6. Kỹ thuật Sequencing
3.2. KẾT QUẢ CHIẾT TÁCH DNA
Để phõn tớch kiểu gen CYP1A1 và GSTM1, chỳng tụi tiến hành tỏch chiết DNA từ bạch cầu mỏu ngoại vi theo quy trỡnh đó được trỡnh bày trong phương phỏp kỹ thuật. DNA sau khi được chiết tỏch được kiểm tra chất lượng và số lượng bằng đo độ hấp phụ ở bước súng 260/280 nm và điện di trờn gel agarose 0,8%.
Bảng 3.3. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA sau chiết tỏch Mẫu số OD 260/280 Nồng độ(àg/ml) 1 1,82 28,1 2 1,70 26,7 3 1,72 22.4 4 1,80 27,3 5 1,75 24,5 Nhận xột:
Cỏc mẫu DNA thu được đều cú giỏ trị OD 260/280 = 1,7 – 1.9 và nồng độ DNA (20-30ng/àl) đảm bảo để tiến hành phản ứng PCR.
Mẫu số: 1 2 3 4 5 6 7 8
Hỡnh 3.2. Điện di DNA sau chiết tỏch trong gel agarose 0,8%, hiệu điện thế 100V, trong 15 phỳt.
Nhận xột:
3.3. KẾT QUẢ TÁCH DềNG GIẢI TRèNH TỰ GEN
Sản phẩm PCR của đoạn gen CYP1A1*2B và GSTM1 được lai vào vector tỏch dũng nhờ tỏc dụng của enzym T4-DNA ligase. Sau đú vector mang đoạn gen cần tỏch dũng được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli
DH5α bằng phương phỏp sốc nhiệt.
Dựa vào đặc tớnh của vector pDrive là vector dạng thẳng mang đuụi U ở đầu 5’, mang gen khỏng ampicilin và gen lacZα mó hoỏ cho tiểu phần α
của enzym β-galactosidase, vector pDrive được chọn làm vector tỏch dũng gen. Vector pDrive giỳp chọn lọc dũng vi khuẩn mong muốn nhờ việc lựa chọn khả năng sống trờn mụi trường cú khỏng ampicilin và khả năng chuyển màu cơ chất X-gal. Khi gen lacZα hoạt động, enzym β- galactosidase được tạo ra trong mụi trường sẽ chuyển hoỏ cơ chất X-gal, với chất cảm ứng IPTG thành màu xanh. Khi đoạn gen cần tỏch dũng được gắn vào vector sẽ làm hỏng gen lacZα, enzym β-galactosidase khụng được tạo ra, cơ chất X-gal khụng bị chuyển hoỏ. Kết quả là những dũng vi khuẩn nào cú màu trắng sẽ là những dũng mang gen ngoại lai. Chỳng sẽ được xử lý tiếp để kiểm tra sự cú mặt của đoạn gen cần tỏch dũng.
Kiểm tra hiệu quả tỏch dũng bằng phản ứng PCR
Chỳng tụi thực hiện phản ứng PCR cho từng cặp mồi CYP1A1*2B và GSTM1 sử dụng trực tiếp những tế bào E.coli trong khuẩn lạc trắng làm khuụn cho phản ứng PCR với cỏc thành phần khỏc và điều kiện phản ứng giống như mụ tả ở phần phương phỏp. Kết quả phản ứng PCR sau khi điện di trờn gel agarose được thể hiện ở hỡnh 3.11, giếng số 2 - 6 cú sản phẩm PCR khoảng 190 bp cựng kớch thước với mẫu chứng dương (giếng 1) nờn những plasmid này mang đoạn gen CYP1A1*2B.
1 2 3 4 5 6 M
Hỡnh 3.11: Sản phẩm khuếch đại đoạn gen CYP1A1*2B.
M: Marker; A. Mẫu 1: Chứng dương. Mẫu 2-6 PCR từ plasmid mang đoạn gen CYP1A1.
