33 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ 4.1.1. Định tính Để xác định thời điểm xuất hiện và thời gian tồn tại của kháng thể trong kháng huyết thanh (KHT) ta thực hiện phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với KHT thu đƣợc sau khi li tâm tách huyết thanh. 4.1.1.1. Qui trình ngắn ngày (35 ngày) Thỏ đƣợc tiêm kháng nguyên với liều tăng dần từ 0,5 ml đến 2 ml dịch vi khuẩn. Khoảng cách giữa 2 lần tiêm là 5 ngày. Sau khi tiêm mũi nhắc lại thứ 4 tiến hành lấy máu thu kháng thể, lấy máu 3 lần mỗi lần cách nhau 5 ngày và lần cuối cùng lấy hết máu. Trƣớc khi gây miễn dịch và sau mỗi lần tiêm kháng nguyên vi khuẩn 4 ngày tiến hành lấy máu kiểm tra kháng thể bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính, kết quả đƣợc trình bày bảng 4.1. Bảng 4.1 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh của thỏ 1 và thỏ 2 Thỏ Lấy máu Thỏ 1 Thỏ 2 Trƣớc khi tiêm - - Sau mũi mẫn cảm - - Sau mũi nhắc lại 1 - - Sau mũi nhắc lại 2 + + Sau mũi nhắc lại 3 + + Sau mũi nhắc lại 4 (lấy máu lần 1) + + Lấy máu lần 2 + + Lấy máu lần 3 + + Ghi chú: Lấy máu lần 1: 5 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4 Lấy máu lần 2: 10 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4 Lấy máu lần 3: 15 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4 34 Dựa vào bảng kết quả ta thấy qui trình ngắn ngày đƣợc áp dụng trong nghiên cứu đã gây đƣợc đáp ứng miễn dịch trên thỏ, tạo kháng thể phát hiện đƣợc bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính. Kháng thể xuất hiện trong kháng huyết thanh sau mũi nhắc lại lần 2 (sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày) và vẫn tồn tại cho đến lần lấy máu lần 3 (15 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần cuối – mũi 4 ). 4.1.1.2. Qui trình dài ngày (154 ngày) Thỏ đƣợc tiêm kháng nguyên với liều từ cao xuống thấp. Khoảng cách giữa 2 lần tiêm là 28 ngày. Kể từ khi tiêm mũi nhắc lại thứ 3 tiến hành lấy máu thu kháng thể sau mỗi lần tiêm kháng nguyên 14 ngày. Trƣớc khi tiêm và sau khi tiêm mũi mẫn cảm, các mũi nhắc lại 14 ngày tiến hành lấy máu để thử phản ứng ngƣng kết xác định sự hiện diện của kháng thể trong kháng huyết thanh. Kết quả đƣợc trình bày qua bảng 4.2. Bảng 4.2 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5 Thỏ L.máu Thỏ 3 (liều tiêm 1 ml) Thỏ 4 (liều tiêm 1,5 ml) Thỏ 5 (liều tiêm 2 ml) Trƣớc khi tiêm - - - Sau mũi mẫn cảm ± ± - Sau mũi nhắc lại 1 ± ± Chết Sau mũi nhắc lại 2 ± ± Sau mũi nhắc lại 3 ± + Sau mũi nhắc lại 4 + ++ Kết quả cho thấy sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày thì kháng thể xuất hiện và phản ứng ngƣng kết thấy rõ hơn khi tiêm mũi gây mẫn cảm với liều cao hơn. Ở các mũi nhắc lại tiếp theo thì phản ứng ngƣng kết thấy càng rõ. Qui trình dài ngày đƣợc áp dụng trong nghiên cứu cũng đã tạo đáp ứng miễn dịch trên thỏ với kháng thể có thể phát hiện đƣợc bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính 4.1.2. Định lƣợng Để xác định hiệu giá kháng thể ta thực hiện phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm với KHT lúc đầu và KHT đã thẩm tích (KHT tủa trong ammonium sulfate và thẩm tích) ở các độ pha loãng khác nhau. 35 Trong thí nghiệm này chỉ tiến hành định hiệu giá kháng thể của KHT thu đƣợc ở lần lấy máu thứ 1,2,3 sau mũi nhắc lại 4 (qui trình ngắn ngày) và sau mũi nhắc lại thứ 3, thứ 4 (qui trình dài ngày). 