luận văn thạc sỹ hóa học Nguyễn Khắc Hồng

nghiên cứu thành phần hóa học của cây bán hạ ba thùy

-

NGUYỄN KHẮC HỒNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA CÂY BÁN HẠ BA THÙY

(TYPHONIUM TRILOBATUM, ARACEAE)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

THÁI NGUYÊN - 2008

-

NGUYỄN KHẮC HỒNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA CÂY BÁN HẠ BA THÙY

(TYPHONIUM TRILOBATUM, ARACEAE)

CHUYÊN NGÀNH : HOÁ HỌC HỮU CƠ

MÃ SỐ : 60.44.27

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN QUYẾT TIẾN

THÁI NGUYÊN - 2008

Bản luận văn này được hoàn thành tại phòng Hoạt chất Sinh học, Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc của mình tới TS Nguyễn Quyết Tiến, TS Phạm Thị Hồng Minh, PGS.TS Phạm Hoàng Ngọc, PGS.TS Phạm Văn Thỉnh, những người thầy đã chỉ ra hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ từng bước đi của tôi trong quá trình nghiên cứu thực hiện luận văn

Xin chân thành cảm ơn Phòng Hoạt chất Sinh học, Phòng Nghiên cứu Cấu trúc -Viện Hóa học đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành các kế hoạch nghiên cứu

Nhân dịp này, tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Khoa Hóa, Khoa Sau đại học –Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, Ban Giám hiệu Trường Cao đẳng Y Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Bố, Mẹ tôi, những người thân trong gia đình và các đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2008

Tác giả

Nguyễn Khắc Hồng

Trang Lời cam đoan

1.2 Các hợp chất và hoạt tính sinh học của chúng có trong họ

1.3 Phổ 13C – NMR trong nghiên cứu cấu trúc và thành phần của

lipit (axit béo và este của nó)

16

1.3.5 Các axit béo không no và este khác 25

1.3.8 Những nguyên tử C1 3 trong các gốc acyl và ankyl 28

2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp

2.1.2 Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết 34

3.2 Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết

khác nhau của cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) 44

Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận văn 61

EI-MS : Electron Impact Mass Spectroscopy

ESI-MS : Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy

FT-IR : Fourier Transform Infrared Spectroscopy

NMR : Nuclear Magnetic Resonance

1

H-NMR : 1H-Nuclear Magnetic Resonance

13

C-NMR : 13C- Nuclear Magnetic Resonance

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

COSY : Correlated Spectroscopy

HMQC : Heteronuclear Multiple - Quantum Coherence

HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation

Các lĩnh vực khác

MIC : Minimum inhibitory concentration

HIV : Human Immunodeficiency Virus

đvC : Đơn vị Cacbon

v/v : Thể tích/thể tích

Trang Hình 1.1 Phổ 13

C-NMR phân giải cao của dầu béo hoa rượu Rum (Safflower) 16 Hình 2.1 Cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) 32

Hình 2.2 Hoa, thân , rễ và củ cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) 33

H-1H-cosy của typhotrilozit A (RTtE3 ) 54

Bảng 1.1 Độ dịch chuyển hóa học ( , ppm) của các nguyên tử C1 -6 và

1-4 của axit palmitic, metyl và glycerol este của nó

18

Bảng 1.2 Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C trong

glyceroleste của các axit ancanoic C4, C6, và C8 (trong chuỗi và )

19

Bảng 1.3 Sự chênh lệch về độ dịch chuyển hóa học ( ppm) giữa 2 nguyên

tử C olefinic trong các chuỗi , - glycerol este, cis- 2- 11

20

Bảng 1.4 Sự chênh lệch về độ dịch chuyển hóa học ( ppm) giữa 2 nguyên

tử C olefinic trong các chuỗi , - glycerol este, cis- 2- 11

20

Bảng 1.5 Một vài độ dịch chuyển hóa học ( ppm) từ phổ 13

C-NMR của dầu hạt Càrốt

Bảng 1.7 Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C 1-3 của

một vài axit và este

24

chuyển hóa học ( ppm) và cường độ tín hiệu từ phổ C-NMR

của dầu thực vật Borage

Bảng 1.9 Một vài độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C

46

Bảng 3.2 Độ dịch chuyển hóa học của Typhotrilozit A (CD3OD/CDCl3) 59

MỞ ĐẦU

Nước ta có diện tích khoảng 330.000 km2, nằm ở trung tâm Đông Nam Á và trải dài trên 15 độ vĩ (khoảng 1650 km) Đồi núi chiếm 3/4 diện tích trong đó núi cao trên 500 m chiếm khoảng 1/3 diện tích lãnh thổ Khí hậu nhiệt đới, gió mùa có

