Khảo sát tỷ lệ gen CYP1A1 2b và GSTM1 ở bệnh nhân ung đại trực tràng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI PHẠM THỊ THANH THUỶ KHẢO SÁT TỶ LỆ GEN CYP1A1*2B VÀ GSTM1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Hμ néi – 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI PHẠM THỊ THANH THUỶ KHẢO SÁT TỶ LỆ GEN CYP1A1*2B VÀ GSTM1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG Chuyên ngành : miÔn dÞch Mã số : 60.72.04 LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Ng−êi h−íng dÉn khoa häc 1. TS. PHẠM ĐĂNG KHOA 2.TS. TRẦN VÂN KHÁNH Hμ néi - 2010 Lời cảm ơn Trong quá trình học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận đợc rất nhiều sự giúp đỡ và động viên của các thầy cô giáo, bạn bè đồng nghiệp và gia đình. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Phạm Đăng Khoa và TS. Trần Vân Khánh những ngời Thầy tận tình, hết lòng vì học trò, đã hớng dẫn giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập v nghiờn cu. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn: - PGS.TS Nguyễn Thị Thu, PGS.TS. Lê Trần Ngoan đồng chủ nhiệm dự án Dịch tễ học phân tử ung th dạ dày đại trực tràng đã hỗ trợ tôi về kinh phí và cho phép tôi thực hiện nghiên cứu này. - PGS.TS. Tạ Thành Văn Phó hiệu trởng trờng Đại học Y Hà Nội đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quí báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn này. - Th.S. Lê Ngọc Anh, CN. Nguyễn Vn Tut, KTV Phan Mai Hoa và nhóm nghiên cứu đã tham gia thực hiện nghiên cứu này. - PGS.TS Trần Thị Chính, GS.TS H Vn Quyt, PGS.TS Nguyễn Văn Hiếu, GS.TS. Nguyn Bỏ c, PGS.TS Nguyễn Ngọc Bích, đồng chủ nhiệm các nhánh của đề tài nghị định th hợp tác với Nht Dịch tễ học phân tử ung th dạ dày, ung th đại-trực tràng - PGS. TS Lê Văn Phủng, Viện trởng, Viện Kiểm định Vắc xin và Sinh phẩm Y tế ; PGS.TS. Đỗ Hoà Bình Trởng khoa Kiểm định Sinh phẩm Y tế và các bạn đồng nghiệp nơi tôi công tác đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập. - Ban Giám hiệu và Phòng đào tạo Sau đại học ; Bộ môn Miễn dịch- Sinh lý bệnh, Labo Gen Protein, Trờng Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng tôi xin cảm ơn tới những ngời thân trong gia đình đã luôn luôn bên cạnh động viên khuyến khích và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập công tác cũng nh trong cuộc sống. Hà Nội, ngày 16 Tháng 08 năm 2010 Phạm Thị Thanh Thuỷ LờI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đề tài do chính tôi thực hiện, số liệu và kết quả trong đề tài này là hoàn toàn trung thực và cha đợc công bố trên một công trình nghiên cứu khoa học nào. Tôi xin hon toàn chịu trách nhiệm với những cam kết trên. Hà nội, ngày 15 