4.1.2.1. Qui trình ngắn ngày Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể ngƣng kết của kháng huyết thanh thỏ 1 và thỏ 2 Thỏ Lấy máu Thỏ 1 Thỏ 2 Trung bình Lần 1 Huyết thanh 1/1600 1/1600 1/1600 KHT đã thẩm tích 1/960 1/480 1/720 Lần 2 Huyết thanh 1/960 1/1280 1/1120 KHT đã thẩm tích 1/240 1/640 1/440 Lần 3 Huyết thanh 1/480 1/960 1/720 KHT đã thẩm tích 1/640 1/480 1/560 Ghi chú: Lấy máu lần 1: 5 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4 Lấy máu lần 2: 10 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4 Lấy máu lần 3: 15 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4 Dựa vào kết quả bảng 4.3 ta thấy hàm lƣợng kháng thể trong kháng huyết thanh giảm dần ở các lần lấy máu, lƣợng kháng thể nhiều nhất trong mẫu máu lấy lần 1 và thấp nhất ở lần 3. Kết quả cũng cho thấy hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi tủa trong amonium sulfate và thẩm tích thƣờng thấp hơn kháng huyết thanh lúc đầu. 0 500 1000 1500 2000 lần 1 lần 2 lần 3 thời điểm lấy máu hiệu giá KT Thỏ 1 Thỏ 2 Biểu đồ 4.1 Biến đổi hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh của thỏ 1 và thỏ 2 theo thời điểm lấy mẫu. 36 0 500 1000 1500 2000 lần 1 lần 2 lần 3 thời điểm lấy máu hiệu giá KT Huyết thanh KHT đã thẩm tích Biểu đồ 4.2 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu và KHT đã thẩm tích ở qui trình ngắn ngày 4.1.2.2. Qui trình dài ngày Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh thỏ 3 và thỏ 4 Thỏ Lấy máu Thỏ 3 Thỏ 4 Trung bình Sau mũi nhắc lại 3 Huyết thanh 1/1280 1/960 1/1120 KHT đã thẩm tích 1/960 1/640 1/800 Sau mũi nhắc lại 4 Huyết thanh 1/1280 1/2560 1/1920 KHT đã thẩm tích 1/320 1/1920 1/1120 Dựa vào kết quả bảng 4.4 ta thấy hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh của thỏ 3 và thỏ 4 ở mũi nhắc lại 4 bằng hoặc cao hơn mũi nhắc lại 3. Hiệu giá kháng thể trong kháng huyết thanh sau mũi nhắc lại lần 4 không giảm so với mũi nhắc lại lần 3 mà đặc biệt tăng cao 1/2560 so với 1/960 ở thỏ 4. 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 mũi nhắc lại 3 mũi nhắc lại 4 thời điểm lấy máu hiệu giá KT Thỏ 3 Thỏ 4 Biểu đồ 4.3 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh của thỏ 3 và thỏ 4 ở các thời điểm khác nhau. 37 Tƣơng tự nhƣ qui trình ngắn ngày, qui trình dài ngày có hàm lƣợng kháng thể trong kháng huyết thanh sau khi tủa bằng ammonium sulfate và thẩm tích thƣờng thấp hơn lƣợng kháng thể trong kháng huyết thanh thô lúc đầu. 0 500 1000 1500 2000 2500 mũi nhắc lại 3 mũi nhắc lại 4 thời điểm lấy máu hiệu giá KT huyết thanh KHT đã thẩm tích Biểu đồ 4.4 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu và KHT đã thẩm tích ở qui trình dài ngày 4.1.2.3. Hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch ở 2 qui trình Hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch đƣợc đánh giá qua việc so sánh trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh thỏ sau lần tiêm nhắc lại thứ 4 ở qui trình ngắn ngày và sau lần tiêm nhắc lại thứ 3, thứ 4 ở qui trình dài ngày. Kết quả đƣợc thể hiện qua bảng 4.5. Bảng 4.5 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh thỏ ở qui trình ngắn ngày và dài ngày Qui trình ngắn ngày Qui trình dài ngày Lần 1 1/1600 Sau mũi nhắc lại 3 1/1120 Lần 2 