2 mùa rõ rệt thay đổi theo địa hình Nhiệt độ trung bình hàng năm trên 22 0C, lượng mưa trung bình hàng năm vào khoảng 1200-2800 mm, độ ẩm tương đối cao (trên 80%) [4]

Những đặc thù về khí hậu thiên nhiên như vậy đã làm cho nước ta có hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Theo các số liệu thống kê mới nhất thảm thực vật Việt Nam có trên 12000 loài, trong số đó có trên 3200 loài thực vật được sử dụng làm thuốc trong Y học dân gian [1], [3], [4], [5], [6]

Từ xưa đến nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống hàng ngày của con người Ngày nay những hợp chất tự nhiên

có hoạt tính sinh học được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp cũng như nông nghiệp, chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và

mỹ phẩm v.v Mặc dù công nghệ tổng hợp hoá dược ngày nay đã phát triển mạnh

mẽ, tạo ra các biệt dược khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh nhờ

đó giảm tỷ lệ tử vong rất nhiều, song những đóng góp của các thảo dược cũng không vì thế mà mất đi chỗ đứng trong Y học Nó vẫn tiếp tục được dùng như là nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp hoặc cung cấp những chất đầu cho công nghệ bán tổng hợp nhằm tìm kiếm những dược phẩm mới cho việc điều trị các chứng bệnh thông thường cũng như các bệnh nan y Các số liệu gần đây cho thấy rằng, có khoảng 60% dược phẩm được dùng chữa bệnh hiện nay, hoặc đang thử cận lâm sàng đều có nguồn gốc từ thiên nhiên [54]

Vì vậy, nguồn cây thuốc dân gian cũng như vốn sử dụng phong phú của đồng bào các dân tộc vẫn là kho tàng quí giá để khám phá, tìm kiếm nhiều loại thuốc mới

có hiệu lực cao cho công tác phòng và chữa bệnh, kể cả những bệnh nan y của thời đại như là ung thư, HIV/AIDS v.v Có thể nêu một số ví dụ như là vinblastin, vincristin chữa bệnh ung thư máu là những hoạt chất được chiết xuất từ cây dừa cạn

(Catharanthus roseus họ Apocynaceae); Taxoter - thuốc chữa ung thư vú là sản phẩm chuyển hoá của một số diterpenoit chiết xuất từ một số loài Taxus họ Pinaceae Và gần đây nhất là cây Xạ đen ( Celastrus hindsic Benth., họ

Celastraceae) có ở vùng Hoà Bình, miền Bắc Việt Nam được dùng làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư Chế phẩm CADEF - là một tổ hợp của hàng chục loại dược liệu được dùng để hạn chế và hỗ trợ điều trị ung thư v.v là một số ví dụ trong việc khai thác và sử dụng kho tàng cây thuốc dân gian

Theo hướng nghiên cứu nói trên, cây Bán hạ ba thùy có tên khoa học là

Typhonium trilobatum được y học cổ truyền Việt Nam sử dụng trị nhiều chứng

bệnh [3], [6] Cây Bán hạ ba thùy là một trong những vị thuốc được xếp trong nhóm thuốc ôn hoá hàn đờm Theo Hải Thượng Lãn Ông và Tuệ Tĩnh thì vị thuốc này là

vị chủ chốt để chữa các chứng bệnh do đờm hàn gây ra [7], [8] Mặc dù vậy, cho đến nay có ít công trình khoa học nghiên cứu về loài thực vật này Với mục đích nghiên cứu và tìm hiểu thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của cây Bán

hạ ba thùy, góp phần làm tăng thêm sự hiểu biết về nguồn thực vật làm thuốc phong phú và quý giá của Việt Nam

Với những căn cứ nói trên, cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) được

chọn làm đối tượng nghiên cứu cho công trình nghiên cứu này, tên đề tài là:

“Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Bán hạ ba thùy” với mục đích xác định

thành phần, bản chất hoá học của các chất có trong cây Bán hạ ba thùy

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Khái quát về họ Ráy (Araceae)

Họ Ráy (Araceae) gồm những loài thực vật thân thảo, ở Việt Nam có khoảng

30 chi và trên 100 loài [1], nhưng nói chung họ Ráy ít được nghiên cứu sàng lọc hoá thực vật hơn so với các họ thực vật khác kể cả trong và ngoài nước Trong họ Ráy người ta đã tìm thấy một số hợp chất, chúng là những axít béo, tecpenoit, anc aloit, cerebrozit và glucozit v.v [23]