tháng 8 năm 2010 Ngời cam đoan Phạm Thị Thanh Thuỷ MC LC T VN 1 CHNG 1: TNG QUAN 4 1.TèNH HèNH MC BNH UNG TH I TRC TRNG 4 1.1. Trờn th gii 4 1.2. Ti Vit Nam 4 2. NGUYấN NHN V CC YU T NGUY C 5 2.1. Ch dinh dng 5 2.2. Tn thng viờm mn tớnh 6 2.3. Yu t di truyn 6 2.3.1. Cỏc yu t di truyn trong ung th i trc trng khụng cú a polyp (Hi chng Lynch) 7 2.3.2. Cỏc yu t di truyn trong ung th i trc trng cú a polyp.8 3. CHT GY UNG TH 9 4. GEN CYP1A1 V GSTM1 TRONG UNG TH V UTTT 11 4.1. Tớnh a hỡnh thỏi ca gen CYP1A1 11 4.2. Tớnh a hỡnh thỏi ca gen GSTM1 13 4.3. Vai trũ ca gen CYP1A1 v gen GSTM1 trong ung th v UTTT 15 5. K thut PCR(Polymerase Chain Reaction) 18 6. K thut Sequencing 19 CHNG 2: I TNG V PHNG PHP NGHIấN CU 20 2.1. Đối tợng nghiên cứu 20 2.1.1. Tiêu chuẩn chọn đối tợng nghiên cứu 20 2.1.2. Đối tợng nghiên cứu đợc thu thập tại 03 Bệnh viện 20 2.2. Phơng pháp nghiên cứu 20 2.2.1. Thit k nghiờn cu 20 2.2.2. C mu nghiờn cu 20 2.2.3. Các bớc nghiên cứu 21 2.3. CC K THUT XC NH GEN CYP1A1*2B V GSTM1 22 2.3.1. Kỹ thuật PCR 22 2.3.3. K thut Sequencing 34 2.4. Địa điểm nghiên cứu 36 2.5. Xử lý số liệu 36 CHNG 3: KT QU NGHIấN CU 37 3.1. THễNG TIN CHUNG V I TNG NGHIấN CU 37 3.2. KT QU CHIT TCH DNA 38 3.3. KIU GEN CYP1A1*2B 45 3.2. GEN GSTM1 49 3.5. Mối liên quan giữa gen CYP1A1*2B, ện gen GSTM1 và UTTT 53 3.6. KT QU TCH DềNG GII TRèNH T GEN 40 CHNG 4: BN LUN 54 4.1. KT QU TCH DềNG GII TRèNH T GEN 4.2. THễNG TIN CHUNG V I TNG V PHNG PHP NGHIấN CU 55 4.3. Tỷ Lệ KIểU gen CYP1A1 *2b 56 4.4. GEN GSTM1 60 4.5. Mối liên quan giữa kiểu gen CYP1A1*2B, GSTM1 Và UTTT 62 Kết luận 66 KIếN NGHị 67 TI LIU THAM KHO PH LC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AHH Aryl hydrocacbon hydroxylase CYP Cytochrome P450 CEA Carcino Embronic Antigen CA 19-9 Carbonhydrat Antigen 19-9 CA -50 Cancer Antigen 50 DNA Deoxynucleic acid ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate GST Glutathione - S - Transferase HNPCC Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer NATs N - acetyl - transferase PCR Polymerase Chain Reaction PAH Polycyclic aromatic hydrocacbon IARC International Agency for Research on Cancer SNP Single Nucleotide Polymorphism TNM Tumor lympho Node Metastasis TSNA Tobaco Specific Nitrosamine UT Ung thư UTĐTT Ung thư đại trực tràng WHO World Health Organization DANH MỤC BẢNG B¶ng 1.1. C¸c d¹ng SNP cña gen CYP1A1 12 B¶ng 1.2. Mèi liªn quan CYP1A1 vµ GSTM1 víi ung th− 17 Bảng 3.1: Phân bố đối tượng theo tuổi của hai nhóm nghiên cứu 37 Bảng 3.2: Phân bố đối tượng theo giới của hai nhóm nghiên cứu 38 Bảng 3.3. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA sau chiết tách 39 Bảng 3.4: Phân bố kiểu gen CYP1A1 ở nhóm chứng 46 Bảng 3.5. Phân bố kiểu gen CYP1A1 ở nhóm bệnh 47 B¶ng 3.6. Mèi liªn quan gi÷a kiểu gen CYP1A1*2B vµ UT§-TT 48 Bảng 3.7. Phân bố kiểu gen GSTM1 ở nhóm chứng 50 Bảng 3.8 Phân bố kiểu gen GSTM1 ở nhóm bệnh nhân UTĐTT 51 B¶ng 3.9. Mèi liªn quan gi÷a biÓu hiÖn gen GSTM1 vµ UT§-TT 52 B¶ng 3.10. Mèi liªn quan gi÷a kiểu gen CYP1A1, GSTM1 vµ UT§-TT 53 DANH MC HèNH NH Hình 1.3. Đại gia đình gen GST 13 Hình 1.4. Sơ đồ gen GSTM1 khi đột biến mất gen 14 Hình 1.5. Sơ đồ chuyển hóa chất gây ung th trong cơ thể 15 Hình 3.3. Điện di sản phẩm PCR khuch i gen CYP1A1*2B trong gel agarose 1,8%, hiệu điện thế 100V, trong 15 phút 45 Hỡnh 3.4. Phõn b kiu gen CYP1A1 nhúm chng 46 Hình 3.5.Phân bố kiểu gen CYP1A1*2B ở nhóm UTĐTT 47 Hình3.6. Phân bố kiểu gen CYP1A1*2B ở hai nhóm nghiên cứu 48 Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen GSTM1 trong gel agarose 2,0%, hiệu điện thế 100V, trong 30 phút 49 Hình3.8. Phân bố tỷ lệ kiu gen GSTM1 ở nhóm chứng 50 Hỡnh 3.9. Phõn b kiu gen GSTM1 nhúm bnh nhõn UTTT 51 Hình 3.10. Phân bố kiu gen GSTM1 ở hai nhóm nghiên cứu 52 Hỡnh 3.11. Sn phm khuch i on gen CYP1A1*2B. 41 Hỡnh 3.12. Sn phm khuch i on gen GSTM1 42 Hỡnh 3.13. Hỡnh nh in di DNA plasmid 42 Hỡnh 3.14. Kt qu c trỡnh t gen CYP1A1*2B s dng h thng sequencer t ng ABI 43 Hỡnh 3.15. Kt qu so sỏnh trỡnh t t c v trỡnh t GeneBank ca gen CYP1A1*2B 43 Hỡnh 3.16. Kt qu c trỡnh t gen GSTM1 s dng h thng sequencer t ng ABI 44 Hỡnh 3.17. Kt qu so sỏnh trỡnh t t c v trỡnh t GeneBank 44 ca gen GSTM1 44 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là loại ung thư thường gặp ở các nước Phương Tây, đứng thứ 3 về tỷ lệ mắc, đứng thứ 2 về tỷ lệ tử vong chỉ sau ung thư phổi [7]. Tần suất cao này duy trì suốt 40 năm nay mặc dù tû lÖ tö vong những năm gần đây có giảm, đặc biệt là ở phụ nữ. Do sự thay đổi về thói quen sinh họat và lối sống, b ệnh có xu hướng tăng lên ở Châu Á nói chung và Việt Nam nói riêng [68 ]. Tại Việt Nam, hiện UTĐTT xếp hàng thứ tư sau các ung thư phổi, dạ dày, gan (nam); vú, dạ dày, cổ tử cung (nữ). Theo ghi nhận của Bệnh viện K Hà Nội năm 1991 tỷ lệ là 4,3/100.000 dân, năm 1999 tỷ lệ đã là 13,3/100.000 dân [3, 7], đến năm 2000, tần suất mắc bệnh là 7,3/100.000 dân, đến nay tỷ lệ mắc là 7,5/100.000 dân, như vậy tỷ lệ mắc vẫn cao. Hi ện nay, các biện pháp phát hiện sớm ung thư đại trực tràng bao gồm: xét nghiệm tìm máu ẩn trong phân; nội soi đại trực tràng (với những người > 50 tuổi, đặc biệt từng bị hoặc có người thân bị u tuyến, các hội chứng đa polyp, ung thư đại trực tràng, các bệnh viêm ruột…). Ngoài ra, có thể sử dụng một số dấu ấn khối u như CEA (Carcino Embronic Antigen); CA 19-9 (Carbohydrat Antigen 19-9)… nhưng độ đặc