Cố định tế bào nấm mem rượu

Cố định tế bào nấm mem rượu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TPHCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC  ĐỒ ÁN MÔN HỌC CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO NẤM MEN RƯU VANG SVTH : PHẠM THỊ HỒNG NGA CBHD: THS.TÔN NỮ MINH NGUYỆT BỘ MÔN : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Năm học 2006-2007 Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố đònh tế bào nấm men rượu vang Nhận xét của giáo viên hướng dẫn . . . . . . . . . SVTH: Phạm Thò Hồng Nga Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố đònh tế bào nấm men rượu vang Mục lục iii Lời mở đầu: 1 Chương I:TỔNG QUAN .1 I.1 Nấm men 1 I.1.1Đặc điểm hình thái và cấu tạo .1 I.1.2Ứng dụng trong công nghiệp.[1, 2] .2 I.1.3Tác hại của nấm men.[1, 2] .2 I.2 Nấm men rượu vang 3 I.2.1Phân loại 3 I.2.2Đặc điểm của các loài nấm men rượu vang:[2] .4 I.2.3Trình tự lên men của các giống nấm men trong quá trình lên men vang. .6 I.2.4Chỉ tiêu chọn lựa nấm men vang 7 Bước thứ nhất là bước chọn lọc sơ bộ dựa trên khả năng chòu đựng đối với SO2, các loài có hại, khả năng phát triển tại nhiệt độ cao và sự tạo bọt thấp. 7 Bước thứ hai là bước chọn lọc chính thức dựa trên hàm lượng acid dễ bay hơi và ethanol tạo thành cũng như hàm lượng đường sót còn lại trong rượu vang 7 I.2.5Kết hợp các giống nấm men và sử dụng kỹ thuật di truyền trong sản xuất rượu vang .8 Shinohara và cộng sự (1994) đã nghiên cứu việc chọn lọc và lai giống các chủng nấm men vang để cải thiện tốc độ lên men, tăng khả năng chòu đựng đối với SO2 và làm tăng chất lượng rượu vang [33]. .9 Serra và cộng sự (2005) đã nghiên cứu việc lai tạo giữa Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces bayanus var. uvarum để kết hợp ưu điểm của 2 loài này, làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất rượu vang có hàm lượng acid thấp (pH cao) [32] .9 Chương II: CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO 10 II.1 Các phương pháp cố đònh tế bào 10 II.1.1Cố đònh trên bề mặt chất mang rắn .11 Ít hoặc không nguy hiểm đến tế bào. [8] .11 Đơn giản, dễ thực hiện, nhanh thu được sự cố đònh. [8, 26, 34] 11 Không ảnh hưởng đến quá trình truyền khối [26,34] .11 Các vật liệu cellulose: DEAE-cellulose, gỗ, mùn cưa, mùn cưa đã tách lignine, … [20, 26] .11 II.1.2Nhốt trong khung mạng xốp (tạo gel) 11 Có thể đạt được mật độ tế bào trong một đơn vò thể tích chất mang cao hơn so với canh trường vi sinh vật tự do [26] 11 Khi tế bào tăng quá nhiều sinh khối sẽ làm giảm độ bền của mạng gel.[20] 12 Polymer tự nhiên [20]: .12 Polysaccharide: alginates, κ-carrageenan, agar, chitosan và polygalacturonic acid .12 Polymer khác: gelatin, collagen và polyvinyl alcohol .12 SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - i - Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố đònh tế bào nấm men rượu vang II.1.3 Keo tụ tế bào (tạo hạt) 12 Đơn giản, dễ thực hiện .12 Do không có màng chắn giữa các tế bào và dung dòch cho nên các tế bào dễ bò tách ra, làm tăng hàm lượng tế bào tự do trong dung dòch 12 II.1.4Nhốt bằng phương pháp cơ học bên trong một màng