Cố định tế bào nấm mem rượu

Cố định tế bào nấm mem rượu

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC



ĐỒ ÁN MÔN HỌC CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO NẤM MEN RƯỢU VANG

SVTH : PHẠM THỊ HỒNG NGA CBHD: THS.TÔN NỮ MINH NGUYỆT BỘ MÔN : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Năm học 2006-2007

Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố định tế bào nấm men rượu vang

Nhận xét của giáo viên hướng dẫn

Mục lục

Lời mở đầu: 1

Chương I:TỔNG QUAN 1

I.1 Nấm men 1

I.1.1 Đặc điểm hình thái và cấu tạo 1

I.1.2 Ứng dụng trong công nghiệp 2

I.1.3 Tác hại của nấm men 3

I.2 Nấm men rượu vang 3

I.2.1 Phân loại 3

I.2.2 Đặc điểm của các loài nấm men rượu vang 4

I.2.3 Trình tự lên men của các giống nấm men trong quá trình lên men vang.6 I.2.4 Chỉ tiêu chọn lựa nấm men vang 7

I.2.5 Kết hợp các giống nấm men và sử dụng kỹ thuật di truyền trong sản xuất rượu vang 8

Chương II:CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO 10

II.1 Các phương pháp cố định tế bào 10

II.1.1 Cố định trên bề mặt chất mang rắn 11

II.1.2 Nhốt trong khung mạng xốp (tạo gel) 11

II.1.3 Keo tụ tế bào (tạo hạt) 12

II.1.4 Nhốt bằng phương pháp cơ học bên trong một màng chắn 12

II.2 Yêu cầu về chất mang 13

II.3 Ưu, nhược điểm của tế bào cố định 13

II.3.1 Ưu điểm của tế bào cố định hơn tế bào tự do 13

II.3.2 Nhược điểm của tế bào cố định 14

Chương III:CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO NẤM MEN RƯỢU VANG 15

III.1 Cố định trên bề mặt chất mang rắn 15

III.1.1 Nguyên tắc thực hiện: 15

III.1.2 Các chất mang: 15

III.1.2.1 Vỏ nho 15

III.1.2.2 Miếng táo 18

III.1.2.3 Vật liệu cellulose đã loại lignin (DCM) 22

III.1.2.4 Đá kissiris 24

III.1.2.5 DEAE-cellulose 26

III.2 Nhốt trong khung mạng xốp 30

III.2.1 Polyvinyl alcohol 30

III.2.2 -carrageenancarrageenan 40

III.2.3 Cố định nấm men trong gel alginate 41

Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố định tế bào nấm men rượu vang

III.2.3.1 Alginate 41

III.2.3.2 Cơ chế tạo gel 42

III.2.3.3 Ưu nhược điểm của việc cố định nấm men trong gel alginate 44

III.2.3.4 Ảnh hưởng của thành phần alginate và các điều kiện tạo gel đến độ bền gel và quá trình lên men 46

III.3 Nhốt bằng phương pháp cơ học bên trong một màng chắn 48

III.3.1 Màng membrane alginat 48

III.3.2 Màng vi bao sinh học (biocapsule) 55

III.4 Thiết bị phản ứng membrane 56

Tài liệu tham khảo: 60

Mục lục bảng Bảng I.1 Các đặc tính mong muốn của nấm men vang [15] 8

Bảng III.1 Kết quả kiểm tra mùi và vị của rượu sản xuất từ tế bào Saccharomyces cerevisiae cố định trên miếng táo trong suốt quá trình lên men liên tục so sánh với rượu thương mại:[19] 21

Bảng III.2 Một số chế phẩm polyvinyl alcohol thương mại 32

Bảng III.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ nhớt của dung dịch 10% polyvinyl alcohol có phân tử lượng là 115.000: 34

Bảng III.4 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đến độ nhớt của dung dịch polyvinyl alcohol có phân tử lượng là 115.000: 34

Bảng III.5 So sánh phương pháp nhốt trong gel và phương pháp vi bao: 54

Mục lục hình Hình II.1 Các kỹ thuật cơ bản để cố định tế bào [20] 10

Hình III.1 Hiệu suất sản xuất cồn ở những nhiệt độ lên men khác nhau 17

Hình III.2 Năng suất riêng của việc sản xuất cồn ở những nhiệt độ khác nhau 17 Hình III.3 Nấm men cố định trên miếng táo trong quá trình lên men rượu 20

Hình III.4 Đá kissiris 25

Hình III.5 Công thức cấu tạo của phân tử polyvinyl alcohol 30

Hình III.6 Công thức cấu tạo của phân tử polyvinyl acetate 31

Hình III.7 Mức độ thuỷ phân của phân tử polyvinyl alcohol: (a) thuỷ phân hoàn toàn, (b) thuỷ phân một phần 32

Hình III.8 Khả năng hoà tan phụ thuộc vào mức độ thuỷ phân và nhiệt độ 33

Hình III.9 Cấu trúc của alginate: (a) các monomer của alginate, (b) chuỗi alginate, (c) sự phân bố các block [186] 42

Hình III.10 Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài 43 Hình III.11 Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên trong .44

Hình III.12 Phương pháp chuẩn bị bao Alg(PEG) 49Hình III.13 Hệ thống tạo bao cố định tế bào 50Hình III.14 Ảnh hưởng của thời gian tạo gel lên sự hình thành bao Alg(PEG) Bao

Alg(PEG) được sản xuất bằng cách dùng dung dịch PEG 6000 20% (w/w)chứa 2% CaCl2 (w/w) 51Hình III.15 Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 lên bán kính và bề dày của lớp gel

alginate của bao Alg(PEG) Bao được sản xuất bằng cách dùng dung dịchPEG 6000 30% (w/w) chứa 2% CaCl2 51Hình III.16 Sự thay đổi nồng độ PEG và xanthan gum trong suốt thời gian hoá

rắn 52Hình III.17 Lượng bao hình cầu theo chiều cao lổ hổng trong reactor 53Hình III.18 Biocapsule và hình ảnh liên kết của nấm sợi và nấm men 55Hình III.19 Biểu đồ hoạt động của hệ thống thiết bị phản ứng sinh học membrane

một bình 57Hình III.20 Biểu đồ hoạt dộng của hệ thống thiết bị phản ứng sinh học membrane

2 bình 58

Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố định tế bào nấm men rượu vang

Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố định tế bào nấm men rượu vang

Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố định tế bào nấm men rượu vang

Chương I: Tổng quan

Bên cạnh các nấm men có ích như đã trình bày ở trên cũng có không ít cácnấm men có hại, chúng gây ra hiện tượng làm hư hỏng thực phẩm tươi sống hoặccác thực phẩm chế biến Có khoảng 13-carrageenan15 loài nấm men có khả năng gây bệnh cho

người và cho động vật chăn nuôi Đáng chú ý nhất là các loài Candida albicans,

Cryptococus neoformans, Trichosporon cutaneum, Trichosporon Capitatum …

Một số loài thuộc giống Zygosaccharomyces có thể phát triển ở dịch đường nồng độ cao và làm hỏng mật siro Giống Saccharomycodes và Hasenula spora có hình quả chanh cũng như các nấm men giả Kloekera không sinh bào tử có tế bào

hình chùy Những giống men này làm hỏng rượu, đặc biệt là mất mùi rượu vang

I.2 Nấm men rượu vang.