hiệu của các xét nghiệ m này không cao. So với các ung thư khác ở đường tiêu hoá (ví dụ: dạ dày, thực quản, gan, tuỵ ), UTĐTT có tiên lượng tốt hơn cả, trên 50% bệnh nhân sống trên 5 năm nên UTĐTT được coi là chữa khỏi bệnh nếu được phát hiện sớm và điều trị kịp thời. UTĐTT gắn liền với nhiều yếu tố nguy cơ: sự thay đổi trong thói quen ăn uống (ăn nhiều mỡ động vật, thị t hun khói, ít hoa quả tươi và chất xơ ), các yếu tố di truyền, người có viêm loét đại tràng mạn tính, tiền sử gia đình có người bị bất cứ bệnh ung thư nào, người ít vận động, nghiện rượu… đều là những ng−êi cã nguy cơ cao, nhất là với nh÷ng người trên 50 tuổi. [...]... tôi tiến hành nghiờn cu 3 Kho sỏt t l gen CYP1A1* 2B và GSTM1 ở bệnh nhân ung đại trực tràng, nhằm hai mục tiêu sau: 1 Xác định tỷ lệ gen CYP1A1* 2B và GSTM1 ở nhúm bệnh nhân ung th đại trực tràng và nhóm chứng 2 Tỡm hiu mối liên quan giữa gen CYP1A1* 2B và GSTM1 với bệnh ung th đại trực tràng 4 CHNG 1 TNG QUAN 1.TèNH HèNH MC BNH UNG TH I TRC TRNG 1.1 Trờn th gii T chc Y t Th gii c tớnh trờn th gii... bằng sequencing - Xác định gen GSTM1 bằng kỹ thuật PCR, kiểm tra bằng sequencing 22 Mô hình nghiên cứu Nhóm bệnh nhân Nhóm đối chứng Dựa vào kết quả GPB Không mắc bất cứ UT nào Lấy máu tĩnh mạch Chiết tách DNA Kỹ thuật PCR, Sequencing Nhóm bệnh Nhóm chứng xác định gen CYP1A1* 2B và GSTM1 xác định gen CYP1A1* 2B và GSTM1 Tìm hiểu mối liên quan 2.3 CC K THUT XC NH GEN CYP1A1* 2B V GSTM1 2.3.1 Kỹ thuật PCR... cứu - Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân UTĐTT (case): Bệnh nhân UTĐTT đợc chẩn đoán bằng giải phẫu bệnh tại khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện K Hà nội - Tiêu chuẩn chọn đối chứng (control): Các bệnh nhân không mắc bất cứ loại UT nào, phù hợp với nhóm bệnh về giới và chênh lệch tuổi so với bệnh nhân là +/- 5 năm 2.1.2 Đối tợng nghiên cứu đợc thu thập tại 03 Bệnh viện: Bệnh viện Bạch Mai, Bệnh viện K Hà Nội, Bnh... tiền ung th đại tràng Những nghiên cứu gần đây cho thấy nhóm ngời bị viêm loét đại tràng chảy máu trên 10 năm tỉ lệ bị ung th hoá gấp mời lần nhóm ngời bình thờng Nếu viêm đại tràng chảy máu ở lứa tuổi trẻ dới 25 tuổi lại càng đễ ung th hoá hơn nữa Ngời ta cũng nhận thấy lứa tuổi của ung th đại tràng trên ngời có viêm đại tràng chảy máu thờng trẻ, khoảng 40 tuổi, nghĩa là sớm hơn tuổi của các nhóm ung. .. kiu gen dới các dạng: (+/+) và (+/-) là có mặt gen GSTM1 còn (-/-) là không có mặt gen [30, 35, 51] 15 4.3.Vai trũ ca gen CYP1A1 v gen GSTM1 trong ung th v UTTT Chất gây uT CYP1A1 Hoạt hóa Tổn thơng DNA GSTM1 Bất hoạt Đột biến gen Đào thải Hình 1.5 Sơ đồ chuyển hóa chất gây ung th trong cơ thể [30] Gen CYP1A1 có vai trò quan trọng trong