Ở hỡnh 3.12, giếng số 2 và 5 cú sản phẩm PCR khoảng 215 bp cựng kớch thước với mẫu chứng dương (giếng 1) nờn những plasmid này mang đoạn gen GSTM1. Cỏc giếng số 3, 4, 6, 7 khụng cú sản phẩm PCR cựng kớch thước với chứng dương nờn những plasmid này khụng mang đoạn gen GSTM1.
1 2 3 4 5 6 7 M
Hỡnh 3.12: Sản phẩm khuếch đại đoạn gen GSTM1.
M: Marker; mẫu 1: chứng dương. mẫu 3, 4, 6, 7: PCR từ plasmid khụng mang đoạn GSTM1 ; 2, 5: PCR từ plasmid mang đoạn GSTM1.
Như vậy, qua kết quả kiểm tra sự cú mặt của 2 đoạn gen CYP1A1*2B và GSTM1 trong vector tỏch dũng pDriver bằng phương phỏp PCR cho thấy, chỳng tụi đó tỏch dũng thành cụng 2 đoạn gen CYP1A1*2B và GSTM1.
Những plasmid cho kết quả PCR dương tớnh, chỉ gồm một băng đặc hiệu, cú kớch thước đỳng với vị trớ của mẫu PCR chứng dương sẽ tiếp tục được chuyển sang mụi trường LB lỏng cú bổ sung Ampicilin. Sau đú, tỏch chiết DNA plasmid rồi tiến hành đọc trỡnh tự
Hỡnh 3.13. Hỡnh ảnh điện di DNA plasmid
M: Marker
1: DNA plasmid tỏch chiết từ những khuẩn lạc mang đoạn gen CYP1A1. 2: DNA plasmid tỏch chiết từ những khuẩn lạc mang đoạn gen GSTM1
Hỡnh 3.14. Kết quả đọc trỡnh tự gen CYP1A1*2B sử dụng hệ thống sequencer tựđộng ABI Hỡnh 3.15. Kết quả so sỏnh trỡnh tựđạt được và trỡnh tự GeneBank của gen CYP1A1*2B Nhận xột:
Kết quả đọc trỡnh tự đó được so sỏnh với trỡnh tự GeneBank của gen CYP1A1 (NM 000499.2-). Kết quả cho thấy 100% là cú trỡnh tự tương
CYP1A1 1 TCGGTCTCAGCACCTAAGAGCGCAGCTGCATTTGGAAGTGCTCACAGCAGGCATGCTTCA 60 NM 000499.2 1 TCGGTCTCAGCACCTAAGAGCGCAGCTGCATTTGGAAGTGCTCACAGCAGGCATGCTTCA 60 CYP1A1 61 TGGTTAGCCCATAGATGGGGGTCATGTCCACCTTCACGCCCAGTGGCACGCTGAATTCCA 120 NM 000499.2 61 TGGTTAGCCCATAGATGGGGGTCATGTCCACCTTCACGCCCAGTGGCACGCTGAATTCCA 120 CYP1A1 121 CCCGTTGCCAGCAGGATAGCCAGGAAGAGAAAGACCTCCCAGCGGGCAATGGTCTCACCG 180 NM 000499.2 121 CCCGTTGCCAGCAGGATAGCCAGGAAGAGAAAGACCTCCCAGCGGGCAATGGTCTCACCG 180 CYP1A1 181 ATACACTTCA 190 NM 000499.2 181 ATACACTTCA 190
Hỡnh 3.16. Kết quả đọc trỡnh tự gen GSTM1 sử dụng hệ thống sequencer tựđộng ABI Hỡnh 3.17. Kết quả so sỏnh trỡnh tựđạt được và trỡnh tự GeneBank của gen GSTM1 Nhận xột:
Kết quả đọc trỡnh tự đó được so sỏnh với trỡnh tự GeneBank của gen GSTM1 (NM_000561.2). Kết quả cho thấy 100% là cú trỡnh tự tương đồng với GSTM1[ 71] GSTM1 1 CCTACTCAGAGTTTCTGGGGAGCGGCCATGGTTGCAAGGTAAAGGAGGAGTGATATGGGG 60 NM 000561.2 1 CCTACTCAGAGTTTCTGGGGAGCGGCCATGGTTGCAAGGTAAAGGAGGAGTGATATGGGG 60 GSTM1 61 AATTGAGATCTGTTTTGCTTCACGTGTTATGGAGGTTCCAGCCCACATATTCTTGGCCTC 120 NM 000561.2 61 AATTGAGATCTGTTTTGCTTCACGTGTTATGGAGGTTCCAGCCCACATATTCTTGGCCTC 120 GSTM1 121 TGCAGATCACTTTTGTAGATTTTCTCGTCTATGATGTCCTTGACCTCCACCGTATATTTG 180 NM 000561.2 121 TGCAGATCACTTTTGTAGATTTTCTCGTCTATGATGTCCTTGACCTCCACCGTATATTTG 180 GSTM1 181 AGCCCAACATTACCACCGTATATTTGACCCAACTACCGTCTATTTGAGCCCAACAAT 237 NM 000561.2 181 AGCCCAACATTACCACCGTATATTTGACCCAACTACCGTCTATTTGAGCCCAACAAT 237
Như vậy: kết quả đọc trỡnh tự sản phẩm PCR khuếch đại gen CYP1A1*2B và GSTM1 cho thấy sản phẩm PCR khuếch đại được là sản phẩm đặc hiệu.
3.4. KIỂU GEN CYP1A1*2B
Để xỏc định tớnh đa hỡnh thỏi của gen CYP1A1*2B ở exon 7, chỳng tụi tiến hành PCR phỏt hiện hai alen với hai cặp mồi: 1A1A để xỏc định alenA và 1A1G để xỏc định alen G. Sản phẩm của phản ứng PCR với hai cặp mồi trờn đều cú kớch thước 190bp. Và kiểu gen CYP1A1*2B được kết luận dựa trờn sự cú mặt hay khụng cú mặt của hai alen này.
(+) (-) 1 2 3 4 5 6 7 M 190 bp 190 bp (+) (-) 1 2 3 4 5 6 7 M Alen A Alen G
Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 Mẫu 6 Mẫu 7
Alen -A (+) (+) (-) (+) (+) (-) (+)
Alen -G (+) (+) (+) (+) (-) (+) (+)
Kiểu gen A/G A/G G/G A/G A/A G/G A/G
Hình 3.3. Điện di sản phẩm PCR khuếch đạigen CYP1A1*2B trong gel
Bảng 3.4: Phõn bố kiểu gen CYP1A1 ở nhúm chứng Kiểu gen n % A/A 5 5,9 A/G 74 87,1 G/G 6 7,0 Tổng 85 100,0 A/A A/G G/G Hỡnh 3.4. Phõn bố kiểu gen CYP1A1 ở nhúm chứng Nhận xột:
- Tỷ lệ kiểu gen A/G là cao nhất chiếm 87,1%, sau đó đến G/G chiếm 7,0%, rồi đến A/A chiếm 5,9%.
Bảng 3.5. Phõn bố kiểu gen CYP1A1 ở nhúm bệnh Kiểu gen n % A/A 5 6,2 A/G 71 87,7 G/G 5 6,1 Tổng 81 100,0 A/A A/G G/G
Hình 3.5.Phân bố kiểu gen CYP1A1*2B ở nhóm UTĐTT
Nhận xét:
- Tỷ lệ kiểu gen A/G là cao nhất chiếm 87,7%, sau đó đến A/A và G/G là tương đương đều chiếm 6,2% - 6,1%.