Sự chuyển hóa trong sản xuất rượu vang là một quá trình hóa sinh phức tạp Nóliên quan đến tương tác giữa nấm men vi khuẩn và những loài vi sinh vật khác.Trong những loài vi sinh vật này thì nấm men đóng vai trò quan trọng, kiểm soátquá trình lên men cồn trong sản xuất rượu vang [7]

Trong thời kì đầu sản suất rượu vang, quá trình lên men tự phát là chính vớinấm men từ 2 nguồn gốc khác nhau: bề mặt trái nho (từ vườn nho) , bề mặt thiết bị(từ môi trường bên trong nhà máy) Và về sau có thêm một hướng phát triển trongsản xuất rượu vang là dùng nấm men từ quá trình nuôi cấy Thành phần và chấtlượng của rượu vang có liên quan chặt chẽ đến quần thể nấm men Trong quá trìnhlên men, bên cạnh các sản phẩm chính là ethanol và CO2, nấm men tạo thànhnhiều sản phẩm phụ, ví dụ như glycerin, axit acetic, axit succinic và đặc biệt là cáchợp chất hương, góp phần đáng kể vào chất lượng của rượu vang [16,18]

I.2.1 Phân loại.

Nấm men có thể được phân thành 2 nhóm:

Thứ nhất gọi là non-carrageenanSaccharomyces (NS – là những loài nấm men không thuộc giống Saccharomyces), thường xuất hiện trên bề mặt của trái nho cùng với

nhiều loại vi sinh vật khác Hầu hết các loài NS không có khả năng tồn tại khinồng độ cồn cao hơn 6% v/v (chính vì vậy mà các loài NS thường phát triển ở giai

đoạn đầu của quá trình lên men cồn) Ngoại trừ Brettanomyces bruxellensis có thể

phát triển trong môi trường có nồng độ cồn lên đến 12%, loài này thích nghi tốt hơnnhững loài NS khác, và nó vượt trội hơn những loài khác nhất là vào cuối quá trìnhlên men, chúng góp phần chính vào mùi vị của rượu, nhưng sản phẩm phụ của nó,phenol dễ bay hơi, thì là nguyên nhân gây ra hư hỏng rượu Trước đây, nấm men

NS được xem là các vi sinh vật gây hư hỏng Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đâycho thấy rằng, một số loài nấm men NS có lợi cho chất lượng rượu vang và góp

phần rõ ràng vào đặc điểm của sản phẩm cuối, giúp tăng cường hương vị của rượuvang bởi vì khả năng của chúng trong việc sản xuất ra những sản phẩm phụ như làglycerin, ester, aceton… [31]

Nhóm khác góp phần vào hương vị rượu vang, cũng là nhân tố chính của quá

trình lên men cồn là các loài thuộc giống Saccharomyces Saccharomyces có khả

năng chịu đựng sự thay đổi của điều kiện môi trường với nồng độ ethanol và axithữu cơ tăng và sự cạn kiệt chất dinh dưỡng (Pretorius, 2000) Như vậy, mặc dù có

nhiều giống và loài nấm men trong dịch nho, nhưng giống Saccharomyces, mà chủ yếu là loài Saccharomyces cerevisiae mới là loài đảm nhiệm việc thực hiện các quá

trình chuyển hóa sinh học quan trọng trong lên men vang Chính vì thế,

Saccharomyces cerevisiae còn được gọi là “nấm men vang” [31]

I.2.2 Đặc điểm của các loài nấm men rượu vang:[2]

Saccharomyces: có bào tử trong nan thường là 1-carrageenan4 bào tử, có khi tới 8 Tế

bào của chúng có hình dạng khác nhau: hình tròn, ovan, hoặc elip Sinh sản bằnglối nảy chồi, sử dụng đường trong quá trình hô hấp và lên men, có trường hợp lênmen ở dịch đường 30% và tạo được 18ocồn Không đồng hóa được muối nitrat

Giống Sacharomyces có tới 18 loài nhưng chỉ có 7 loài thường gặp trong

nước quả

Các loài nấm men không sinh bào tử thường gặp trong nước quả và khả năng

lên men hoặc tiêu hao đường trong đó, phổ biến là Kloeckera, Torulopsis Người ta

thường gọi chúng là men dại

Sau đây là một số loài nấm men thường gặp trong quả và có vai trò quantrọng trong nghề làm rượu vang

o Saccharomyces vini.

 Đây là tên hiện nay dùng phổ biến, trước đây người ta gọi là

Saccharomyces vini Meyer hay là Saccharomyces ellipsoideus theo Lodder là Saccharomyces cerevisea Hansen.

 Nấm men này phổ biến trong quá trình lên men nước quả chiếm

đến 80% trong tổng số Saccharomyces có trong nước quả khi lên men Khả năng

kết lắng của nó phụ thuộc vào từng nòi: các tế bào dạng bụi hoặc dạng bông.Nguồn dinh dưỡng cacbon của loài này là đường, sồn, và axit hữu cơ, những tácnhân sinh trưởng là axit pantotenic, biotin, mezoinit, tiamin, và piridoxin

 Đa số tế bào của loài này hình ovan có kích thước (3 -carrageenan 8) x (5 -carrageenan

12) µm, sinh sản theo lối nảy chồi và tạo thành bào tử Saccharomyces vini sinh ra

enzim invertaza có khả năng khử đường saccaroza thành fructoza và glucoza, vì

Chương I: Tổng quan

lượng rượu tạo thành bình thường đối với nhiều nòi của men và chỉ đạt được 8-carrageenan10

% so với thể tích

 Ở giai đoạn cuối quá trình lên men Saccharomyces vini kết lắng

nhanh và làm trong dịch rượu

 Các nòi của giống này có đặc tính riêng về khả năng tạo cồn,chịu sunfit, tổng hợp các cấu tử bay hơi và các sản phẩm thứ cấp tạo ra cho vangmùi vị đặc trưng riêng biệt

 Giai đoạn cuối cùng của quá trình lên men các tế bào

Saccharomyces vini thường bị già, không tiếp tục chuyển đường thành cồn và bị

chết rất nhanh

o Saccharomyces uvarum.

 Men này được tách từ nước nho, rượu và nước quả phúc bồn tửlên men tự nhiên Về hình thái nó không khác với các loài khác Khả năng sinhbào tử khá mạnh trên môi trường thạch – malt Các nòi của loài này có thể lên men12-carrageenan13 o cồn trong dung dịch nước nho Một vài nòi được dùng trong sản xuất rượuvang

o Saccharomyces chevalieri.

 Theo Lodder là Saccharomyces chevalieri Guiliermond.

 Nấm men này được tách từ nước nho lên men tự nhiên, từ vangnon được gây men nước dừa hoặc nước cọ

 Saccharomyces chevalieri thuần chủng lên men nước nho có thể

tạo 16ocồn Nó thường lẫn với Saccharomyces vini.

o Saccharomyces ovifomis.