chắn .12 II.2 Yêu cầu về chất mang. [20] .13 II.3 Ưu, nhược điểm của tế bào cố đònh .13 II.3.1Ưu điểm của tế bào cố đònh hơn tế bào tự do: [20] .13 II.3.2Nhược điểm của tế bào cố đònh: 14 Chương III:CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO NẤM MEN RƯU VANG 15 III.1 Cố đònh trên bề mặt chất mang rắn 15 III.1.1Nguyên tắc thực hiện: .15 III.1.2Các chất mang: 15 III.1.2.1Vỏ nho: [25] .15 III.1.2.2Miếng táo: .18 III.1.2.3Vật liệu cellulose đã loại lignin (DCM): [5] .22 III.1.2.4Đá kissiris: 24 III.1.2.5DEAE-cellulose [24] 26 III.2 Nhốt trong khung mạng xốp .30 III.2.1Polyvinyl alcohol 30 III.2.2κ-carrageenan .40 III.2.3Cố đònh nấm men trong gel alginate 41 III.2.3.1Alginate 41 Block M: gồm các gốc mannuronic acid nối tiếp nhau 41 Block G: gồm các gốc guluronic acid nối tiếp nhau .41 Block MG: gồm các gốc mannuronic acid và guluronic acid luân phiên nối với nhau. 41 III.2.3.2Cơ chế tạo gel .42 III.2.3.3Ưu nhược điểm của việc cố đònh nấm men trong gel alginate .44 Quá trình cố đònh dễ thực hiện 44 Điều kiện cố đònh ôn hòa, không phải xử lý nhiệt hay xử lý hóa chất. Do đó, các tế bào cố đònh không bò mất hoạt tính 44 Alginate là chất mang trơ về mặt hóa học .44 Alginate không có độc tính, thích hợp cho các sản phẩm thực phẩm 44 Độ xốp của mạng gel thuận lợi cho việc khuếch tán cơ chất và sản phẩm 44 Gel alginate vẫn giữ được độ bền khi nhiệt độ lên men cao 44 Độ bền gel giảm theo thời gian lên men do: .44 Gel Ca-alginate rất nhạy với các chất tạo chelate (hợp chất hữu cơ trong đó nguyên tử tạo thành nhiều hơn một liên kết phối trí với các kim loại trong dung dòch) như phosphate, citrate và lactate và các chất không tạo gel (non-gelling) như là các ion sodium và magnesium. Sự có mặt của các ion này trong dung dòch sẽ làm cho các hạt bò phồng ra, dẫn đến tăng kích thước các lỗ xốp, làm giảm tính ổn đònh và phá vỡ cấu trúc hạt gel. Thông thường người ta thường thêm vào môi trường lên men các chất ổn đònh gel như là CaCl2, celite và pectine với một hàm lượng thích hợp để ổn đònh độ bền gel. Hoặc cũng có thể làm cứng gel bằng cách sử dụng propylene glycol ester, polyethelenine (PEI) và các loại vật liệu composite (colloidal silica) .45 SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - ii - Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố đònh tế bào nấm men rượu vang III.2.3.4Ảnh hưởng của thành phần alginate và các điều kiện tạo gel đến độ bền gel và quá trình lên men 46 Tốc độ lên men có xu hướng tăng, nhưng không đáng kể 46 Độ bền gel giảm, vì các ion hóa trò 2 như là calcium, barium, strontium được ưu tiên liên kết vào block G hơn là block M và block MG. Do đó alginate có hàm lượng G lớn sẽ tạo thành gel xốp, chắc hơn và vẫn giữ được độ cứng vững trong một thời gian dài. Trong suốt quá trình tạo liên kết với Ca2+, các loại alginate này sẽ không bò phồng nở hay co rút, vì thế vẫn giữ được hình dạng tốt hơn. Thêm vào đó, alginate có hàm lượng G cao sẽ cản trở sự sinh trưởng của tế bào nấm men sau khi cố đònh. Trái lại, alginate có hàm lượng M cao tạo thành gel mềm và ít xốp hơn và dễ bò rã ra hơn so với các gel giàu G. Kazuaki và cộng sự (1995) cũng đã nghiên cứu và kết luận rằng gel alginate giàu G thích hợp để cố đònh nấm men hơn vì gel này ít gây cản trở đến khả năng khuếch tán của glucose và có độ bền cơ học cao hơn .46 III.3 Nhốt bằng phương pháp cơ học bên trong một màng chắn 48 III.3.1Màng membrane alginat 48 III.3.2Màng vi bao sinh học (biocapsule) [28] 55 III.4 Thiết bò phản ứng membrane.[40] 58 Tài liệu tham khảo: 62 65 Mục lục bảng Bảng I.1 : Các đặc tính mong muốn của nấm men vang [15] 8 Bảng III.2: Kết quả kiểm tra mùi và vò của rượu sản xuất từ tế bào Saccharomyces cerevisiae cố đònh trên miếng táo trong suốt quá trình lên men liên tục so sánh với rượu thương mại:[19] .21 Bảng III.3. Một số chế phẩm polyvinyl alcohol thương mại .32 Bảng III.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ nhớt của dung dòch 10% polyvinyl alcohol có phân tử lượng là 115.000: 34 SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - iii - Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố đònh tế bào nấm men rượu vang Bảng III.5 Ảnh hưởng của nồng độ dung dòch đến độ nhớt của dung dòch polyvinyl alcohol có phân tử lượng là 115.000: 34 Bảng III.6 So sánh phương pháp nhốt trong gel và phương pháp vi bao: 55 Mục lục hình Hình II.1 : Các kỹ thuật cơ bản để cố đònh tế bào [20] .10 Hình III.2 Hi u su t sản xuất cồn ở những nhiệt độệ ấ lên men khác nhau 17 Hình III.3 Năng suất riêng của việc sản xuất cồn ở những nhiệt độ khác nhau .17 Hình III.4 Nấm men cố đònh trên miếng táo trong quá trình lên men rượu 20 Hình III.5 Đá kissiris .25 Hình III.6 Công thức cấu tạo của phân tử polyvinyl alcohol 30 Hình III.7 Công thức cấu tạo của phân tử polyvinyl acetate .31 Hình III.8 Mức độ thuỷ phân của phân tử polyvinyl alcohol: 32 Hình III.9 Khả năng hoà tan phụ thuộc vào mức độ thuỷ phân và nhiệt độ. .33 SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - iv - Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố đònh tế bào nấm men rượu vang Hình III.10 Cấu trúc của alginate: (a) các monomer của alginate, .42 Hình III.11 Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài .43 Hình III.12 Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên trong 44 Hình III.13. Phương pháp chuẩn bò bao Alg(PEG) 49 Hình III.14 Hệ thống tạo bao cố đònh tế bào .50 Hình III.15 Ảnh hưởng của thời gian tạo gel lên sự hình thành bao Alg(PEG). Bao Alg(PEG) được sản xuất bằng cách dùng dung dòch PEG 6000 20% (w/w) chứa 2% CaCl2 (w/w) 51 Hình III.16. Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 lên bán kính và bề dày của lớp gel alginate của bao Alg(PEG). Bao được sản xuất bằng cách dùng dung dòch PEG 6000 30% (w/w) chứa 2% CaCl2 . .52 Hình III.17 Sự thay đổi nồng độ PEG và xanthan gum 53 Hình III.18 Lượng bao hình cầu theo chiều cao lổ hổng trong reactor 54 Hình III.19 Biocapsule và hình ảnh liên kết của nấm sợi và nấm men .56 Hình III.20 Biểu đồ hoạt động của hệ thống thiết bò phản ứng sinh học membrane một bình. .58 SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - v - Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố đònh tế bào nấm men rượu vang Hình III.21 Biểu đồ hoạt dộng của hệ thống