1/1120 Sau mũi nhắc lại 4 1/1920 Lần 3 1/720 Trung bình 1/1147 Trung bình 1/1520 Kết quả cho thấy trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết sau mũi nhắc lại 4 ở qui trình ngắn ngày thấp hơn trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết sau mũi nhắc lại 3 và 4 ở qui trình dài ngày. 38 4.1.3. Xử lí tăng độ nhạy của kháng huyết thanh Để tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết trên phiến kính ta cho kháng thể trong KHT gắn với protein A của Staphylococcus aureus. 4.1.3.1. Xác định nồng độ S. aureus thích hợp gắn với kháng huyết thanh KHT thỏ 1 thu đƣợc ở lần lấy máu cuối cùng (lấy máu lần 3) đƣợc gắn với S. aureus ở các nồng độ khác nhau theo quy trình 3.4. Thực hiện phản ứng ngƣng kết trên phiến kính ta thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Bảng 4.6 Kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính với kháng huyết thanh gắn S. aureus ở các nồng độ khác nhau V KHT : V S. aureus Nồng độ S. aureus (tế bào / ml) 1:4 1:9 10 9 ++ + 10 10 ++ + 10 11 ++ + 10 12 ++ + 10 13 ++ ++ 10 14 +++ ++ 10 15 +++ ++ Ghi chú: Đối chứng KHT của lần lấy máu thứ 3 (thỏ 1) không xử lí với S. aureus cho kết quả (+) KHT trƣớc khi gây đáp ứng miễn dịch đƣợc xử lí với S. aureus cho kết quả (-) Dựa vào bảng kết quả trên ta thấy: Phản ứng ngƣng kết thấy rõ nhất khi KHT gắn với S. aureus có nồng độ 10 14 , 10 15 tế bào/ ml. Trong đó, nồng độ S. aureus 10 14 cho kết quả không khác nồng độ 10 15 . Tỉ lệ thể tích KHT kết hợp với S. aureus là 1:4 cho kết quả ngƣng kết trên phiến kính rõ hơn tỉ lệ 1:9. Nhƣ vậy việc xử lí gắn kháng thể với protein A của S. aureus đã làm tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết, giúp cho việc đọc kết quả đƣợc dễ dàng hơn. 4.1.3.2. Kiểm tra phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh xử lí gắn S. aureus Việc xử lí kháng huyết thanh với S. aureus đã làm tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết, điều này có thể sẽ cho phép xác định chính xác hơn thời điểm xuất hiện 39 kháng thể. Dựa vào kết quả ở mục 4.1.3.1., tiến hành xử lí kháng huyết thanh với dịch vi khuẩn S. aureus có nồng độ 10 14 tế bào/ ml với tỉ lệ thể tích KHT : dịch vi khuẩn là 1:4. Kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính đƣợc trình bày ở bảng 4.6 và 4.7 a. Qui trình ngắn ngày Bảng 4.7 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh đƣợc xử lí và không đƣợc xử lí với S. aureus của thỏ 1 và thỏ 2 Thỏ Lấy máu Thỏ 1 Thỏ 2 Không xử lí với S. aureus Xử lí với S. aureus Không xử lí với S. aureus Xử lí với S. aureus Trƣớc khi tiêm - - - - Sau mũi mẫn cảm - - - - Sau mũi nhắc lại 1 - - - - Sau mũi nhắc lại 2 + + + ++ Sau mũi nhắc lại 3 + ++ + ++ Sau mũi nhắc lại 4 (lấy máu lần 1) + ++ + ++ Lấy máu lần 2 + + + ++ Lấy máu lần 3 + +++ + + So với KHT không gắn S. aureus thì KHT gắn S. aureus cho kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính rõ ràng hơn. Tuy nhiên không có sự khác biệt về thời điểm phát hiện kháng thể. Ở cả hai trƣờng hợp đều cho kết quả phản ứng ngƣng kết dƣơng tính với mẫu đƣợc lấy sau tiêm mũi nhắc lại lần 2. b. Qui trình dài ngày Bảng 4.8 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh đƣợc xử lí và không đƣợc xử lí với S. aureus của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5 Thỏ L.máu Thỏ 3 Thỏ 