 Được tách ra từ nước nho tự lên men, nhưng loại nấm men này ít

hơn Saccharomyces vini Giống thuần chủng phát triển tốt trong nước nho và các

nước quả khác , có khả năng chịu được đường cao, lên men kiệt đường và tạo thành

18o cồn Các yếu tố sinh trưởng của loại này giống như Saccharomyces vini và có

khả năng chịu được lượng cồn cao Dùng các nòi thuần chủng của giống này để lênmen dịch quả có hàm lượng đường cao để chế vang khô cho kết quả tốt Có hình

dàng giống như Saccharomyces vini và có thể tạo thành 18% rượu trong quà trình lên men, giống này tạo thành màng trên dịch quả Saccharomyces ovifomis lên men

được glucoza, fructoza, manoza, sacaroza, maltoza, và 1/3 rafinoza, không lên men

được lactoza, pentoza Điều káhc nhau cơ bản của Saccharomyces ovifomis với

Saccharomyces vini là Saccharomyces ovifomis không lên men được galactoza và

men nổi lên mặt dịch lên men tạo thành màng

 Hai giống men rượu vang này (Saccharomyces vini và

Saccharomyces ovifomis) có nhiều nòi được dùng trong sản xuất Nói chung, nhiều

nòi men rượu quả có khoảng nhiệt độ thích hợp là 18-carrageenan25oC , ở 35oC sinh sản củachúng bị ức chế, ở 40oC sinh sản bị nhừng hoàn toàn, ở nhiệt độ thấp hơn 16oC sinhsản và lên men bị kéo dài Các điều kiện hóa – lý , thành phần và chất lượng dịchquả, cũng như pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sống của nấmmen

o Hanseniaspora apiculate- Kloeskera apiculata.

 Kích thước tương đối nhỏ có hình ovan, elip, hoặc hình quảchanh, tế bào có một đầu nhỏ ngưới ta thường gọi là men hình chùy Sinh sản bằngnảy chồi, rất phổ biến ở vỏ quả và nhiễm vào nước quả chiếm tới 90% tổng số menkhi bắt đầu lên men Nó có thể lên men tạo thành 6-carrageenan7o cồn, nhưng tạo thành mộtloạt các axit bay hơi cũng giống như các ester của chúng làm cho dịch có mùi tạp

và nó còn kiềm hãm các loài nấm men chính trong lên men, Kloeskera apiculata

nhạy cảm với SO2

 Trong nghề làm rượu vang người ta không mong muốn loại mennày phát triển, nếu có thì chỉ cần trong trong giai đoạn đầu tạo được 3-carrageenan4o cồn

 Qua phân tích hệ vi sinh vật trong quá trình lên men tự nhiêncũng gợi mở cho chúng ta ý thúc được khi dùng nấm men thuần chủng để lên mennước quả không nên dùng một chủng đơn độc mà cần phối hợp với những chủngchịu được cồn cao để lên men tiếp theo [2]

I.2.3 Trình tự lên men của các giống nấm men trong quá trình

lên men vang

Quá trình lên men rượu vang có thể được tiến hành một cách tự nhiên màkhông cần cấy giống hoặc bằng cách cấy vào dịch nho các nấm men vang chọn lọc.Trong nước nho tươi có những nhóm vi sinh vật khác nhau rơi từ môi trường xungquanh , chủ yếu ờ vỏ quả, thân, cuống và thiết bị Trong đó nấm men chiếm 9-carrageenan22%.[2]

Việc lên men dịch nho được thực hiện bởi một hệ vi sinh vật phức tạp, trong đócác chủng nấm men phát triển và chết tùy theo sự thích nghi của chúng đối với môitrường Tương tác nấm men-carrageenannấm men xảy ra trong suốt quá trình sản xuất rượuvang ngay từ khi bắt đầu quá trình lên men cồn Trong quá trình lên men tự nhiên,sự lên men nước quả được thực hiện bởi sự nối tiếp của những quần thể nấm menkhác nhau Những giai đoạn đầu của quá trình lên men nói chung trội hơn hẳn là

loài nấm men đầu nhọn thuộc về giống (genus) Hanseniaspora và cũng bởi những loài nấm men khác như là Candida stellata và Metschinikowia pulcherrima Theo

dõi quá trình lên men ở nhiều nơi một cách tự nhiên thấy rằng một vài ngày đầu

Chương I: Tổng quan

các men dại hình thoi đầu nhỏ hoặc hình chùy (Kloeskera) chiếm ưu thế (70-carrageenan80%

trong tổng số nấm men) Ít phổ biến hơn là những loài thuộc giống Pichia và

Kluyveromyces cũng được tìm thấy Các nấm men này chết dần khi hàm lượng cồn

tăng, chỉ còn lại Saccharomyces cerevisiae có khả năng chịu được hàm lượng cồn

cao tiếp tục quá trình lên men cho đến khi kết thúc Theo nghiên cứu của Xufre và

cộng sự Saccharomyces phát triển hơn non-carrageenanSaccharomyces chỉ sau khi nồng độ

ethanol tiến đến khoảng 4-carrageenan5%(v/v) Sự chuyển biến này rất quan trọng vì các

chủng non-carrageenanSaccharomyces thường tạo ra các hợp chất không mong muốn như rượu

bậc cao, acid acetic và acetaldehyde Bên cạnh đó, chúng cũng được trích dẫn làảnh hưởng quan trọng đến mùi vị và chất lượng của của rượu vang và những tácđộng của loài này lên sản phẩm cuối vẫn còn là vấn đề gây tranh cãi Theo nhiều

tác giả thì khi có các loài nấm men non-carrageenanSaccharomyces phát triển trong rượu vang

với một mức độ vừa phải, hương vị của rượu vang sẽ phong phú hơn và được ưa

thích nhiều hơn so với rượu vang chỉ được lên men từ giống Saccharomyces Sự biến mất hoặc giảm mật độ của giống non-carrageenanSaccharomyces có thể là do khả năng

chịu đựng cồn thấp, hoặc bị ức chế bởi các chất diệt men (acid béo mạch ngắn vàtrung bình, glycoprotein,…) hoặc do hàm lượng oxy và nitrogen còn lại thấp Cácquá trình lên men có kiểm soát thường được thực hiện bằng cách cấy canh trường

Saccharomyces cerevisiae thuần khiết, nhờ đó quá trình lên men diễn ra nhanh hơn

và có thể tạo ra rượu vang với hương vị đặc trưng [16,17,18]

I.2.4 Chỉ tiêu chọn lựa nấm men vang

Nấm men được lựa chọn đương nhiên là phải có đặc tính kỹ thuật phù hợpvới sản xuất rượu vang Sự đa dạng của đặc tính không chỉ phụ thuộc vào loại rượumà còn phụ thuộc vào quan điểm khác nhau của những nhà chuyên môn

Ngoài vai trò quan trọng của nấm men vang là xúc tác việc chuyển hóahoàn toàn và có hiệu quả đường thành cồn mà không tạo ra các hương vị không

mong muốn thì ngày nay, do yêu cầu ngày càng cao, canh trường Saccharomyces

cerevisiae cần phải có nhiều đặc tính khác, như liệt kê trong bảng 1.1 [15] Tuy

nhiên, để có thể kiểm tra hết tất cả các chỉ tiêu này thì tốn rất nhiều thời gian.Regodon và cộng sự (1997) đã đưa ra một phương pháp đơn giản và hiệu quả đểchọn lựa nấm men vang dùng trong sản xuất công nghiệp dựa trên các tính chấtcông nghệ của nấm men vang Phương pháp này chỉ bao gồm 2 bước [30]:

 Bước thứ nhất là bước chọn lọc sơ bộ dựa trên khả năng chịu đựng đối với

SO2, các loài có hại, khả năng phát triển tại nhiệt độ cao và sự tạo bọt thấp

 Bước thứ hai là bước chọn lọc chính thức dựa trên hàm lượng acid dễ bay hơivà ethanol tạo thành cũng như hàm lượng đường sót còn lại trong rượu vang

Bảng I.1 : Các đặc tính mong muốn của nấm men vang [15]

Đặc tính lên men

Thích nghi với quá trình lên men nhanh

Tốc độ sử dụng cơ chất và tốc độ hình

thành sản phẩm cao

Khả năng chịu cồn cao

Khả năng chịu áp suất thẩm thấu cao

Sinh khối tạo thành vừa phải

Các tính chất về hương vị

Tạo thành ít sulphite/DMS/thiol

Tạo thành ít acid dễ bay hơi

Tạo thành ít rượu bậc cao

Giải phóng ra các tiền chất hương

glycosylate

Hoạt tính esterase thấp

Đặc tính công nghệ

Tính ổn định cao về mặt di truyềnKhả năng chịu sulphite cao

Ít liên kết với sulphite

Ít tạo bọtCó khả năng kết bôngKết lắng cặn nhanhNhu cầu nitơ thấp

Các đặc tính trao đổi chất có liên quan đến sức khỏe con người

Tạo thành ít sulphiteTạo thành ít biogenic amineTạo thành ít ethyl carbamate (urea)

I.2.5 Kết hợp các giống nấm men và sử dụng kỹ thuật di

truyền trong sản xuất rượu vang

Theo nghiên cứu của Renouf và cộng sự (2006), việc quan sát sự tương tác giữa

Saccharomyces cerevisiae và Brettanomyces bruxellensis và những loài nấm men

khác đă xác định mặc dù Saccharomyces cerevisiae là tác nhân chính trong quá trình lên men cồn trong sản xuất rượu vang nhưng Brettanomyces bruxellensis có

khả năng chuyển hóa glucoza và fructoza thành ethanol và chịu được hàm lượng

cồn cao Trong môi trường sử dụng kết hợp Saccharomyces cerevisiae và

Brettanomyces bruxellensis, thời gian cần thiết để tiêu thụ toàn bộ lượng đường

ngắn hơn là trong môi trường chỉ có Saccharomyces cerevisiae Sự trao đổi chất của

Saccharomyces cerevisiae và Brettanomyces bruxellensis bổ sung cho nhau và giảm

thời gian tổng cộng lên men đường Sự kết hợp giữa Saccharomyces cerevisiae và

Metschnikowia pulcherrima làm tăng tốc độ lên men và cải thiện về mùi vị Còn

kết hợp giữa Saccharomyces cerevisiae và Candida stellata sẽ làm tăng hàm lượng

glycerin, tăng tốc độ lên men và chất lượng rượu vang.[11,12,13,31]

Trong những năm gần đây, kỹ thuật di truyền đã được ứng dụng để cải thiệncác đặc tính của nấm men vang:

Chương I: Tổng quan

 Shinohara và cộng sự (1994) đã nghiên cứu việc chọn lọc và lai giống cácchủng nấm men vang để cải thiện tốc độ lên men, tăng khả năng chịu đựngđối với SO2 và làm tăng chất lượng rượu vang [33]

 Serra và cộng sự (2005) đã nghiên cứu việc lai tạo giữa Saccharomyces

cerevisiae và Saccharomyces bayanus var uvarum để kết hợp ưu điểm của 2

loài này, làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất rượu vang có hàmlượng acid thấp (pH cao) [32]

Hình II.1 : Các kỹ thuật cơ bản để cố định tế bào [20]

Chương II: Các phương pháp cố định tế bào

II.1.1.3 Nhược điểm

Do không có màng chắn giữa các tế bào và dung dịch cho nên các tế bào dễ

bị tách ra, làm tăng hàm lượng tế bào tự do trong dung dịch [8,20]

Nếu điều chỉnh không cẩn thận, sự quá tải trên bề mặt chất mang có thể dẫnđến làm giảm hoạt tính xúc tác [8]

Sự thiếu không gian phù hợp giữa tế bào và chất mang có thể sản sinh ravấn đề liên quan đến sự cản trở không gian.[8]

II.1.1.4 Chất mang

Các vật liệu cellulose: DEAE-carrageenancellulose, gỗ, mùn cưa, mùn cưa đã táchlignine, … [20, 26]

Các vật liệu vô cơ: polygorskite, montmorilonite, hydromica, sứ xốp, thủytinh xốp, vòng Raschig, silicate, hợp chất titanium, … [20, 26]

II.1.2 Nhốt trong khung mạng xốp (tạo gel).

II.1.2.1 Nguyên tắc

Đưa tế bào vào bên trong một mạng đủ chặt để ngăn cản tế bào khuếch tánvào môi trường xung quanh, trong khi vẫn cho phép sự vận chuyển tự do của cácchất dinh dưỡng và sự trao đổi chất diễn ra [8, 20]

II.1.2.2 Ưu điểm

Có thể đạt được mật độ tế bào trong một đơn vị thể tích chất mang cao hơn

so với canh trường vi sinh vật tự do [26]

Chất mang có tác dụng bảo vệ tế bào chống lại thực khuẩn hoặc tế bàongoại lại cũng như những điều kiện gây stress [26]

II.1.2.3 Nhược điểm

Khi tế bào tăng quá nhiều sinh khối sẽ làm giảm độ bền của mạng gel.[20]Tế bào trên bề mặt tăng lên nhiều lần và dễ thoát ra khỏi mạng gel và pháttriển trong môi trường như là các tế bào tự do [20]

II.1.2.4 Chất mang

Polymer tự nhiên [20]:

- Polysaccharide: alginates, -carrageenancarrageenan, agar, chitosan vàpolygalacturonic acid

- Polymer khác: gelatin, collagen và polyvinyl alcohol

Polymer tổng hợp: polyacrylamide, polyurethane và polyvinyl chloride [26]

II.1.3 Keo tụ tế bào (tạo hạt).

II.1.3.1 Nguyên tắc

Sự tập hợp tế bào gia tăng kích thước của khối tế bào hoặc tạo huyền phù tếbào gắn thành cụm và lắng xuống để dễ dàng sử dụng trong các bình phản ứng Cóthể là keo tụ tự nhiên hoặc là keo tụ nhân tạo bằng cách tạo thành các liên kếtngang [20]

II.1.3.2 Ưu điểm

Đơn giản, dễ thực hiện

Không ảnh hưởng đến quá trình truyền khối

II.1.3.3 Nhược điểm

Do không có màng chắn giữa các tế bào và dung dịch cho nên các tế bào dễ

bị tách ra, làm tăng hàm lượng tế bào tự do trong dung dịch

II.1.4 Nhốt bằng phương pháp cơ học bên trong một màng chắn.

