịch trên hai lô thí nghiệm qua hai qui trình chủng ngừa khác nhau thì đáp ứng miễn dịch cũng khác nhau. Mỗi loại kháng nguyên thích hợp với một loại qui trình gây miễn dịch riêng. Với những kháng nguyên yếu thƣờng phải chủng ngừa bằng qui trình hết sức nghiêm ngặt và chủng 8 nhiều lần mới có đáp ứng miễn dịch mạnh. Trong khi đó, những kháng nguyên mạnh có khi chỉ cần chủng ngừa một lần cũng gây đáp ứng miễn dịch. Nếu cho mẫn cảm kháng nguyên với một con vật đã đƣợc mẫn cảm với kháng nguyên đó một lần, thì hàm lƣợng kháng thể sẽ tăng sớm và nhiều hơn lần đầu (có những trƣờng hợp gấp hàng trăm lần). Ngoài ra khi tiêm nhắc lại nhiều lần thì sẽ có sự chọn lọc các dòng tế bào lympho B sản xuất kháng thể và chỉ tăng sinh những dòng sản xuất kháng thể có ái lực cao với kháng nguyên nếu giới hạn tối đa kháng nguyên đƣa vào. Thƣờng tiêm mũi nhắc lại lần một sau khi đáp ứng miễn dịch ở mũi gây mẫn cảm giảm xuống (đối với thỏ khoảng 4-6 tuần). Các mũi tiêm nhắc lại tiếp theo nên cách nhau một khoảng thời gian nhất định để thú có khả năng đáp ứng miễn dịch cao nhất với kháng nguyên. Khoảng 10-15 ngày sau mỗi lần tiêm nhắc lại ta có thể lấy máu (20-40 ml), kháng huyết thanh nên đƣợc kiểm tra sự hiện diện của kháng thể. Nếu thú đáp ứng miễn dịch yếu sau mũi nhắc lại lần hai thì nên loại bỏ. 2.1.4.5. Chất bổ trợ Các tá chất đƣợc sử dụng rộng rãi để tăng hiệu quả của các loại vaccine, tăng khả năng thực bào của đại thực bào đối với kháng nguyên. Ngoài ra, tá chất còn gây một phản ứng viêm không đặc hiệu làm tăng tính sinh miễn dịch. Các nghiên cứu gần đây đã kết luận tá chất có tác dụng làm tăng lympho hỗ trợ (lympho T helper - T H ). Khi bổ sung tá chất vào kháng nguyên sẽ làm kháng nguyên tồn tại lâu hơn trong cơ thể túc chủ. Kháng nguyên đƣợc giải phóng dần dần có tác dụng giống nhƣ kích thích miễn dịch nhiều lần. Một số loại tá chất: Freund’s Complete Adjuvant (FCA) và Freund’s Incomplete Adjuvant (FIA), Aluminum hydroxide (ALUM), Rabi Adjuvant System (RAS), Syntex Adjuvant Formulation (SAF)… 9 2.1.5. Cơ chế đáp ứng miễn dịch dịch thể [3] [6] [8] [13] 2.1.5.1. Các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch dịch thể a. Tế bào trình diện kháng nguyên (APC: antigen-presenting cell) Tế bào trình diện kháng nguyên có 2 đặc tính: có các kháng nguyên phù hợp tổ chức chính lớp II (Major histocompatibility complex class II antigens – MHC class II antigens) trên bề mặt tế bào và tiết interleukine 1 (IL-1) (ngoài ra nó còn tiết nhiều cytokine khác. Có 2 nhóm tế bào trình diện kháng nguyên:  Tế bào trình diện kháng nguyên “chuyên nghiệp” (“professional” APC): chủ động bắt và trình diện KN. Bao gồm các tế bào: đại thực bào, tế bào tua (dendritic cell), tế bào B.  