thiết bò phản ứng sinh học membrane 2 bình. 59 SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - vi - Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố đònh tế bào nấm men rượu vang Lời mở đầu: Như chúng ta đã biết, nấm men là một loài vi sinh vật có nhiều ứng dụng trong công nghiệp và sản xuất. Một trong những ứng dụng phổ biến của chúng là trong ngành sản xuất rượu vang, một ngành sản xuất sản phẩm lên men có truyền thống lâu đời. Theo các tài liệu cổ, rượu vang có xuất xứ từ các nước Ả Rập vào khoảng thế kỷ 18 hay 19 trước Công nguyên và cho đến nay, rượu vang đã trở nên phổ biến khắp nơi trên thế giới. Rượu vang được ưa thích trước hết là do hương vò hết sức đặc trưng mà không loại sản phẩm nào có thể thay thế, sau đó là do nó đem lại cảm giác sảng khoái và sức khỏe cho người uống. Trong thời kì đầu, rượu vang được tạo ra bằng quá trình lên men tự phát với những loài nấm men có sẵn trong dòch quả. Dần dần, người ta đã biết tiến hành nuôi cấy các chủng nấm men thuần thiết để thúc đẩy quá trình lên men và tăng chất lượng của rượu vang. Loài nấm men đóng vai trò chính trong quá trình lên men cồn sản xuất rượu vang là loài Saccharomyces cerevisiae. Tuy nhiên, việc sử dụng nấm men tự do để lên men gặp phải một số vấn đề như thời gian lên men dài, năng suất lên men thấp, tiêu tốn nhiều năng lượng để tách nấm men ra khỏi rượu vang sau quá trình lên men, … Để giải quyết các vấn đề này, nhiều nghiên cứu về việc sử dụng nấm men cố đònh trong sản xuất rượu vang đã được thực hiện. Các nghiên cứu này đều cho thấy nấm men cố đònh có nhiều ưu điểm hơn hẳn so với nấm men tự do như là tăng tốc độ sử dụng cơ chất, rút ngắn thời gian lên men, ổn đònh hoạt tính của nấm men, góp phần tăng năng suất lên men, … Chính vì những lợi ích về kỹ thuật và kinh tế do việc sử dụng nấm men cố đònh trong sản xuất rượu vang mang lại mà những nghiên cứu về chúng ngày càng được mở rộng và thu hút sự chú ý nhiều hơn. Các nhà nghiên cứu đã thực hiện việc cố đònh tế bào bằng nhiều phương pháp khác nhau, sử dụng chất mang như những vật liệu vô cơ, những polisaccarit hữu cơ với mong muốn tìm kiếm phương thức cố đònh phù hợp cho quá trình lên men cồn trong sản xuất rượu vang. Cơ sở để đánh giá liệu kỹ thuật này có thể ứng dụng thành công trong sản xuất công nghiệp hay không thì phụ thuộc vào khả năng cải thiện năng suất lên men cồn, cải thiện chất lượng, mùi vò cho sản phẩm. Đồng thời kỹ thuật đó phải đảm bảo sử dụng chất mang phù hợp với thực phẩm, phong phú trong tự nhiên và hiệu quả về kinh tế. SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 1 - Chương I: Tổng quan Chương I: TỔNG QUAN I.1 Nấm men. I.1.1 Đặc điểm hình thái và cấu tạo. I.1.1.1Đặc điểm hình thái: [2] Tế bào nấm men có nhiều hình dạng khác nhau như là hình cầu, hình ovan hoặc elip, hình quả chanh, hình trụ, hình chùy hoặc đôi khi kéo dài ra thành hình sợi. Nấm men có thể thay đổi hình dáng kích thước trong các giai đoạn phát triển và điều kiện môi trường xung quanh. Hình thái của chúng không thay đổi chỉ ở các giống nuôi cấy khi còn trẻ trong các môi trường dinh dưỡng tiêu chuẩn. So với các vi sinh vật