II.1.4.1 Nguyên tắc

Phương pháp này có thể được thực hiện theo 2 cách sử dụng màngmembrane vi xốp, sử dụng màng vi bao Phương pháp này giống với phương phápnhốt trong khung mạng xốp ở chổ tế bào tự do trong dung dịch, nhưng không gianbên trong là trống.[20, 21]

II.1.4.2 Ưu điểm

Canh trường lên men không bị lẫn tế bào, do đó sản phẩm tạo thành có thểkhông cần lọc [20, 26]

II.1.4.3 Nhược điểm

Khả năng truyền khối kém [20]

Màng membrane có thể bị bám bẩn do sự hấp phụ cơ chất lên bề mặt màng[20]

II.1.4.4 Chất mang

Membrane làm bằng vật liệu cellulose acetate, cellulose nitrat, polyamide[20, 26]

II.2 Yêu cầu về chất mang [20]

o Chất mang phải có bề mặt lớn với nhóm chức năng để tế bào có thểgắn vào

o Chất mang phải dễ điều khiển và tái sinh

Chương II: Các phương pháp cố định tế bào

o Với chất mang đó thì khả năng sống của tế bào và khả năng hoạt độngổn định của chất xúc tác sinh học phải cao và giữ được trong thời gian dài

o Hoạt động của vi sinh vật được cố định phải không bị ảnh hưởng bất lợibởi quá trình cố định

o Độ xốp của chất mang phải đồng đều và có thể kiểm soát, cho phép sựtrao đổi tự do của cơ chất, sản phẩm, cofactor, chất khí

o Chất mang phải có tính ổn định cơ học, hóa học, nhiệt, sinh học vàkhông dễ dàng bị giảm giá trị bởi enzim, dung môi, sự thay đổi áp suất hoặc lựcuốn cắt

o Chất mang và kỹ thuật cố định phải dễ thực hiện, và hiệu quả về kinhtế

o Chất mang phải thuộc loại thuần khiết tiêu chuẩn thực phẩm, khôngảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm bởi việc còn lại những phần cặn và dễ dàngđược chấp nhận bởi người tiêu dùng

II.3 Ưu, nhược điểm của tế bào cố định.

II.3.1 Ưu điểm của tế bào cố định hơn tế bào tự do: [20]

o Hoạt động kéo dài và sự ổn định của chất xúc tác sinh học, chất mangcó thể đóng vai trò như một chất bảo vệ chống lại ảnh hưởng hóa lý của nhiệt độ,

pH, dung môi, hoặc thậm chí là kim loại nặng

o Mật độ tế bào trên một đơn vị thể tích của thiết bị phản ứng sinh họccao hơn, thời gian phản ứng ngắn hơn và sự loại bỏ sự tăng trưởng của những tếbào vi sinh vật không có lợi

o Sự hấp thu cơ chất tăng và năng suất được cải thiện

o Có thể thực hiện được với quá trình liên tục

o Khả năng chịu đựng được nồng độ cơ chất cao tăng, và giảm sự ức chếcủa sản phẩm cuối

o Với quá trình lên men, có thể thực hiện ở nhiệt độ thấp dẫn đến cảithiện chất lượng cho một số sản phẩm

o Hoàn thiện sản phẩm dễ dàng hơn do giảm được thủ tục tách chiết vàlọc, do đó giảm giá thành cho thiết bị và yêu cầu về năng lượng

o Sự tái sinh và tái sử dụng chất xúc tác sinh học cho nhiều thời của sựvận hành gián đoạn mà không phải tháo bỏ nó ra khỏi thiết bị phản ứng sinh học

o Giảm rủi ro nhiễm vi sinh vật có hại bởi vì mật độ tế bào cao

o Có thể sử dụng thiết bị phản ứng sinh học nhỏ hơn, với sự thiết kế quátrình sông nghệ đơn giản hóa và do đó giảm chi phí vốn

o Giảm thời gian sản xuất ra sản phẩm

II.3.2 Nhược điểm của tế bào cố định:

o Khi sử dụng tế bào vi sinh vật cố định, trong môi trường sản xuất, hiệntượng rò rỉ hay rửa trôi tế bào ra khỏi chất mang ít hay nhiều là điều không thểtránh khỏi Do đó, việc thu nhận và tinh sạch sản phẩm đôi khi cũng khá phức tạp

o Tế bào cố định đòi hỏi nhiều nguồn dinh dưỡng và năng lượng đa dạngđảm bảo khả năng phát triển và hoạt động bình thường Khi đó, trong hệ thống sửdụng tế bào cố định có thể xảy ra hiện tượng phân huỷ sản phẩm để cung cấp đầyđủ chất dinh dưỡng và năng lượng cần thiết cho tế bào Vì thế mà hiệu suất sửdụng tế bào cố định có thể thấp hơn hiệu suất sử dụng tế bào tự do

o Do được bao bọc bởi chất mang, thành tế bào, màng tế bào chất, … cóthể gây cản trở việc thẩm thấu cơ chất, sản phẩm và các cấu tử từ môi trường ravào tế bào

o Một nhược điểm thường thấy ở những tế bào vi sinh vật được “gói”trong khuôn có cấu trúc gel, những cơ chất có kích thước phân tử lớn sẽ không cóđiều kiện tiếp xúc với tế bào vi sinh vật cố định Vì thế mà hoạt lực của những tếbào cố định có thể sẽ thấp hơn so với những tế bào tự do

o Trong trường hợp cụ thể khi sản xuất ethanol, người ta không quan tâmđến sự ức chế của ethanol lên hoạt động sống của nấm men khi tiến hành lên mengián đoạn, khi đó nấm men chỉ được sử dụng một lần rồi được hoạt hoá lại cho lầnsản xuất tiếp theo Tuy nhiên, mức độ ảnh hưởng của ethanol đến hoạt động củanấm men là rất lớn trong quá trình lên men liên tục Sau khi lên men, hoạt tính củatế bào nấm men có thể bị ức chế bởi ethanol Tương tự như vậy, khi sử dụngphương pháp cố định nấm men để sản xuất ethanol liên tục, hoạt tính của nấm mencố định cần được duy trì và nồng độ ethanol phải thấp để không gây ức chế đến tếbào nấm men Như thế thì hiệu suất thu nhận sản phẩm không cao Nhiều phươngpháp tháo sản phẩm liên tục khỏi thiết bị lên men được nghiên cứu nhằm tránhnhững tác động không tốt của sản phẩm lên men đối với nấm men

Tài liệu tham khảo

Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae AXAZ-carrageenan1 chịu cồn, chịu lạnh cho

tăng trưởng trong môi trường bán tổng hợp chứa 20 g glucose/L, 4g chất chiết nấmmen/l, 1g (NH4)2SO4/L, 1g KH2PO4/L and 5 g MgSO4.7H2O/L, và môi trường đượctiệt trùng trước đó ở 121oC trong 20 phút Những chủng này được nuôi trong bìnhtĩnh dưới điều kiện hiếu khí tuỳ tiện ở 24oC trong 24 giờ, và được tách ra bằng lytâm ở 3000 vòng/phút trong 10 phút

Vỏ nho được thu nhận bằng cách ép triệt để bã 20g tế bào Saccharomyces

cerevisiae, được chuẩn bị như mô tả ở trên, tạo huyền phù bên trong 1 lít môi

trường bán tổng hợp (chứa 120g glucose/L, pH 4,8) 400g vỏ nho ẩm (khối lượngkhô khoảng 88g), đã tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút, được cho vào huyền phù tếbào và toàn bộ được để lên men không lắc ở 25oC trong 6-carrageenan8 giờ, dưới điều kiệnhiếu khí tuỳ tiện Chất lỏng bên trên được gạn chắt và chất mang được rửa 2 lần,mỗi lần với 400 ml dịch nho Tế bào đã cố định được dùng để lên men trực tiếpdịch nho

c Hiệu quả sản xuất của tế bào nấm men rượu vang cố định trên vỏ nho:

Tài liệu tham khảo

Hình III.2 Hiệu suất sản xuất cồn ở những nhiệt độ lên men khác nhau.

Hình III.3 Năng suất riêng của việc sản xuất cồn ở những nhiệt độ khác nhau.

So sánh với tế bào tự do, Saccharomyces cerevisiae khi liên kết trên vỏ nho

có tốc độ hấp thu glucoza, fructoza, và khả năng sản xuất cồn nhanh hơn ở tất cảnhiệt độ nghiên cứu (0-carrageenan25oC)

Năng suất ethanol tăng không đáng kể khi nhiệt độ lên men giảm

Tế bào cố định có tốc độ riêng của việc sản xuất ethanol cao hơn tế bào tự

do ở mọi nhiệt độ Tốc độ riêng của việc sản xuất ethanol tăng theo hàm mũ khinhiệt độ tăng Quá trình lên men với tế bào cố định thuận lợi hơn tế bào tự do ởmọi nhiệt độ nghiên cứu Chuyển đường thành ethanol nhanh và hiệu quả hơn,thậm chí ở nhiệt độ cao hơn lượng đường dùng cho hoạt động tăng trưởng hoặc hoạtđộng duy trì của nấm men cũng gần như không đổi

Khi tái sử dụng nấm men cố định trên vỏ nho, sự tổn thất tế bào vào khoảng10% lượng tế bào ban đầu Đó là do quá trình rửa với dịch nho (2 lần, mỗi lần

400mL) , trước khi bắt đầu mỗi mẻ lên men Tuy nhiên sự tổn thất này được bù ởgiai đoạn đầu của quá trình lên men.

Phương pháp thực hiện đơn giản , nhanh, rẻ và không có hoá chất

III.1.2.2 Miếng táo:

Quả và nước quả thường được sử dụng như là một phụ gia trộn vào nhautrong quá trình sản xuất của nhiều loại thực phẩm, đặc biệt là trong sản xuất thứcuống Thêm vào đó, rượu táo, là một thức uống có cồn với mùi vị thơm ngon, đượcsản xuất từ dịch quả táo Do đó mà việc sử dụng miếng táo làm chất mang cố địnhtế bào nấm men trong sản xuất rượu vang, bên cạnh hiệu quả cải thiện khả năngsống sót của tế bào, nó còn có thể tạo ra sản phẩm được cải thiện về mùi vị [21]

a Giới thiệu về chất mang:

Táo là một loại quả nhiều và phong phú và nó tương hợp với mùi và vị củarượu Do đó người ta dùng miếng táo như là chất mang để cố định tế bào nấm menvà ứng dụng trong sản xuất rượu vang.[21]

Miếng táo được dùng cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae cho sản

xuất rượu vang ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ thấp Sở dĩ nghiên cứu ở nhiệt độ này

vì nhiệt độ lên men thấp cho chất lượng sản phẩm cao hơn.[21]

Sự cố định nấm men lên chất mang có thể thực hiện như là kết quả của liênkết hydro, sự nhốt tế bào bên trong cấu trúc táo, lực Van der Waals lực hấp phụgây ra bởi việc nhồi tế bào vi sinh vật vào khối tế bào táo.[19]

Tài liệu tham khảo

b.Chất mang và phương pháp cố định tế bào: [22]

Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae AXAZ-carrageenan1 chịu cồn chịu lạnh cho

tăng trưởng trong môi trường chứa (%w/v) 4% glucoza; 0,4% chất chiết nấm men;0,1% (NH4)2SO4; 0,1% KH2PO4/l và 0,5% MgSO4

Để cố định tế bào, miếng táo được sử dụng như một chất mang 425g táo đãđược cắt miếng cho vào bên trong một xylanh thủy tinh 1 lít, sau đó cho 500 ml môitrường vào xylanh Môi trường gồm có 12% glucoza; 0,4% chất chiết nấm men;0,1% (NH4)2SO4; 0,1%KH2PO4; và 0,5% MgSO4 trong nước cất và có pH là 5,6;

không điều chỉnh pH 10g chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae ở trên được

cho vào xylanh và để lên men đến một nồng độ khoảng 0,5oBe Sau đó, dịch lênmen được gạn ra, và chất mang được rửa 2 lần với 400ml dịch nho (sử dụng dịchnho được dùng cho lần lên men kế tiếp) Sau đó nấm men được dùng để lên mencồn trong sản xuất rượu vang

Miếng táo

Môi trường chứa nấm menPhối trộn

Hình III.4 Nấm men cố định trên miếng táo trong quá trình lên men rượu.

c Hiệu quả sản xuất rượu vang:

SỰ CỐ ĐỊNH VÀ LÊN MEN: [22]

Để cố định tế bào những miếng táo được phối trộn với môi trường lỏng củachủng nấm men chịu cồn và chịu lạnh và để trong 8 giờ Chất xúc tác sinh học đãđược chuẩn bị được dùng cho lên men gián đoạn ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ thấpvới nồng độ ban đầu là 12oBe

Sau mỗi 12 mẻ lên men phần trăm thể tích táo còn lại trong xy lanh được đođể xác định thể tích miếng táo còn lại sau một thời gian dài lên men Thể tích táocòn lại là 94,4% thể tích ban đầu Thể tích giảm chủ yếu ở những mẻ lên men đầu.Điều này bởi vì sự chuyển đổi đường trong táo thành ethanol và/hoặc thay thế bằngtế bào Sau khoảng thời gian đó thì thể tích miếng táo ổn định cho đến khoảng 7tháng bởi vì miếng táo chỉ còn lại cellulose và những thành phần không thể lênmen khác

KHI LÊN MEN GIÁN ĐOẠN Ở NHIỆT ĐỘ PHÒNG VÀ NHIỆT ĐỘ THẤP: [21]

Trong khoảng thời gian lên men 7 tháng thì hoạt tính xúc tác không bị mất.Năng suất sản xuất rượu giảm khi nhiệt độ giảm , nhưng thậm chí ở nhiệt độ thấpnăng suất vẫn cao hơn nhiều lần khi so sánh với lên men truyền thống Ở 6oC, chấtxúc tác sinh học sản xuất rượu trong 8 ngày, ngắn hơn khoảng thời gian cần thiếtlên men dịch nho tự nhiên và trong công nghiệp sử dụng chủng nấm men thươngmại có sẵn Ở 1oC sản xuất rượu vang hiệu quả trong 1 tháng

Nồng độ ethanol và đường còn sót lại nằm ở khoảng giữa rượu vang khô vàvang bán ngọt Nồng độ cao của đường sót được quan sát ở một vài mẻ lên menđược thực hiện cho đến khi nồng độ khoảng 0,5-carrageenan1oBe (được dừng lại một cách cốý), để giữ lại hoạt tính cho tế bào Sự giảm nhẹ của axit tổng được quan sát khi

Tài liệu tham khảo

nhiệt độ lên men giảm có thể là bởi vì sự kết tinh của muối tartaric khi nhiệt độgiảm Tuy nhiên sự giảm này không đáng kể trong tất cả trường hợp Lượng axitbay hơi rất thấp nên chất lượng sản phẩm cao

Lên men liên tục: [21]

Saccharomyces cerevisiae cố định trên miếng táo được dùng trong quá trình

lên men liên tục Thiết bị phản ứng vận hành liên tục trong 95 ngày mà không cósự giảm bớt hoạt tính chất xúc tác sinh học Sự ổn định về vận hành của hệ thốngđược quan sát ít nhất là 71 ngày Sự ổn định về vận hành có thể do khả năng chịulượng cồn cao của chất xúc tác sinh học mang trên miếng táo, cũng như tính chịulạnh tự nhiên của chủng nấm men sử dụng Chất xúc tác sinh học được mang trênmiếng táo tỏ ra là bền về động học và hoá học trong suốt quá trình liên tục Thêmvào đó nấm men được cố định nhìn chung là ổn định trong 95 ngày và không có sựkhác biệt về hoạt động trao đổi chất Nói chung, năng suất sản xuất rượu cao hơntrong trường hợp lên men gián đoạn, đặc biệt là ở nhiệt độ thấp Trong trường hợpnày thì năng suất sản xuất rượu mỗi ngày cũng giảm khi nhiệt độ lên men giảm.Lượng ethanol và đường sót trong khoảng giữa rượu vang khô và bán ngọt Ở nhiệtđộ thấp nồng độ đường sót cao bởi vì tốc độ dòng chảy cao để đạt năng suất tối đa.Lượng axit tổng ở mức giữa vang khô và vang bán ngọt, và lượng axit bay hơi thấp

Mặc dù quá trình lên men rượu được thực hiện trên dịch quả đã khử trùng,kỹ thuật lên men cũng có thể ứng dụng trên dịch quả tươi, khi mà nấm men cố địnhtrội hơn trong dịch lên men nhờ vào nồng độ cao của tế bào nấm men Do đó sựphát triển của nấm men dại có thể tồn tại trong dịch quả tươi sẽ bị ức chế Thêmvào đó thời gian lên men thấp, nên không có khả năng có sự chuyển hóa cơ chấtcủa hệ vi sinh vật tự phát ảnh hưởng lên quá trình lên men và chất lượng sản phẩm

Bảng III.2: Kết quả kiểm tra mùi và vị của rượu sản xuất từ tế bào Saccharomyces

cerevisiae cố định trên miếng táo trong suốt quá trình lên men liên tục so sánh với

rượu thương mại:[19]

Giá trị có nghĩa : 0 là không chấp nhận, 10 là tuyệt vời

III.1.2.3 Vật liệu cellulose đã loại lignin (DCM): [5]

a.Nguyên tắc:

Loại lignin ra khỏi cellulose để tạo lổ trống trên mùn cưa, do đó nó thích hợp đểnhốt tế bào vào lổ xốp Cố định tế bào bằng lực Van der Waal, liên kết hóa họcnhư liên kết hydro giữa nhóm hydroxyl của cellulose và nhóm cacboxyl, hydroxylvà cacboxyl của thành tế bào

b Sự chuẩn bị DCM và cố định tế bào :

Cách 1:

Tế bào tăng trưởng trong môi trường với nồng độ Be vào khoảng 7,1-carrageenan11,4;0,4% chất chiết nấm men; 0,1% (NH4)2SO4; 0,1% KH2PO4/l và 0,5% MgSO4 Trướcđó môi trường được tiệt trùng ở 130 oC trong 15 phút

Một chén lớn 5 lít được cho vào 300g mùn cưa và 3 lít dung dịch natrihydroxit 1% Hỗn hợp này được đun nóng 3 giờ ở nhiệt độ sôi, và thể tích nướctrong suốt quá trình đun nóng được giữ không thay đổi bằng cách đổ thêm nướcvào Sau đó nó được lọc qua phễu, và DCM được rửa một vài lần với nước nóng

80oC Sản phẩm được ấn qua một cái phễu bởi một cái chén lớn để loại nước Sựchuẩn bị này để tạo ra một DCM ẩm được dùng tiếp theo cho cố định tế bào

Trong môi trường 800ml chứa khoảng 12% glucoza với pH 4,8 (được điều

chỉnh bởi cho thêm axit sunfuric ) cho vào 16g tế bào ẩm Saccharomyces cerevisiae.

Nó được trộn với 170g DCM ướt và để lên men trong 6 giờ Sau thời gian này chấtlỏng được rót ra và chất rắn được rửa 2 lần, mỗi lần 400ml môi trường chứaglucoza Sau khi lọc và ấn trên phễu, chất xúc tác sinh học được mang trên DCMđược thu, và được dùng trực tiếp cho quá trình lên men theo mẻ

Tài liệu tham khảo

Cách 2:

Cung cấp mùn cưa vào mỗi ngăn của thiết bị phản ứng sinh học Và thiết bịphản ứng được làm đầy bằng nước, cung cấp từ trên cho đến khi cao hơn lớp mùncưa Sau đó NaOH được thêm vào cho đến nồng độ 1% Hơi nước được dùng đểtăng nhiệt dộ lên 100oC và gia nhiệt trong 3 giờ Sau đó nước từ vòi được cung cấptrong trong 3 giờ để rửa DCM nhưng nước không được loại DCM, tiếp theo là quátrình khuấy bằng không khí Quá trình rửa, khuấy được thực hiện đến pH của nướcbằng 7 Chất mang sẵn sàng để cố định tế bào Dịch nho ở 25oC chứa 20 g/l tế bào

Saccharomyces cerevisiae được rót vào trong thiết bị phản ứng sinh học đến khi nó

vượt qua lưới Dịch nho được để lên men và một thời gian ngắn trước khi hoànthành quá trình lên men dịch nước nho khác không khử trùng được cung cấp vào

Mùn cưaLoại lignin

Đun nóngLọc qua phễu

NaOH

Môi trường tăng trưởng

Phối trộn

Rửa với nước

Tiệt trùng

Lên men

Rót dịchRửa

Tế bào cố định trên DCM

với tốc độ 400l/h Nhiệt độ thì giảm mỗi ngày 2oC cho đến 16oC Sự cung cấp dịchnho phải được điều chỉnh đưa vào một lượng để đạt được nồng độ oBe lúc ra gầnbằng 0 Lượng DCM vào cylon được tái sử dụng trong thiết bị phản ứng sinh học.Nếu như chất mang bị nhiễm, quá trình sẽ dừng lại, rượu được gạn và toàn bộ quátrình được lặp lại.[36]

c Hiệu quả sản xuất của tế bào nấm men rượu vang cố định trên DCM: [5]

Quá trình lên men theo mẻ ở những nhiệt độ khác nhau được thực hiện bởichất xúc tác được mang trên DCM thì nhanh hơn tế bào tự do với nồng độ tế bàonhư nhau Tốc độ lên men tăng ít nhất 3 lần khi so sánh với tế bào tự do

Tăng tốc độ sản xuất ethanol

Vận hành ổn định cao

Chất xúc tác sinh học mang trên DCM làm giảm năng lượng hoạt hóa

Cellulose làm tăng cường hoạt động lên men

Cải thiện về chất lượng cảm quan DCM là chất mang tinh khiết tiêu chuẩnthực phẩm, rẻ , phong phú, dễ dàng chuẩn bị về mặt công nghiệp, dễ được chấpnhận bởi người tiêu thụ, không dùng thêm hóa chất

d So sánh với chất mang khác [36]

Dùng chất mang là DCM cho vị tốt hơn khi so sánh với gluten pellet và chấtmang vô cơ kissiris, giảm lượng độc tố khi so sánh với gluten pellet và chất mangvô cơ kissiris Dùng DCM cải thiện về mùi vị khi tiến hành lên men ở nhiệt độthấp

Giảm một lượng lớn chất bay hơi như rượu bậc cao và rượu amyl

DCM không đắt và dễ dàng điều khiển trong lĩnh vực công nghiệp, có thểđược tải vào hoặc trút ra dễ dàng hơn khi so sánh với gluten và kissiris Nó cũng làmột vật liệu phổ biến trong tự nhiên và tinh khiết theo tiêu chuẩn thực phẩm

III.1.2.4 Đá kissiris:

a Giới thiệu về chất mang: [39a]

Đá kissiris được hình thành từ lớp bọt dày của dung nham núi lửa Khoángrắn chứa SiO2 vào khoảng 70% về khối lượng

Kissiris có độ gồ ghề và tính xốp cao Nó cung cấp một diện tích bề mặt lớnvà dễ dàng liên kết tế bào Tính chất ổn định và tính trơ bẩm sinh của chất mang tựnhiên này là một ưu thế hơn những chất mang tổng hợp Kissiris có tính bền, ổnđịnh, nguồn gốc tự nhiên

Tài liệu tham khảo

Mặc dù cả kissiris và tế bào nấm men đều tích điện âm trên bề mặt, kissiris

ít điện tích âm hơn và trong khoảng pH từ 3 đến 7 thì sự liên kết với tế bào nấmmen có thể xảy ra

Nhược: Nguyên liệu có thể bị rã ra trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật, vàcó thể thải ra một số độc tố không mong muốn trong môi trường

b Phương pháp chuẩn bị Kissiris:[39]

Một miếng kissiris khoảng 100g được đập vỡ thành những miếng tròn đườngkính khoảng 1cm sử dụng một cái búa nhỏ Những miếng kissiris được ngâm vàotrong dung dịch NaOH 0,1M trong một vài phút, sau đó được ngâm trong dung dịch

H2SO4 0,05M Những miếng này được rửa với nước cất một vài lần cho đến khi pHcủa dung dịch là pH 6,5 và không còn tính chất axit Chúng được đặt trong một cáicốc đặt trong bể nước sôi trong 10 phút và sau đó làm khô chúng trong lò ở 105oCsuốt đêm Cuối cùng kissiris được khử trùng ở nhiệt độ 180oC trong một giờ

Hình III.5 Đá kissiris.

KissirisNgâm

Làm khôRửa

Kissiris đã được chuẩn bị

c Hiệu quả của phương pháp cố định: [3]

Chất xúc tác sinh học được mang trên kissiris, được chuẩn bị bằng cách cốđịnh chủng nấm men chịu cồn, chịu lạnh trên mineral kissiris, phù hợp với quá trìnhsản xuất rượu vang liên tục ở nhiệt độ thấp (5-carrageenan16oC) Năng suất sản xuất ethanol ở

5oC bởi quá trình lên men liên tục thì bằng với năng suất quan sát ở nhiệt độ 22-carrageenan

25oC bởi quá trình lên men tự nhiên Hiệu quả quan trọng đạt được ở nhiệt độ thấplà do sự giảm năng lượng hoạt hóa, gây ra bởi chất mang mineral kissiris Thiết bịlên men liên tục hoạt động trong 75 ngày mà không có sự giảm bớt năng suất sảnxuất ethanol Và điều cuối cùng là rượu được sản xuất với lượng axit tổng cộng vàaxit bay hơi thấp khi so sánh với rượu đạt được bởi quá trình lên men tự nhiên ở 22-carrageenan

25oC

Vấn đề bảo quản chất mang liên tục ở nhiệt độ thấp: Tăng tính ổn định củachất xúc tác sinh học và tăng năng suất sản xuất ethanol và rượu Đặc biệt tế bàocó thể sống trong 2,5 năm, sản xuất rượu theo mẻ và quá trình liên tục Thêm vàođó năng suất sản xuất rượu và ethanol cao hơn ít nhất là năm lần khi so với tế bàocố định trên chất mang tương tự mà không bảo quản ở nhiệt độ thấp Sự chuyểnhóa và nồng độ ethanol cao hơn khi lên men với chất xúc tác mang trên kissiris màkhông bảo quản liên tiếp ở 0oC

III.1.2.5 DEAE-cellulose [24]

a Chất mang và nguyên tắc cố định tế bào:

Hạt DEAE-carrageenancellulose (trao đổi ion yếu) là chất mang có thể tiệt trùng đượcvà có tính chất không nén, kết tụ với polystyrene Nó bền trong môi trường axit vàkiềm, có thể chịu được nhiệt độ lên đến 100 oC nên dễ dàng tiệt trùng trong cột

Hệ thống chất mang được chuẩn bị như sau, hydrat hóa chất mang khô trongnước sau đó bơm vào cột phản ứng Quá trình cố định tế bào nấm men được thựchiện sau khi tiệt trùng chất mang bằng cách bơm hỗn hợp huyền phù nấm men vàotrong thiết bị phản ứng Chất mang DEAE-carrageenancellulose có khả năng liên kết nấm menlên bề mặt của nó Đó là nhờ vào đặc điểm bề mặt chất mang, gồ ghề, có mắt lưới,và tồn tại một mạng xốp dạng hạt hoặc liên tục Khả năng liên kết này là do lựcđiện từ giữa nhóm trao đổi anion (tích điện dương) của chất mang và thành tế bàotích điện âm

Mật độ tế bào nấm men tốt nhất là vào khoảng 109-carrageenan1012 tế bào trên 1 lít củachất mang, tối ưu là khoảng 109 tế bào Mật độ phải có khả năng cung cấp đủ hoạttính xúc tác để chuyển đường thành ethanol

Tài liệu tham khảo

b Phương pháp chuẩn bị cột và cố định tế bào

Trước tiên cho nước vào nửa bình hydrat hoá, khởi động hệ thống và chochất mang khô vào bình Khi quá trình hydrat hóa hoàn thành (khoảng 5 giờ), chonước vào reactor đến phân nửa và hỗn hợp chất mang từ bình hydrat được chuyểnvào reactor Để giữ mức nước trong reactor ổn định, van dưới cùng trong reactorđược điều chỉnh để dòng chảy vào và ra như nhau Chất mang trong thiết bị đượckhử trùng với dung dịch kiềm pha loãng bằng cách bơm nó qua reactor Đệm chấtmang sau đó được rửa với nước và trung hoà bằng một lượng axit loãng phù hợpbơm qua reactor và cuối cùng đệm chất mang được rửa bằng nước đã khử trùng

Hỗn hợp nấm men được bơm qua đệm chất mang trong khoảng 1 -carrageenan 4 giờ vànấm men tự bản thân nó liên kết với chất mang Nấm men cố định lên trên chấtmang trong reactor

c Hiệu quả của phương pháp cố định:

Chất mang là một điều kiện quan trọng để cung cấp môi trường cho nấmmen tăng trưởng và tiếp xúc với cơ chất Chất mang trao đổi anion, không nénDEAE-carrageenancellulose có một vài đặc trưng có lợi hơn khi so sánh với chất mang mềmdạng gel như hạt gel alginat Đó là gặp ít vấn đề về chuyển khối hơn, cố định dễdàng hơn, sự khởi động nhanh hơn, mở rộng phạm vi dễ dàng hơn, cải thiện về khả

Chất mang Hydrat hoáChuyển vào reactorKhử trùngRửa và trung hoà

Tế bào cố định