Các tế bào khác, chỉ trình diện kháng nguyên khi tế bào bị nhiễm. Khi xâm nhập vào cơ thể các KN đƣợc các APC “chuyên nghiệp” tóm bắt bằng cách thực bào (đại thực bào) hay gắn với các thụ quan đặc hiệu (specific receptor) Ig trên bề mặt tế bào (tế bào B). Đối với KN protein ngoại bào Sau khi các APC bắt giữ KN, KN sẽ đƣợc đƣa vào các nang endosome bên trong tế bào. Các APC cũng có thể ẩm bào để hút các protein hòa tan (kích thƣớc ≤ 1 µm) vào các endosome này. Ở đây, các KN sẽ đƣợc xử lí trong khu vực acid nội bào nhờ các protease phân cắt protein thành các peptid ngắn. Các peptid thẳng này gắn với phân tử MHC lớp II tạo thành phức hợp kháng nguyên – MHC (KN – MHC) và đƣợc biểu lộ trên bề mặt tế bào (hình 2.2). Đối với KN có bản chất là lipid hoặc polysaccharide (KN không phụ thuộc tuyến ức) Các KN này chỉ trình diện đƣợc với tế bào B và không thể xử lí đến dạng kết hợp đƣợc với các phân tử MHC nên không đƣợc các tế bào T nhận biết, không gây đƣợc các đáp ứng miễn dịch tế bào. Ngoài ra khi KN bị bắt giữ vào trong tế bào APC nó sẽ kích thích tế bào tiết ra interleukin 1 hay còn gọi là yếu tố hoạt hóa tế bào lympho LAF (lymphocyte activating factor) là một trong hai yếu tố cần thiết để hoạt hóa tế bào lympho T H (yếu tố kia là sự nhận biết phức hợp KN-MHC của thụ thể tế bào T). 10 b. Tế bào lympho T H Quần thể tế bào lympho T đƣợc kháng nguyên trình diện gọi là tế bào lympho T hỗ trợ (helper T cell – T H ) Tế bào lympho T đƣợc hoạt hóa khi có khoảng 200 – 300 phức hợp KN – MHC gắn với phức hợp thụ thể TCR/CD4 + trên bề mặt tế bào lympho T (T cell receptor – TCR) và sự hiện diện của yếu tố đồng kích thích interleukin 1 (tùy loại tế bào lympho T H ). Khi đƣợc kích thích, tế bào T H tiết ra hỗn hợp các cytokine cần thiết cho sự tăng sinh và biệt hóa tế bào B thành tế bào plasma sản xuất kháng thể. c. Tế bào lympho B Tế bào lympho B là tế bào sinh kháng thể, quá trình biệt hóa tế bào B thành tế bào tƣơng (plasma cell) sản xuất kháng thể có thể chia thành 2 giai đoạn:  Giai đoạn 1: các tế bào nguồn trong tủy xƣơng đƣợc biệt hóa thành tiền lympho B, sau đó thành các lympho B chƣa chín và cuối cùng phát triển thành lympho B chín với các immunoglobulin bề mặt SIg (Surface immunoglobulin). Giai đoạn này không cần sự kích thích của kháng nguyên và sự có mặt của tế bào lympho T H . Hình 2.2 KN đƣợc tế bào B tóm bắt, phân cắt, gắn với MHC lớp II và biểu lộ trên bề mặt tế bào. (trích dẫn liệu của Tizard, 1992) [13] Hình 2-1 KN đƣợc tế bào B tóm bắt, phân cắt, gắn với MHC lớp II và biểu Hình 2.3 Phức hợp KN- MHC lớp II gắn với phức hợp thụ thể TCR/CD4 + trên tế bào T H . (trích dẫn liệu của Tizard, 1992) [13] Hình 2-1 KN đƣợc tế bào B tóm bắt, 11  Giai đoạn 2: các tế bào lympho B chín biệt hóa thành tế bào tƣơng sản xuất kháng thể. Quá trình này cần sự kích thích của kháng nguyên, một số interleukin và sự kết hợp của tế bào T H với lympho B. Tế bào plasma là những tế bào hình trứng, đƣờng kính 8-9 µm, có nhân tròn lập dị với các chromatin không đồng dạng. Chúng có tế bào chất lớn với mạng lƣới nội chất hạt dày đặc (hình 2.4). Hình 2.4 Cấu trúc đặc trƣng của tế bào plasma (trích dẫn liệu của Tizard, 1992) [13] 2.1.5.2. Cơ chế hình thành đáp ứng miễn dịch dịch thể a. Đối với kháng nguyên phụ thuộc vào tuyến ức (KN có bản chất protein) Khi KN xâm nhập vào cơ thể, chúng bị các tế bào trình diện KN bắt giữ, phân cắt chúng thành những đoạn nhỏ và gắn vào các phân tử MHC lớp II tạo thành phức hợp kháng nguyên – phân tử MHC (KN-MHC) biểu lộ trên bề mặt tế bào APC. Đồng thời KN cũng kích thích APC tiết IL-1. Phức hợp KN-MHC và IL-1 đƣợc nhận biết bởi phức hợp thụ thể TCR/CD4 + và thụ thể IL-1 trên bề mặt tế bào T H . Khi đó tế bào lympho T đƣợc hoạt hóa sẽ tăng sinh và tiết IL-2, IL-4, IL-5 để kích thích sự phát triển của tế bào B thành tế bào plasma sản xuất immunoglobulin. Khi kháng nguyên gắn với SIg thích hợp trên tế bào B chín với sự hiện diện của tế bào T H , IL-2, IL-4 thì tín hiệu đƣợc truyền vào trong tế bào. Lúc này tế bào B sẽ trải qua quá trình tăng sinh và biệt hóa thành dòng tế bào plasma tổng hợp kháng thể dịch thể hay immunoglobulin, chúng có cấu trúc giống nhƣ SIg mà KN đã chọn lọc để gắn 12 nhƣng với ái tính cao hơn khi kết hợp với KN đặc hiệu. Tế bào plasma có khả năng tổng hợp 300 phân tử Ig mỗi giây. IgM là loại KT xuất hiện đầu tiên khi cơ thể bị kích thích bởi KN, sau đó một vài ngày thì IgG, IgA và IgE xuất hiện (trong đó IgG là chủ yếu) và dần thay thế IgM. Thông thƣờng khi IgG xuất hiện thì IgM sẽ tiêu biến, nhƣng cũng có trƣờng hợp IgM tồn tại rất lâu (ví dụ KT IgM chống lại KN O của vi khuẩn Samonella). Trong khi một số biệt hóa thành tế bào plasma thì một số tế bào B khác chuyển thành tế bào nhớ giúp cho đáp ứng lần sau với chính KN đó nhanh hơn và mạnh hơn. Đáp ứng thứ phát: khi có sự tiếp xúc với kháng nguyên lần đầu và nếu cho tiếp xúc lần sau với chính kháng nguyên đó thì KN gắn với các thụ thể tƣơng ứng là các phân tử KT trên bề mặt của tế bào B nhớ làm tế bào nhớ tăng sinh và biệt hoá thành tế bào plasma sản xuất KT do đó chúng ta sẽ thấy rõ hàm lƣợng kháng thể tăng nhanh và cao hơn nhiều lần so với lần đầu. Hình 2.5 Đáp ứng của tế bào B với kháng nguyên và mối liên hệ giữa sự đáp ứng này với hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh. (http://www.uccs.edu/~rmelamed/MicroFall2002/Chapter%2017/Antibody%20Time% 20Course.jpg) 13 b. Đối với kháng nguyên không phụ thuộc vào tuyến ức KN không phụ thuộc vào tuyến ức thƣờng là các trình tự polimer lặp lại nhƣ lipopolysaccharide của Escherichia coli, flagellin của Salmonella, vỏ polysaccharide của vi khuẩn Pneumococcus, dextrans, levans và polyglutamic acid. Bởi vì chúng là những trình tự polimer lặp lại nên một phân tử có thể gắn với nhiều thụ thể immunoglobulin trên bề mặt tế bào B do đó không cần tế bào T helper cung cấp thêm tín hiệu để gây ra đáp ứng tạo kháng thể của tế bào B nhƣ KN phụ thuộc vào tuyến ức (hình 2.6). KN không phụ thuộc tuyến ức gắn trực tiếp vào các SIg trên bề mặt tế B và kích thích tế bào B tiết ra kháng thể. Kháng nguyên