khác (đối với vi khuẩn chẳng hạn) tế bào nấm men có kích thước tương đối lớn, đường kính khoảng 1 µ, chiều dài 8 µm. Với kích thước này ta có thể ước tính bề mặt tế bào nấm men trong một lít dòch lên men vào khoảng 10 m 2 và do vậy cường độ trao đổi chất của tế bào nấm men với môi trường xung quanh là vô cùng to lớn. I.1.1.2Cấu tạo tế bào nấm men : [1, 2] Nấm men là sinh vật đơn bào hiển vi, tế bào cơ bản giống với động thực vật. So sánh tế bào nấm men với vi khuẩn ta thấy có sự tiến hoá nhảy vọt từ nhân sơ đế nhân chuẩn. Cùng với sự tiến hoá về nhân và cơ chế phân chia nhân (nhân có màng, có các thể nhiễm sắc, phân bào có tơ … ) ở cơ thể nhân chuẩn xuất hiện nhiều thể không thấy ở thể nhân sơ như ti thể, lục lạp v.v… Tế bào nấm men có thành phần và cấu tạo phức tạp. Trong tế bào có các cấu tử – tiểu thể và có thể chia thành: các cơ quan nội bào hay cơ quan tử của tế bào và các chất chứa trong tế bào hay các thể vùi của tế bào. - Thành tế bào nấm men dày khoảng 25nm ( chiếm 25% khối lượng khô của tế bào). Đa số nấm men có thành tế bào cấu tạo từ glucan và mannan. Một số nấm men có thành tế bào chứa mannan và kitin. Trong thành tế bào còn chứa khoảng 10% protein ( tính theo khối lượng khô), trong số protein này có một phần là các enzim. Trên thành tế bào còn thấy có một lượng nhỏ lipit. - Dưới lớp thành tế bào là lớp màng tế bào chất có 3 tầng kết cấu khác nhau. Cấu tạo chủ yếu là protein (chiếm 50% khối lượng chất khô), phần còn lại là lipit (40%) và một ít polisaccarit. SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 1 - [...]... 2 loài này, làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất rượu vang có hàm lượng acid thấp (pH cao) [32] SVTH: Phạm Thò Hồng Nga -9- Chương II: Các phương pháp cố đònh tế bào Chương II: CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO II.1 Các phương pháp cố đònh tế bào Khái niệm: Kỹ thuật cố đònh tế bào được đònh nghóa là: “Kỹ thuật bao bọc hoặc đònh vò các tế bào còn nguyên vẹn lên một “vùng không gian nhất đònh” nhằm... thành tế bào, màng tế bào chất, … có thể gây cản trở việc thẩm thấu cơ chất, sản phẩm và các cấu tử từ môi trường ra vào tế bào o Một nhược điểm thường thấy ở những tế bào vi sinh vật được “gói” trong khuôn có cấu trúc gel, những cơ chất có kích thước phân tử lớn sẽ không có điều kiện tiếp xúc với tế bào vi sinh vật cố đònh Vì thế mà hoạt lực của những tế bào cố đònh có thể sẽ thấp hơn so với những tế bào. .. nguy hiểm đến tế bào [8] Đơn giản, dễ thực hiện, nhanh thu được sự cố đònh [8, 26, 34] Không ảnh hưởng đến quá trình truyền khối [26,34] Diện tích tiếp xúc giữa tế bào cố đònh và chất mang lớn hơn so với các kỹ thuật khác [26] Có thể phục hồi trở lại tế bào tự do [8] II.1.1.3 Nhược điểm Do không có màng chắn giữa các tế bào và dung dòch cho nên các tế bào dễ bò tách ra, làm tăng hàm lượng tế bào tự do... cồn trong sản xuất rượu vang Môi trường chứa nấm men Miếng táo Phối trộn Môi trường Lên men Gạn dòch lên men Rửa Nấm men cố đònh SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 19 - Tài liệu tham khảo Hình III.4 Nấm men cố đònh trên miếng táo trong quá trình lên men rượu c Hiệu quả sản xuất rượu vang: SỰ CỐ ĐỊNH VÀ LÊN MEN: [22] Để cố đònh tế bào những miếng táo được phối trộn với môi trường lỏng của chủng nấm men chòu cồn... như là cố đònh trên bề mặt chất mang rắn, nhốt trong khung mạng xốp, keo tụ tế bào (tạo hạt), nhốt bằng phương pháp cơ học bên trong một màng chắn [20] Hình II.1 : Các kỹ thuật cơ bản để cố đònh tế bào [20] SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 10 - Chương II: Các phương pháp cố đònh tế bào II.1. 1Cố đònh trên bề mặt chất mang rắn II.1.1.1 Nguyên tắc Đây là phương pháp cố đònh dựa vào tương tác bề mặt giữa tế bào. .. cũng khá phức tạp o Tế bào cố đònh đòi hỏi nhiều nguồn dinh dưỡng và năng lượng đa dạng đảm bảo khả năng phát triển và hoạt động bình thường Khi đó, trong hệ thống sử dụng tế bào cố đònh có thể xảy ra hiện tượng phân huỷ sản phẩm để cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng và năng lượng cần thiết cho tế bào Vì thế mà hiệu suất sử dụng tế bào cố đònh có thể thấp hơn hiệu suất sử dụng tế bào tự do o Do được bao... trống trên mùn cưa, do đó nó thích hợp để nhốt tế bào vào lổ xốp Cố đònh tế bào bằng lực Van der Waal, liên kết hóa học như liên kết hydro giữa nhóm hydroxyl của cellulose và nhóm cacboxyl, hydroxyl và cacboxyl của thành tế bào b Sự chuẩn bò DCM và cố đònh tế bào : Cách 1: Tế bào tăng trưởng trong môi trường với nồng độ Be vào khoảng 7,1-11,4; 0,4% chất chiết nấm men; 0,1% (NH4)2SO4; 0,1% KH2PO4/l và 0,5%... đã khử trùng Hỗn hợp nấm men được bơm qua đệm chất mang trong khoảng 1 - 4 giờ và nấm men tự bản thân nó liên kết với chất mang Nấm men cố đònh lên trên chất mang trong reactor Chất mang Hydrat hoá Chuyển vào reactor Khử trùng Rửa và trung hoà Cố đònh tế bào Nấm men Tế bào cố đònh c Hiệu quả của phương pháp cố đònh: Chất mang là một điều kiện quan trọng để cung cấp môi trường cho nấm men tăng trưởng... hấp phụ gây ra bởi việc nhồi tế bào vi sinh vật vào khối tế bào táo.[19] SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 18 - Tài liệu tham khảo b.Chất mang và phương pháp cố đònh tế bào: [22] Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae AXAZ-1 chòu cồn chòu lạnh cho tăng trưởng trong môi trường chứa (%w/v) 4% glucoza; 0,4% chất chiết nấm men; 0,1% (NH4)2SO4; 0,1% KH2PO4/l và 0,5% MgSO4 Để cố đònh tế bào, miếng táo được sử dụng... bởi một lượng những nhân tố (như bản chất của chất mang và tế bào vi sinh vật, điều kiện môi trường) [26] III.1.2.1 Vỏ nho: [25] Vỏ nho được dùng làm chất mang để cố đònh tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae trong sản xuất rượu vang Tế bào cố đònh này được dùng lên men ở các mẻ nối tiếp nhau và hiệu suất được cải thiện hơn khi so sánh với tế bào tự do SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 15 - Tài liệu tham khảo . PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO II.1 Các phương pháp cố đònh tế bào. Khái niệm: Kỹ thuật cố đònh tế bào được đònh nghóa là: “Kỹ thuật bao bọc hoặc đònh vò các tế bào. hay các thể vùi của tế bào. - Thành tế bào nấm men dày khoảng 25nm ( chiếm 25% khối lượng khô của tế bào) . Đa số nấm men có thành tế bào cấu tạo từ glucan