4 Thỏ 5 Không xử lí với S.aureus Xử lí với S. aureus Không xử lí với S. aureus Xử lí với S. aureus Không xử lí với S. aureus Xử lí với S. aureus Trƣớc khi tiêm - - - - - - Sau mũi mẫn cảm ± ± ± + - + Sau mũi nhắc lại 1 ± ± ± + Chết Sau mũi nhắc lại 2 ± + ± + Sau mũi nhắc lại 3 ± ++ + ++ Sau mũi nhắc lại 4 + +++ ++ +++ 40 Kết quả cho thấy kháng thể nếu đƣợc gắn với protein A của S. aureus sẽ cho phản ứng ngƣng kết rõ hơn so với kháng thể không gắn protein A. Sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày thì kháng thể xuất hiện và phản ứng ngƣng kết thấy rõ hơn khi tiêm mũi gây mẫn cảm với liều cao hơn. Ở các mũi nhắc lại tiếp theo thì phản ứng ngƣng kết thấy càng rõ. Đặc biệt ở thỏ 5, sau khi xử lí với S. aureus đã có thể phát hiện đƣợc kháng thể ngƣng kết ngay sau mũi tiêm mẫn cảm trong khi với kháng huyết thanh không xử lí cho kết quả (-). 4.1.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh Do kháng nguyên sử dụng là nguyên tế bào vi khuẩn E. coli vì vậy sẽ có các kháng thể đặc hiệu chung cho các loài vi khuẩn E. coli đƣợc tạo thành trong kháng huyết thanh. Nhằm tăng độ đặc hiệu của phản ứng ngƣng kết cần thiết phải loại bỏ các kháng thể đặc hiệu chung này. Trong thí nghiệm, chúng tôi đã thử cho KHT hấp phụ với kháng nguyên chủng vi khuẩn E. coli E68 để trong KHT chỉ còn lại những kháng thể đặc hiệu cho H28. KHT đƣợc hấp phụ với vi khuẩn E. coli E68, sau đó định hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Bảng 4.9 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi hấp phụ của thỏ 1 và thỏ 2 (qui trình ngắn ngày) Thỏ Lấy máu T1 T2 Trung bình H. thanh KHT đã thẩm tích H. thanh KHT đã thẩm tích Lần 1 Không h. phụ (n=2) 1/1600 1/960 1/1600 1/480 1/1160 Hấp phụ E 68 (n=2) 1/48 1/48 1/48 1/20 1/41 Lần 2 Không h. phụ (n=2) 1/960 1/240 1/1280 1/640 1/780 Hấp phụ E 68 (n=2) 1/48 1/6 1/48 1/48 1/38 Lần 3 Không h. phụ (n=2) 1/480 1/640 1/960 1/480 1/640 Hấp phụ E 68 (n=2) 1/24 1/10 1/32 1/20 1/22 41 Bảng 4.10 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi hấp phụ của thỏ 3 và thỏ 4 (qui trình dài ngày) Thỏ Lấy máu T3 T4 Trung bình H. thanh KT đã thẩm tích H. thanh KT đã thẩm tích Mũi nhắc lại 3 Không h. phụ (n=2) 1/1280 1/960 1/960 1/640 1/960 Hấp phụ E 68 (n=2) 1/16 1/12 1/64 1/24 1/29 Mũi nhắc lại 4 Không h. phụ (n=2) 1/1280 1/320 1/2560 1/1920 1/1520 Hấp phụ E 68 (n=2) 1/48 1/6 1/128 1/96 1/70 Dựa vào kết quả bảng 4.9 và 4.10 ta thấy có sự giảm đáng kể hiệu giá kháng thể ngƣng kết của KHT đã hấp phụ so với KHT không hấp phụ. 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 lần 1 lần 2 lần 3 thời điểm lấy máu hiệu giá KT Huyết thanh HT hấp phụ E68 Biểu đồ 4.5 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh đƣợc hoặc không đƣợc hấp phụ ở qui trình ngắn ngày . của kháng huyết thanh Do kháng nguyên sử dụng là nguyên tế bào vi khuẩn E. coli vì vậy sẽ có các kháng thể đặc hiệu chung cho các loài vi khuẩn E. coli đƣợc tạo thành trong kháng huyết thanh. . với vi khuẩn E. coli E6 8, sau đó định hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Bảng 4.9 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh. 1/ 960 1/ 960 1 /64 0 1/ 960 Hấp phụ E 68 (n=2) 1/ 16 1/12 1 /64 1/24 1/29 Mũi nhắc lại 4 Không h. phụ (n=2) 1/1280 1/320 1/2 560 1/1920 1/1520 Hấp phụ E 68 (n=2) 1/48 1 /6 1/128