giai đoạn I của quá trình hấp thu và chuyển hóa các chất gây UT... Viễm đại trực tràng mạn tính, khói thuốc, thức Đại -trực tràng ăn ít xơ, dinh dỡng thiếu vitamin D 18 Nhiu nghiên cứu cho thấy, khi có thêm các yếu tố nguy cơ khác nh hút thuốc, chế độ ăn nhiều thịt thì nguy cơ bị UT càng cao hơn Tuy nhiên cũng có những nghiên cứu không tìm thấy mối liên quan giữa gen CYP1A1 và GSTM1 với một số UT khác [51, 54] Nh vậy, tính đa hình thái của gen CYP1A1 và gen GSTM1. .. benzo[a]anthracene và chrysene Những chất hóa học gây UT này có trong khói thuốc lá, tác nhân gây UT ngoại sinh Do đó khi CYP1A1 thay đổi thì có thể làm tăng hoặc giảm nguy cơ bị UT Gen GSTM1 tham gia vào giai đoạn II của quá trình chuyển hoá các chất gây UT hoá học và các dạng khác của quá trình khử độc và đào thải các chất Nh vậy, hai gen CYP1A1 và GSTM1 có liên quan với giai đoạn I và II khử độc bởi các enzym... polymorphism: SNP) của gen này ở các dân tộc khác nhau 12 Bảng 1.1 Các dạng SNP của gen CYP1A1 [22, 32, 69] Dạng SNP CYP1A1* 1 Vị trí thay đổi Acid amin tơng ứng Wild type CYP1A1* 2A 3801 T C CYP1A1* 2B 2455 A G Vùng không mã hóa 462 Ile Val CYP1A1* 3 ?T CYP1A1* 4 2453 C A 461 Thr Asn CYP1A1* 5 2461 C A 464 Arg Ser CYP1A1* 6 1636 G T 331 Met Ile CYP1A1* 7 Vùng không mã hóa C 2346-2347 ins T Tạo mã kết thúc CYP1A1* 8 2414... cá thể 4 GEN CYP1A1 V GSTM1 TRONG UNG TH V UTTT 4.1 Tớnh a hỡnh thỏi ca gen CYP1A1 CYP1A1 là gen mã hoá cho một enzym thuộc gia đình Cytochrom P450, nằm trên đoạn nhiễm sắc thể 15q24.2-4 CYP1A1 còn đợc gọi dới một tên khác là Aryl hydrocarbon hydroxylase (AHH) [20] Tính đa hình thái của gen CYP1A1 đợc đánh giá thông qua tần suất các kiu gen của nó Đến nay, ngoài dạng nguyên thuỷ của CYP1A1 (CYP1A1* 1),... chất gây UT này (đã đợc hoạt hóa) có thể gắn vào và làm tổn thơng DNA, gây đột biến gen, sinh ra các tế bào UT Những ngời có gen CYP1A1 mà không có gen GSTM1, đợc giả thiết, có nguy cơ bị UT cao Những ngời có gen CYP1A1 và đồng thời có gen GSTM1 thì sự hấp thu và đào thải có thể cân bằng, nguy cơ UT, đợc giả thiết, nhẹ hơn Trong các nghiên cứu thực 16 nghiệm, CYP1A1 có khả năng hoạt hóa các chất gây UT . Kho sỏt t l gen CYP1A1* 2B và GSTM1 ở bệnh nhân ung đại trực tràng, nhằm hai mục tiêu sau: 1. Xác định tỷ lệ gen CYP1A1* 2B và GSTM1 ở nhúm bệnh nhân ung th đại trực tràng và nhóm chứng BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI PHẠM THỊ THANH THUỶ KHẢO SÁT TỶ LỆ GEN CYP1A1* 2B VÀ GSTM1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG Chuyên. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI PHẠM THỊ THANH THUỶ KHẢO SÁT TỶ LỆ GEN CYP1A1* 2B VÀ GSTM1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG