6. Kỹ thuật Sequencing
2.3. CÁC KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH GEN CYP1A1*2B VÀ GSTM1
2.3.1. Kỹ thuật PCR
Để thực hiện được quỏ trỡnh nhõn lờn này, mỗi chu kỳ của phản ứng PCR bao gồm 3 giai đoạn:
- Tỏch DNA thành sợi đơn: Được thực hiện ở nhiệt độ 90-980C trong vài giõy đến vài phỳt, khi đú cỏc phõn tử DNA xoắn kộp sẽ bị tỏch ra
Nhóm bệnh nhân Nhóm đối chứng
Dựa vào kết quả GPB Không mắc bất cứ UT nào
Lấy máu tĩnh mạch Chiết tách DNA Kỹ thuật PCR, Sequencing xác định gen CYP1A1*2B và GSTM1 Nhóm bệnh xác định gen CYP1A1*2B và GSTM1 Nhóm chứng
tạo nờn cỏc sợi đơn, làm khuụn cho cỏc đoạn mồi bỏm vào và enzym DNA- polymerase xỳc tỏc tổng hợp.
- Gắn mồi: Nhiệt độ được hạ xuống 57-680C để cỏc đoạn mồi bỏm vào cỏc vị trớ đặc hiệu với cỏc trỡnh tự bổ sung tương ứng trờn sợi DNA làm khuụn.
- Tổng hợp: Nhiệt độđược nõng lờn 68-720C trong vài chục giõy đến vài phỳt, để cỏc sợi DNA được tổng hợp kộo dài trờn cơ sở từ vị trớ mồi bỏm vào.
Sau chu kỳ cuối cựng, cú một chu kỳ bổ sung được duy trỡ ở nhiệt độ 720C trong 5-10 phỳt để cho tất cả cỏc sợi đơn DNA mới xoắn lại, tạo nờn sản phẩm PCR là hỗn hợp cỏc chuỗi xoắn kộp DNA. Kết thỳc phản ứng, nhiệt độ hạ xuống 40C để bảo quản sản phẩm. 2.3.1.1. Dụng cụ và hoá chất * Dụng cụ: - Mỏy PCR. - Bộ điện di DNA.
- Mỏy soi gel và chụp ảnh. - Mỏy ly tõm.
- Pipet tự động cỏc loại, ống eppendorf * Húa chất
- Húa chất chiết tỏch DNA (theo quy trỡnh của hóng QIAGEN). - Mồi của GAPDH, CYP1A1 và GSTM1.
2.3.1.2. Lấy máu và chiết tách DNA từ máu ngoại vi: theo qui trình QIAamp mini Kit
* Lấy mỏu: Lấy 2ml máu tĩnh mạch: Lấy máu buổi sáng, chống đông bằng EDTA.
* Tỏch DNA : Tách DNA từ bạch cầu máu ngoại vi bằng kít của QIAGEN. - Hút 20μl protease cho vào đáy eppendorf 1,5ml.
- Thêm 200μl máu toàn phần vào eppendorf nếu thể tích mẫu < 200 thì bổ sung cho đủ bằng PBS.
- Thêm 200μl dung dịch đệm AL, trộn đều bằng vortex trong 15 giây.
- ủ ở 560C trong 10 phút. Sau đó, ly tâm nhẹ eppendorf để các giọt mẫu dính trên thành ống xuống đáy.
-Thêm 200μl ethanol vào mẫu. Trộn đều (bằng vortex trong 15 giây) và ly tâm nhẹ.
- Hút nhẹ hỗn hợp mẫu ở b−ớc trên cho vào cột QIAamp (để trên ống thu dịch 2ml), không đ−ợc làm dính mẫu lên miệng và thành cột QIAamp. - Đậy nắp, ly tâm 8000v/phút x 1 phút.
- Chuyển cột QIAamp sang ống thu dịch mới, loại bỏ ống chứa dịch ly tâm vừa thu đ−ợc.
- Mở nắp cột QIAamp cẩn thận và thêm 500μl dung dịch đệm AW1 mà không làm dính lên thành miệng cột.
- Đậy nắp cột, ly tâm 8.000v/phút x 1 phút.
- Chuyển cột QIAamp sang ống thu dịch mới, loại bỏ ống chứa dịch ly tâm vừa thu đ−ợc.
- Mở nắp cột QIAamp cẩn thận và thêm 500μl dung dịch đệm AW2 mà không làm dính lên thành miệng cột. Đậy nắp cột, ly tâm 14.000v/phút x 3p. - Loại bỏ ống chứa dịch ly tâm vừa thu đ−ợc, chuyển cột QIAamp sang Eppendorf mới.
- Mở nắp cột QIAamp cẩn thận, thêm 200μl dung dịch đệm AE (hoặc n−ớc khử trùng). ủ ở nhiệt độ phòng (15-250C) trong 1 phút.
- Ly tâm 8.000v/phút x 1 phút. ADN thu đ−ợc chứa trong eppendorf.
Với 200μl máu toàn phần có thể thu đ−ợc ~ 6μg DNA trong 200μl (30ng/μl) với OD260/280=1,7-1,9.
* Kiểm tra DNA sau chiết tách
- Đo độ hấp phụ ở 2 b−ớc sóng 260nm và 280nm để xác định độ tinh sạch và xác định nồng độ DNA
- Điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA trên gel agarose 0,8% để đánh giá sự “nguyên vẹn” của DNA sau chiết tách.
2.3.1.3. Kỹ thuật PCR xác định kiểu gen CYP1A1*2B
Hai cặp mồi (primer) đặc hiệu phát hiện tính đa hình thái của gen CYP1A1*2B trong exon 7 (hãng Invitrogen) [35].
- Trình tự cặp mồi thứ nhất xác định alen -A:
+ Mồi xuôi (1A1A): 5’-GAAGTGTATCGGTGAGACCA-3’
+ Mồi ng−ợc (c53): 5’-GTAGACAGAGTCTAGGCCTCA-3’.
- Trình tự cặp mồi thứ hai xác định alen -G:
+ Mồi xuôi (1A1G): 5’-GAAGTGTATCGGTGAGACCG-3’
+ Mồi ng−ợc (c53): 5’-GTAGACAGAGTCTAGGCCTCA-3’.
Cả hai cặp mồi đ−ợc thiết kế để nhân đoạn gen có kích th−ớc 190bp theo chiều xuôi ở vị trí có sự thay đổi nucleotid (quyết định tính đa hình thái) của gen CYP1A1. Phản ứng đ−ợc thực hiện ở hai ống với tổng thể tích mỗi ống là 10,1 μl.
Thể tích (μl) Thành phần ống số 1 (Xác định alen A) ống số 2 (Xác định alen G) Water 3,75 3,75 Buffer 10X 1,0 1,0 10mM/l dNTP 0,25 0,25 Q-Solution 2,0 2,0 Primer 1A1A 0,5 - Primer 1A1G - 0,5 Primer c53 0,5 0,5 Taq DNA polymerase 0,1 0,1
DNA mẫu (0,4 μg) 2,0 2,0
Tổng 10,1 10,1
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:
Chu trỡnh Biến tớnh Bắt cặp Tổng hợp 1 94oC -8 phỳt
2 - 34 94 oC - 50 giõy 60 oC - 50 giõy 72 oC - 50 giõy
35 72 oC - 6 phỳt
Bảo quản ở 4 oC/∞
Đọc kết quả:
Sản phẩm PCR sau đó đ−ợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,8%. Nếu băng sản phẩm PCR có kích th−ớc 190bp chỉ thấy xuất hiện ở
ống thứ nhất thì kiểu gen đ−ợc xác định là A/A. Nếu sản phẩm PCR có kích th−ớc nh− vậy chỉ xuất hiện ở ống thứ hai thì kiểu gen đ−ợc xác định là G/G. Nếu cả hai ống cùng xuất hiện thì kiểu gen là A/G.
Kiểu gen ống số 1(Alen A) ống số 2(Alen G)
A/A + -
A/G + +
G/G - +
2.3.1.4. Kỹ thuật PCR xác định kiểu gen GSTM1
Cặp mồi (primer) đặc hiệu đ−ợc thiết kế để sử dụng trong kỹ thuật PCR với mục đích phát hiện kiểu gen GSTM1. Một cặp mồi khác phát hiện sự có mặt của β-protein(gen nội chuẩn). Đây là hai cặp mồi đ−ợc sản xuất bởi hãng Invitrogen và đã đ−ợc sử dụng trong một số nghiên cứu tr−ớc đây [35].
- Trình tự cặp mồi thứ nhất β-protein (gen nội chuẩn):
+ Mồi xuôi: 5’-CAACTTCATCCACGTTCACC-3’
+ Mồi ng−ợc: 5’-GAAGAGAACAGGACAG-3’.
- Trình tự cặp mồi thứ hai xác định sự biểu hiện của gen GSTM1:
+ Mồi xuôi (G5): 5’-GAACTCCCTGAAAAGTCAAAGC-3’
+ Mồi ng−ợc (G6): 5’-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3’.
Hai cặp mồi đ−ợc thiết kế để nhân hai đoạn gen có kích th−ớc lần l−ợt là 268bp và 215bp. Phản ứng đ−ợc thực hiện ở cùng 1 ống:
Thành phần Thể tích (μl) H2O 2,75 Buffer 10X 1,0 10mM/l Dntp 0,25 Q-Solution 2,0 Primer 1 - F 0,5 Primer 1 – R 0,5 Primer 2 – F 0,5 Primer 2 – R 0,5 Taq DNA polymerase 0,1
DNA mẫu (0,4 μg) 2,0
Tổng 10,1
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:
Chu trỡnh Biến tớnh Bắt cặp Tổng hợp 1 94oC -8 phỳt
2 - 34 94 oC - 50 giõy 60 oC - 50 giõy 72 oC - 50 giõy
35 72 oC - 6 phỳt
Bảo quản ở 4 oC/∞
Đọc kết quả:
Sản phẩm PCR sau đó đ−ợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2,0%. Do trong phản ứng có 2 cặp mồi nên kết quả thu đ−ợc có thể có 2
băng sản phẩm PCR có kích th−ớc là 268bp và 215bp: Khi chỉ xuất hiện một băng 268 bp thì xác định kết quả của mẫu là GSTM1(-), khi xuất hiện cả hai băng 268bp và 215bp thì đọc kết quả là GSTM1(+).
2.3.2.Kỹ thuật tỏch dũng 2 đoạn gen CYP1A1*2B và GSTM1
* Tinh sạch DNA từ gel agarose sử dụng Kit QIAquick Gel Extraction
- Sau khi xỏc định đoạn DNA cần tỏch trờn bản gel điện di, cắt mảnh gel chứa đoạn này cho vào ống 1,5 ml và cõn xỏc định trọng lượng.
- Cho vào ống đệm QG theo tỷ lệ 3:1 (thể tớch đệm trờn trọng lượng gel chứa mẫu) và ủ ở 50°C trong 10 phỳt cho mảnh gel đ−ợc hũa tan hoàn toàn.
- Thờm 1 thể tớch isopropanol vào nếu đoạn DNA cú độ dài trờn 4 kb. - Để thu DNA, toàn bộ hỗn hợp trờn được cho vào cột QIA, cột này đó được đặt trong ống thu nhận và ly tõm 12000 vũng/ phỳt, 1 phỳt, 4°C. Loại bỏ phần dịch chảy xuống ống thu nhận
- Tiếp tục thờm 0,5 ml đệm QG vào cột QIA và ly tõm 12000 vũng/ phỳt, 1 phỳt, 4°C để loại bỏ hoàn toàn cỏc cặn của gel điện di.
- Rửa cột QIA bằng 0,75 mL đệm PE, ly tõm 12000 vũng/ phỳt, 1 phỳt, 4°C. Loại bỏ phần dịch và tiếp tục ly tõm 12000 vũng/ phỳt, 1 phỳt, 4°C.
- Cỏc cột QIA được đặt vào cỏc ống thu mẫu 1,5 ml. Để thu mẫu DNA, 25 μl nước cất vụ trựng được cho vào phần tõm cột và để yờn 1 phỳt. Sau đú, ly tõm 12000 vũng/ phỳt, 1 phỳt, 4oC, để thụi DNA ra khỏi cột. Loại bỏ cột và cất giữ mẫu ở -20oC.
- Sản phẩm thụi gel sau khi tinh sạch được điện di kiểm tra lại trờn gel agarose 0,8% trước khi tiến hành phản ứng lai.
*Tỏch dũng gen
Bản đồ vector tỏch dũng - pDrive cloning vector
* Tạo vector tỏi tổ hợp:
Sản phẩm PCR của đoạn gen CYP1A1 và GSTM1 được trộn lẫn với DNA pDrive cloning vector, dưới tỏc dụng của enzym T4-ADN ligase, ở điều kiện 16oC, trong 16 giờđể tạo vector tỏi tổ hợp.
Thành phần phản ứng gắn đoạn gen CYP1A1 và GSTM1 vào vector pDrive:
Thành phần Thể tớch (μl)
Nước cất 2ì 2,0
Ligation Master Mix 2x 5,0 DNA pDrive cloning vector (50 ng/μl) 1,0
Sản phẩm PCR 2,0
Tổng 10,0
* Biến nạp vector tỏi tổ hợp vào tế bào E. coli khả biến bằng sốc nhiệt:
- Tế bào khả biến lấy ra từ tủ -70oC được đặt ngay trờn đỏ khoảng 10 phỳt để làm tan dần.
- Sau đú, 2 μl sản phẩm lai được cho vào 10 μl tế bào khả biến, đảo nhẹđể trộn đều. Để hỗn hợp mẫu trong đỏ 10 phỳt.
- Để biến nạp DNA vào tế bào, mẫu được làm núng ở 42oC trong 45 giõy. Mẫu được lấy ra và đặt vào đỏ lạnh trong 2 phỳt.
- Bổ sung 200 μl mụi trường SOC và lắc mẫu 200 vũng/ phỳt, ở 37oC, trong 1 giờ.
- Hỳt 200 μl mẫu trải trờn một đĩa mụi trường LB cú bổ sung ampicilin, X-gal, IPTG, ủ đĩa ở 37oC qua đờm.
* Tỏch chiết DNA plasmid sử dụng KIT QIAgenTMminiprep
- Chọn khuẩn lạc trắng để cấy chuyển sang 3 ml mụi trường LB lỏng cú bổ sung 100 μg/ ml ampicilin nuụi qua đờm ở 37oC, lắc 200 vũng/ phỳt.
- Hỳt 2 ml dịch nuụi cấy vào ống 2 ml. Thu cặn tế bào bằng ly tõm 5000 vũng/ phỳt, 10 phỳt, 4oC.
- Hoà tan tế bào bằng 250 μl dung dịch P1 bằng cỏch khuấy mạnh trờn mỏy voltex.
- Bổ sung thờm 250 μl dung dịch P2 vào mẫu và đảo nhẹ ống để trộn đều mẫu. Dung dịch trở nờn trong suốt và quỏnh.
- Tiếp tục cho vào 350 μl dung dịch N3, đảo nhẹ. Tủa protein xuất hiện và cú màu trắng đục.
- Ly tõm 12000 vũng/ phỳt trong 15 phỳt ở 4oC. Hỳt dịch trong chuyển sang cột QIAprep.
- Ly tõm 12000 vũng/ phỳt, 1 phỳt, 4oC nhằm loại bỏ cỏc thành phần là cỏc enzyme nuclease hay cỏc cacbonhydrat cao phõn tử.
- Rửa cột QIAprep bằng 500 μl đệm PB, ly tõm 12000 vũng/ phỳt, 1 phỳt, 4oC và loại bỏ phần dịch chảy xuống ống thu nhận.
- Tiếp tục rửa cỏc cột QIAprep bằng 750 μl đệm PE, ly tõm 12000 vũng/ phỳt, 1 phỳt, 4oC và loại bỏ phần dịch chảy xuống ống thu nhận.
- Cỏc ống này được ly tõm thờm trong 1 phỳt, 13000 vũng/ phỳt, 4oC để loại bỏ hoàn toàn đệm rửa ra khỏi cột QIAprep.
- Đặt cột QIAprep sang ống thu mẫu 1,5 ml, lấy 50 μl đệm EB và đưa vào tõm cột, để yờn 1 phỳt. Sau đú, ly tõm 13000 vũng/ phỳt, 1 phỳt, 4oC, để thụi DNA plasmid ra khỏi cột. Loại bỏ cột và cất giữ mẫu ở -20oC.
* Kiểm tra hiệu quả tỏch dũng bằng phản ứng PCR
Để kiểm tra sự cú mặt của cỏc đoạn gen cần tỏch dũng trong cỏc plasmid tỏi tổ hợp chỳng tụi tiến hành phản ứng PCR với từng cặp mồi
CYP1A1 và GSTM1 Thành phần và chu trỡnh nhiệt độ phản ứng PCR như sau: Thành phần phản ứng PCR: Thành phần Thể tớch (μl) Nước cất 2ì 6.9 10ì buffer 1.0 dNTP (2,5 mM) 1.0 Mồi xuụi - F (10 pM) 0.5 Mồi ngược - R (10 pM) 0.5 Taq polymerase (5 u/μl) 0.1 Khuẩn lạc E.coli trắng Tổng 10.0 Chu trỡnh nhiệt của phản ứng PCR: Chu trỡnh Biến tớnh Bắt cặp Tổng hợp 1 95oC - 10 phỳt 2 - 34 95 oC - 50 giõy 55 oC - 50 giõy 72 oC - 2 phỳt 35 72 oC - 10 phỳt Bảo quản ở 10 oC
Sản phẩm PCR cũng được điện di kiểm tra trờn gel agarose cựng với mẫu PCR đối chứng dương và thang marker chuẩn. Từ đú, chỳng tụi xỏc định được những plasmid mang đoạn gen cần tỏch dũng.
Những plasmid cho kết quả PCR dương tớnh, chỉ gồm một băng đặc hiệu, cú kớch thước đỳng với vị trớ của mẫu PCR chứng dương sẽ tiếp tục được chuyển sang mụi trường LB lỏng cú bổ sung Ampicilin. Sau đú, tỏch chiết DNA plasmid rồi tiến hành đọc trỡnh tự.
2.3.3. Kỹ thuật Sequencing
Hiện nay cú 3 phương phỏp phõn tớch trỡnh tự của đoạn DNA được tạo dũng
* Phương phỏp húa học Maxam-Gilbert
Đầu tiờn phõn tử DNA sợi đụi được đỏnh dấu 32P tại đầu 5’. Sau đú, hai sợi đơn tỏch rời nhau do biến tớnh nhiệt. Chỳng được xử lý với cỏc chất húa học sao cho chỉ một loại nucleotide bị phỏ hủy. Nồng độ cỏc chất húa học được kiểm tra chặt chẽ sao cho chỉ một nucleotide bị phỏ hủy trờn mỗi sợi đơn DNA. Kết quả hàng loạt cỏc đoạn DNA cú kớch thước khỏc nhau được tạo thành.
Cỏc đoạn DNA tạo ra do bị bẻ góy được phõn ly trờn polyacrylamide gel và chỉ cú đoạn nào bị gắn 32P ở đầu 5’ mới quan sỏt được. Kớch thước của chỳng tương ứng với khoảng cỏch từ đầu 5’ cú đỏnh dấu đến vị trớ của cỏc nucleotide bị bẻ góy trờn phõn tử DNA. Sử dụng cỏc chất húa học khỏc nhau phỏ hủy bốn loại nucleotide bằng bốn phản ứng riờng biệt. Sản phẩm thu được của bốn phản ứng này được phõn ly trờn cựng một gel. Đoạn DNA ngắn nhất cú đỏnh dấu phúng xạ chạy nhanh nhất dưới tỏc dụng của điện trường. Căn cứ vào vị trớ cỏc vạch trờn gel mà xỏc định trỡnh tự cỏc nucleotide.
* Phương phỏp enzyme Sanger
Đõy là phương phỏp tạo đầu tận cựng của chuỗi (chain terminator method). Nguyờn lý của phản ứng này là sử dụng dideoxynucleotide khụng cú nhúm OH ở vị trớ 3’ trong phản ứng tổng hợp DNA. Do đú, khi DNA
polymerase gắn chỳng vào sợi DNA thỡ quỏ trỡnh tổng hợp bị ngừng lại. Vỡ vậy, phương phỏp này cũn gọi là phương phỏp dideoxy (dideoxy method). Đầu tiờn sợi đụi DNA (sợi khuụn cần đọc trỡnh tự) bị biến tớnh tỏch thành hai sợi đơn và được lai với primer. Primer là một sợi đơn gồm vài chục nucleotide cú thể liờn kết với một trong hai sợi đơn DNA theo nguyờn tắc tạo cặp bổ sung. Sau đú, bốn phản ứng riờng rẽ được tiến hành đồng thời. Mỗi phản ứng là hỗn hợp của DNA khuụn mẫu, primer, DNA polymerase, một loại dideoxynucleotide và bốn loại deoxynucleotide theo tỷ lệ 1:100. Cỏc sợi đơn DNA được tổng hợp cú độ dài khỏc nhau do dideoxynucleotide gắn ngẫu nhiờn làm dừng phản ứng. Sản phẩm của bốn phản ứng cựng được phõn ly trờn polyacrylamide gel cho phộp phõn biệt hai sợi đơn DNA hơn kộm nhau một nucleotide. Cỏc vạch DNA quan sỏt được nhờ cú gắn phúng xạ 32P vào mồi hoặc vào một trong bốn loại loại nucleotide bỡnh thường (Hỡnh 5.13).
* Xỏc định trỡnh tự nucleotide trờn mỏy tựđộng
Trong những năm gần đõy, một số phương phỏp xỏc định trỡnh tự mới đó xuất hiện. Bờn cạnh kỹ thuật thụng thường sử dụng cỏc gel để phõn ly cỏc phõn tử DNA cú độ dài khỏc nhau, cỏc kỹ thuật mới liờn quan đến phỏt