không phụ thuộc vào tuyến ức chỉ gây ra đáp ứng tạo IgM ở tế bào B và không biệt hóa thành tế bào nhớ vì chúng không kích hoạt tế bào T helper tiết interleukine nên không chuyển từ sản xuất IgM sang IgG. Nhƣ vậy, đối với KN không phụ thuộc tuyến ức, đáp ứng thứ phát không tạo ra lƣợng KT nhiều hơn đáp ứng nguyên phát (hình 2.7). Hình 2.7 Đáp ứng tạo kháng thể khác nhau tùy vào KN phụ thuộc tuyến ức hay không phụ thuộc tuyến ức. KN không phụ thuộc vào tuyến ức không gây ra sự thay đổi từ sản xuất IgM sang IgG. (trích dẫn liệu của Tizard, 1992) [13] Hình 2.6 Sự khác biệt giữa KN phụ thuộc tuyến ức và KN không phụ thuộc tuyến ức trong kích hoạt đáp ứng ở tế bào B. (trích dẫn liệu của Tizard, 1992) [13] 14 2.2. VI KHUẨN E. coli [1] [9] 2.2.1. Định nghĩa Escherichia coli còn đƣợc gọi là faecal coli, thuộc nhóm coliform phân, có hình que, gram âm, có kích thƣớc khoảng 2-3 x 1,5 ; có khả năng di động nhờ các tiên mao, không tạo bào tử, hiếu khí hoặc hiếu khí tùy nghi. Chúng có mặt thƣờng xuyên trong ruột của động vật và ngƣời, ở phần cuối của ruột non hoặc ruột già. 2.2.2. Đặc tính sinh hóa Có khả năng phát triển ở 44 o C. Lên men đƣờng glucose, lactose, manitol, sorbitol, phản ứng -galactosidase dƣơng tính. Indol dƣơng tính, methyl red dƣơng tính, Voges-Proskauer âm tính, citrate âm tính. Không sử dụng phenylalanin, ure, gelatin, KCN (potasium cyanic), malonate, adonitol, inositol, không sinh H 2 S. Do đó, E. coli đƣợc phát hiện do khả năng lên men lactose và sinh hơi ở 44 o C, có kết quả nghiệm pháp IMViC phù hợp. 2.2.3. Yếu tố kháng nguyên 2.2.3.1. Kháng nguyên thân O Các kháng nguyên O có bản chất lipopolysacharide (LPS). Những kháng nguyên này bền với nhiệt độ và cồn. Theo Leminor, kháng nguyên O thƣờng đặc trƣng cho từng loài (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Hải, 1999). Các kháng nguyên O có thể đƣợc phát hiện bằng phản ứng ngƣng kết. Để thực hiện phản ứng này, huyễn dịch vi khuẩn phải đƣợc đun nóng ở nhiệt độ 100 o C trong vòng 1 giờ, sau đó cho thử với phản ứng với kháng huyết thanh đặc hiệu. Chúng giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của các dòng vi khuẩn và một trong số các kháng nguyên này có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ. Hiện nay ngƣời ta đã phát hiện hơn 160 loại kháng nguyên O (R.J.Gross và B.Rowe, 1985) [9]. . thƣờng là các trình tự polimer lặp lại nhƣ lipopolysaccharide của Escherichia coli, flagellin của Salmonella, vỏ polysaccharide của vi khuẩn Pneumococcus, dextrans, levans và polyglutamic acid 1992) [ 13] 14 2.2. VI KHUẨN E. coli [1] [9] 2.2.1. Định nghĩa Escherichia coli còn đƣợc gọi là faecal coli, thuộc nhóm coliform phân, có hình que, gram âm, có kích thƣớc khoảng 2 -3 x. đáp ứng này với hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh. (http://www.uccs.edu/~rmelamed/MicroFall2002/Chapter%2017/Antibody%20Time% 20Course.jpg) 13 b. Đối với kháng nguyên không phụ thuộc