Bảng 3.6. Mối liên quan giữa kiểu gen CYP1A1*2B và UTĐ-TT Nhúm Kiểu gen Bệnh Chứng OR 95%CI A/A 5 5 0,87 A/G 71 74 1,0 0,25 – 2,97 G/G 5 6 0,83 0,15 – 4,63 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 A/A A/G G/G Chung UTDTT
Hình3.6. Phân bố kiểu gen CYP1A1*2B ở hai nhóm nghiên cứu
Nhận xét:
- Tỷ lệ kiểu gen ở hai nhóm là t−ơng đ−ơng nhau.
3.5. GEN GSTM1
Chỳng tụi tiến hành phản ứng PCR để phỏt hiện sự cú mặt hay vắng mặt của gen GSTM1 bằng hai cặp mồi đó mụ tả trong phần phương phỏp kỹ thuật. Sản phẩm của phản ứng PCR với cặp mồi nội chuẩn cú kớch thước là 268bp, với cặp mồi GSTM1 cú kớch thước là 215bp, khi cú mặt của băng 215bp được xỏc định là cú mặt gen GSTM1, hay GSTM1 (+), khi khụng xuất hiện băng này được xỏc định là vắng mặt gen GSTM1, hay GSTM1(-).
GSTM1(+): 5, 7 GSTM1(-):1, 2, 3, 4, 6
Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen GSTM1 trong gel
agarose 2,0%, hiệu điện thế 100V, trong 30 phút
(+) (-) 1 2 3 4 5 6 7 M
190 bp268 bp
Bảng 3.7. Phõn bố gen GSTM1 ở nhúm chứng Gen GSTM1 n % (+) 26 30,6 (-) 59 69,4 Tổng 85 100,0 + - Hình3.8. Phân bố tỷ lệ gen GSTM1 ở nhóm chứng Nhận xét: - Tỷ lệ cú gen GSTM1 ở nhóm chứng là 30,6%, vắng mặt gen GSTM1 là 69,4%.
Bảng 3.8 Phõn bố gen GSTM1 ở nhúm bệnh nhõn UTĐTT Gen GSTM1 n % (+) 20 24,7 (-) 61 75,3 Tổng 81 100,0 + - Hỡnh 3.9. Phõn bố gen GSTM1 ở nhúm bệnh nhõn UTĐTT Nhận xét: - Tỷ lệ cú mặt gen GSTM1 ở nhóm bệnh nhõn TUDDTT là 24,7%, vắng mặt gen GSTM1 là 75,3%
Bảng 3.9. Mối liên quan giữa gen GSTM1 và UTĐ-TT Nhúm Gen GSTM1 Bệnh Chứng OR 95%CI (+) 26 20 (-) 59 61 1,34 0,67 – 3,66 Tổng 85 81 0 10 20 30 40 50 60 70 80 (+) (-) Chung UTDTT
Hình 3.10. Phân bố gen GSTM1 ở hai nhóm nghiên cứu
Nhận xét:
- Tỷ lệ gen GSTM1 ở hai nhóm là t−ơng đ−ơng nhau.
- Tỷ suất chênh (OR) giữa nhóm chứng và nhóm UTĐ-TT của gen GSTM1 không cú sự khác biệt OR= 1,34; 95%CI =0,67-3,66 (p>0,05).
3.6. Mối liên quan giữa gen CYP1A1*2B, GSTM1 vμ UTĐTT
Bảng 3.10. Mối liên quan giữa gen CYP1A1, GSTM1 và UTĐ-TT
Nhúm Kiểu gen CYP1A1 Gen GSTM1 Bệnh Chứng OR 95%CI (+) 3 2 A/A (-) 2 3 2,25 0,17 – 28,25 (+) 14 22 A/G (-) 57 52 0,58 0,26 – 1,25 (+) 3 2 G/G (-) 2 4 3,0 0,25 – 35,33 Nhận xét:
Tỷ suất chênh (OR) đánh giá mối liên quan giữa hai gen CYP1A1*2B và GSTM1 với UTĐ-TT là không có ý nghĩa thống kê với 95%CI đều chứa giỏ trị 1.
CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN
UTĐTT tiến triển âm thầm, các triệu chứng lâm sàng th−ờng là những dấu hiệu muộn và không đặc hiệu. Do đó việc phát hiện UT th−ờng ở giai đoạn muộn. Ngoại trừ một số n−ớc phát triển đã triển khai đ−ợc các ch−ơng trình sàng lọc chẩn đoán sớm nh− Nhật Bản, Mỹ, Tây Âu…., còn lại hầu hết ng−ời bệnh th−ờng đến điều trị ở giai đoạn muộn [26]. Phẫu thuật chỉ có thể giải quyết tạm thời, trong khi UT này lại kháng với các biện pháp xạ trị và hoá trị liệu nên tiên l−ợng của bệnh là khá xấu. Vì vậy, UTĐTT vẫn còn là một thách thức đối với các nhà lâm sàng và càng là một vấn đề sức khoẻ cộng đồng cần đặc biệt quan tâm [62].
Cho đến nay, nhiều nghiên cứu đã khẳng định rằng UTĐTT là bệnh có nhiều yếu tố chi phối: sự thay đổi trong thúi quen ăn uống (việc ăn nhiều chất bộo) cú liờn quan đến căn bệnh này. Cỏc yếu tố di truyền cũng rất quan trọng, người cú bệnh viờm đường tiờu húa, viờm loột đại tràng hay cú tiền sử bị ung thư hoặc gia đỡnh cú người bị bất cứ bệnh ung thư nào và người ớt vận động đều là người cú nguy cơ cao, nhất là đối với người trờn 50 tuổi. [33, 48].
Mối liên quan giữa nguy cơ UT với một số gen đã đ−ợc nhiều tỏc giả
nghiên cứu. Các gen này phối hợp với nhau và kết hợp với cỏc yếu tố nguy cơ khỏc có vai trò quan trọng làm tăng hoặc giảm nguy cơ mắc bệnh UT cũng đã đ−ợc xác định.
Trong những năm gầnđây đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu về một số gen liên quan đến UT nói chung và UTĐTT nói riêng. Việc phát hiện ng−ời mang các gen có nhạy cảm với các chất gây UT nội sinh và ngoại sinh có ý nghĩa đặc biệt quan trọng để áp dụng các biện pháp hạn chế không cho các tế bào UT hình thành và phát triển thành bệnh. Nghiên cứu các gen nhạy
cảm đã mở h−ớng mới cho dự phòng UT, đặc biệt cho những ng−ời có mang các gen có liên quan tới tăng nguy cơ bị mắc UT. Việc phát hiện các gen này cho phép sàng lọc tìm ra những ng−ời có “nguy cơ cao”, từ đó có h−ớng ngăn chặn bệnh bằng cách kiểm soát các yếu tố gây UT nội và ngoại sinh cho các đối t−ợng này trong cộng đồng [16, 17].
CYP1A1 và GSTM1 là hai gen mã hoá cho enzym tham gia vào chuyển hoá xenobiotic và các chất gây UT trong cơ thể, qua đó chúng có thể tác động đến sự “nhạy cảm” với UT của từng cá thể. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã đánh giá mối liên quan của 2 gen này với một số UT trong đó có UTĐTT, kết quả thu đ−ợc giữa các nghiên cứu có sự khác nhau. Tại Việt Nam, Lê Ngọc Anh và cộng sự 2007 lần đầu tiên xác định mối liên quan của gen CYP1A1 với UT dạ dày nh−ng ch−a có công trình nào khảo sát mối liên quan của hai gen trên với UTDTT.
4.1 THễNG TIN CHUNG VỀ ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
Chỳng tụi tiến hành khảo sỏt tỷ lệ gen CYP1A1 và GSTM1 ở bệnh nhõn UTĐTT và nhúm đối chứng nhằm phỏt hiện tỷ lệ gen của hai gen này trong bệnh UTĐTT và đỏnh giỏ mối liờn quan giữa chỳng với bệnh nhõn UTĐTT trờn người Việt Nam.
Chỳng tụi nghiờn cứu trờn hai nhúm:
Nhúm bệnh: gồm 81 bệnh nhõn UTĐTT mới được chẩn đoỏn lần đầu và được chẩn đoỏn xỏc định bằng mụ bệnh học.
Nhúm chứng: gồm 85 bệnh nhõn được điều trị tại cỏc bệnh viện khụng mắc bất cứ UT nào, khụng phải duy trỡ chế độăn kiờng.
Kết quả bảng 3.1 cho thấy tuổi trung bỡnh của nhúm chứng là: 55,6 – 11,3, nhúm bệnh là: 54,7 – 11,9. Tỷ lệ phõn bố đối tượng theo cỏc nhúm tuổi là như nhau (p>0,05). Độ tuổi phỏt hiện bệnh trong nghiờn cứu này chủ
yếu trờn 40 tuổi, phự hợp với cỏc nghiờn cứu khỏc về độ tuổi mắc bệnh UTĐTT từ 41 – 70 [7, 13].
Về giới: tỷ lệ nam và nữ của cả hai nhúm bệnh và chứng là khụng cú sự khỏc biệt (P>0,05).
Cỏc kỹ thuật trong nghiờn cứu này là những kỹ thuật hiện đại, cú độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Để phõn tớch được kiểu gen của hai gen này, chỳng tụi tiến hành chiết tỏch DNA từ bạch cầu mỏu ngoại vi theo qui trỡnh của hóng QIAGEN. Kết quả bảng 3.3 và Hỡnh 3.2 cho thấy DNA thu được cú chất lượng và số lượng đảm bảo thực hiện phẩn ứng PCR phỏt hiện kiểu gen của hai gen trờn. Phản ứng PCR được tiến hành theo qui trỡnh của hóng QIAGEN.
Sau đú dựng kỹ thuật tỏch dũng hai đoạn gen, tạo vector tỏi tổ hợp, biến nạp vector tỏi tổ hợp vào tế bào E. coli khả biến bằng sốc nhiệt, tỏch DNA plasmid kiểm tra hiệu quả tỏch dũng bằng phản ứng PCR, sau đú phõn tớch trỡnh tự của đoạn DNA được tạo dũng trờn mỏy tự động cho phộp xỏc định trỡnh tự một cỏch nhanh chúng và chớnh xỏc.
4.2. Tỷ Lệ KIểU gen CYP1A1 *2b
Gen CYP1A1 mã hóa cho enzym thuộc giai đoạn I của quá trình chuyển hóa các chất gây UT, có tác dụng chuyển chất gây UT thành dạng hoạt hóa (để trở thành cơ chất cho giai đoạn II). Kiểu gen nguyên thủy (wild type) của CYP1A1 là A/A, khi xảy ra sự thay thế nucleotid AặG tại vị trí 2455 thuộc exon 7 (CYP1A1*2B) sẽ làm tăng hoạt tính của enzyme, nhất là kiểu gen G/G và đ−ợc giả thuyết là làm tăng nguy cơ UT [25].
ở nhóm chứng, kết quả Bảng 3.4 cho thấy kiểu gen A/G chiếm −u thế với tỷ lệ 87,1%, trong khi tỷ lệ A/A và G/G chỉ có 5,9% và 7,0%. So
sánh với các nghiên cứu khác ở Châu á, Tỷ lệ kiểu gen A/A (wild type) trong nghiên cứu này thấp hơn hẳn còn kiểu gen G/G thì không khác biệt.
Ở Việt nam, Lê Ngọc Anh và cs 2007 [2]khi nghiên cứu tính đa hình thái của gen CYP1A1 trên nhóm chứng cho thấy: kiểu gen A/G chiếm tỷ lệ