1.2 Các hợp chất và hoạt tính sinh học của chúng có trong họ Ráy ( Araceae)

1.2.1 Các axit béo

Trong tự nhiên, các axit béo đóng vai trò hết sức quan trọng, chúng là nguồn cung cấp dinh dưỡng không thể thiếu cho cơ thể, đặc biệt cần thiết cho sự phát triển

của trẻ nhỏ Trong cây Ráy ( Alocasia macrorrhiza), người ta đã phân lập được các

axit béo palmatic (2.1), linoleic (2.2), oleic (2.3) và một số glycerit của chúng [10]

OH

O

1 16

2.1 Axit palmatic

OH

O

1 18

9 12

2.2 Axit linoleic

OH

O

1 18

thành thông qua liên kết C-8 C-8’ Các hợp chất bis-arylpropanoit trong tự nhiên

có liên kết hợp thành, khác với C-8 C-8’ là các hợp chất neolignan [10], [11], [24], [56], [57]

Chi Arum chưa có tài liệu nào khẳng định có ở Việt Nam Các nhà khoa học

Ý đã phân lập từ loài Arum italiacum (Araceae) được một số hợp chất neolignan

(2.4a,b) [17-23]

2.4a,b 2.4a: 1-(4-hidroxy-3-methoxy-phenyl)-2-[3-(3-hidroxy-1-propenyl)-5-methoxy-

Cả 3 hợp chất thu được từ loài Arum italiacum đều chưa có kết quả nghiên

cứu về hoạt tính sinh học của chúng

8' 9'

5 9

4512

2.6a Polysyphorin 2.6b Rhaphidecursinol A

Chi Rhaphidophora (Araceae) ở Việt Nam có khoảng 11 loài [5] Chúng là những thực vật thân thảo Cây Ráy leo lá rách ( Rhaphidophora decursiva) được

phân bố khắp các tỉnh miền núi nước ta từ Lào Cai, Yên Bái, đến Ninh Thuận, Bình Thuận Trong Y học dân gian người ta đã dùng nó để chữa một số bệnh như: giảm đau, cầm máu, tiêu thũng, thanh nhiệt giải độc, chống ho, trừ thấp, chống viêm

nhiễm [6] Từ loài này, mới đây người ta đã phân lập được 3 neolignan (2.6a-c), 2

dẫn xuất của tetrahydrofuran (2.8a,b) và một hợp chất benzoperoxit (2.7) Tất cả

những hợp chất thu được từ loài Rhaphidophora decursiva có hoạt tính chống sốt

rét rất tốt và cao hơn nhiều lần so với các hợp chất chống sốt rét đã quen biết như chloroquine, quinine, artemisinin [32 ]

2.6c Rhaphidecursinol B 2.7 Rhaphidecurperoxin

O

OCH3OCH3

OH

OCH3

O

2.8a Grandisin 2.8b Epigrandisin

Từ loài Acorus calamus, 2 neolignan (2.9 và 2.10) cũng đã được phân lập

[23], [44]

2.9 Diasaron 2.10

1,2-dimethyl-3,4-bis(2,4,5-trimetoxyphenyl)c.butan

1.2.3 Các hợp chất tecpenoit

Từ loài Xanthosoma robustum (Araceae) 2 hợp chất tecpenoit khung

norlanostan (2.11a,b) đã được phân lập [23], [35]

HO

O

HO

O HO

OMe OMe

OMe

MeO

OMe MeO

OMe MeO

MeO MeO

Những hợp chất hydroperoxysterol này có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với

các chủng E coli, Bacillus subtilis và Micrococcus luteus

Từ loài Acorus calamus người ta đã thu được một tinh dầu chứa thành phần

chủ yếu là các hợp chất khung acoran thuộc nhóm chất tecpenoit (sesquitecpe noit) Dưới đây là một vài thành phần chính của tinh dầu [23], [50], [53]

O O

1 2

O O

1 2

2.12 3,8-Acorandion 2.13 4-Acoren-3,8-dion

2.14 4-Acoren-3-on 2.15 Axit acoric

Từ thân rễ cây Thiên niên kiện (Homalomena occulta) ở Việt Nam [3], người

ta đã lấy được tinh dầu màu vàng nhạt, có mùi thơm dễ chịu mà thành phần chính trong tinh dầu là các tecpenoit và l-linalol đạt tới 40%

2.16 6,10-Epoxy-7,10-isodaucandiol 2.17 6,10-Epoxy-7-isodaucanol

O

1 3

O

HO

HO

1 4 5 6 7

HO

1 4 5 6 7 10

2.18 1,4,7-Eudesmantriol 2.19

7(11)-Oppositen-1,4-diol

2.20 11-

Oppositen-1,4-diol

Ngoài ra còn một số thành phần khác như: terpineol, linalyl axetat, limonen,

-terpinen v.v Theo tài liệu [55], thì trong loài Homalomena aromatica người ta

cũng phân lập được một số sesquitecpenoit

Trong loài Colocasia esculenta có chứa 2 hợp chất tecpenoit (2.21, 2.22) [23]

2.21 14-Metylcholesta-9(11),24-dien-

3,7-diol

2.22

14-Metylergosta-9(11),24-dien-3,7-diol

Từ loài Pistia stratiotes một số hợp chất khung steran cũng đã được phát

hiện như: Hydroxystigmast-22-en-3,6-dion (5 ,11 ,22E,24S) và Hydroxystigmast-22-en-3,6-dion (5 ,11 ,22E,24R) [23]

24

sàng lọc hoá thực vật, và đã phân lập được một số ancaloit dẫn xuất của pyperidin

(2.23) và pyrrolidin (2.24) [39],[40], [41], [46], [47]

2.23 2.23a R = H Irnigaine [3-Hidroxy-2-methyl-6-(9-phenylnonyl)pyperidin]

2.23b R=CH3 N-Methyl-Irnigaine

[3-Hidroxy-1,2-dimetyl-6-(9- phenylnonyl ) pyperidin]

Các hợp chất 2.23a và 2.23b là những chất lỏng dạng dầu và độc đối với ấu

trùng tôm nước mặn, có hoạt tính kháng khuẩn Gram(+) và kháng một số chủng nấm filamentous

2.24 2.24a R = H Irniine [1-Methyl-2-(9-phenylnonyl)- pyrrolidin]

2.24b R = CH3O Irnidine [2-(9-(2-metoxyphenyl)nonyl)-1-methyl-pyrrolidin]

Hai hợp chất ancaloit 2.24a và 2.24b trong loài Arisarum vulgare này cũng

đều là những chất lỏng dạng dầu Chúng đều có hoạt tính kháng khuẩn Gram(-) và hoạt tính chống nấm [39], [40] Từ loài Arum maculatum người ta đã phân lập được

một ancaloit khung pyperidin khác (2.25a), [23]

NH

2.25a 2-Propylpiperidine; (S)

N R

OH

2

3 6

RN

Trong loài Caladium maculatum người ta cũng đã phát hiện một dẫn xuất

của pyperidin nữa ở dạng dầu (2.25b), [23]

N

CH3

2.25b 2-Propyl-N-metylpiperidine (S)

Chi Pinellia (Araceae) không thấy có ở Việt Nam Từ loài P pedatisecta các

nhà khoa học Trung Quốc đã thu được một số ancaloit (2.26, 2.27, 2.28, và 2.29a-b)

N

O O O

H N

Các hợp chất ancaloit trên chưa có các số liệu về hoạt tính sinh học của chúng

2.30a Lysicamin 2.30b Liriodenin

Người ta cũng đã phân lập được một số hợp chất trong các chi khác thuộc họ

Ráy như từ chi Lysichiton (Araceae) hợp chất ancaloit lysicamin và liriodenin có

công thức cấu tạo 2.30a và 2.30b đã được phân lập [23]

1.2.4.2 Các cerebrozit

1.2.4.2.1 Giới thiệu chung

Cerebrozit là một lớp chất của glycosphingolipit, chúng là thành phần rất quan trọng của rất nhiều loại mô và các cơ quan trong các hệ thống sinh học Về mặt hóa học các cerebrozit được tạo thành bởi một phần đường hexoza và một phần ceramit Phần ceramit thường chứa một amino ancol mạnh dài được gọi là bazơ

sphingoit (sphingosine hay sphingol) được gắn với một axít béo mạch dài bằng liên

kết amit Các cerebrozit được phân loại như sau:

Glucocerebrozit

Galactocerebrozit

zwiterionic glycosphingolipit

Các cerebrozit tự nhiên đầu tiên được Thudichum phân lập từ tế bào não năm

1874 và được Carter và cộng sự xác định cấu trúc hóa học năm 1950 Sau đó, Shapiro và Flowers cùng tổng hợp toàn phần được các cerebrozit này năm 1961 Hsu và Turk đã đưa ra tính chất cấu trúc hóa học của các cerebrozit bằng phương pháp va chạm hoạt hóa phân ly (Collisional Activated Dissociation-CAD) và phương pháp khối phổ nối tiếp, ion hóa bằng bụi electoron (ESI)

N O

O

CH3

N O

O

O

Về mặt sinh học, một vài cerebrozit đóng vai trò cấu trúc hỗ trợ, các yếu tố quan trọng của màng tế bào và hoạt động như các chất truyền dẫn các sự kiện sinh học ví dụ như: hoạt hóa, dính kết các tế bào, sự truyền tin nội bào và đóng góp vào

sự phát triển của tế bào phần lớn thông qua sự gắn kết của chúng vào protein Hơn thế nữa, các cerebrozit còn đóng vai trò quan trọng trong màng tế bào chúng như là

bề mặt tế bào cho các kháng nguyên và các thụ thể Trong thực tế, các cerebrozit có chức năng sinh học rất rộng liên quan đến tính lưỡng tính của phân tử ví dụ như: đối với hệ số phát triển thần kinh (NGF-Nerve Growth Factor) các phân tử sinh học lớn

là nhân tố có tính quyết định nhất đến sự điều chỉnh phát triển, sự khác biệt và sự tồn tại của nơ-ron thần kinh Ngoài ra, các cerebrozit còn được dùng để điều trị

bệnh mất trí nhớ (Alzheimer) và một số bệnh khác [51], [56]

1.2.4.2.2 Các cerebrozit trong họ Ráy

Trong họ Ráy (Araceae), người ta cũng đã phát hiện thấy các hợp chất

cerebrozit có trong một số loài như loài Typhonium giganteum có chứa các hợp chất

HO

H HO

H

H OH H

O

OH

OH NH

OH

O

19

8 OH

O H

O OH

3.28a 3.28b

O H

HO

H HO

H

H OH

Còn trong loài Alocasia macrohirrza, người ta cũng đã phân lập được các

cerebrozit (alocerebrozit A-C) 3.29a-c, chúng đều có hoạt tính kháng khuẩn Gram(-/+) [10]

Trong cây Bán hạ Trung Quốc (Typhonium giganteum), người ta cũng đã

tìm thấy hợp chất cerebrozit 3.30, còn từ cây Arisaema amurense các nhà khoa học

cũng đã phân lập được 4 cerebrozit mới (3.31a-d) [51]

HO

H HO

H

H OH H

O OH

O H

HO

H HO

H

H OH

OH NH

OH

3.31a m=15, 3.31b m=17 3.31c m=15, 3.31d m=17

Trong loài Bán hạ Việt Nam (Typhonium blumei) người ta đã phân lập được

một cerebrozit nhưng chưa xác định được cấu trúc [2]

HN OMe

HO

Những nghiên cứu gần đây cho biết, từ loài Alocasia macrorrhiza thuộc họ

Ráy, có một số cerebrozit và hợp chất nitryl (2.32) [10], [24], [33]

Triglochinin

1.2.4 Các hợp chất gl ycozit

Theo Phạm Hoàng Hộ và các cộng sự thì chi Arisaema họ Ráy ở Việt Nam

có khoảng 5 loài, chúng đều là các địa thực vật có củ tròn, to [5] Từ loài Arisaema

amurense người ta đã phân lập được một số hợp chất glycerol (2.33, 2.34 và 2.35) [34]

2.33 Glycerol 1-hexadecanoat-2-(9,12-octadecadienoat) 3-O- -D-galactopyranozit

O

CH 2 OH

OH

OH OH O

O O

O O

9

12 9

18 18

HN OMe

HO

2.35 Glycerol 2-(9,12- octadecadienoat) 1-octadecanoat 3-O-[

O HO

O OH

3

7

5 6

HO

O H

H HO

H

H

OH H

O HO

OH HO

OH

OH HO

H

O OH

OH 1

3 19

6

8 11 12

15

O H

H HO

OH

H H

OH

HO

O H

H HO H

H OH H

O HO

O H

H HO

H H OH H

O HO

1.2.5 Các hợp chất trong chi Typhonium

Chi Typhonium ở Việt Nam theo Phạm Hoàng Hộ và cộng sự có khoảng 4

loài [5 ] Chưa có nhiều nghiên cứu sàng lọc hóa thực vật về các loài trong chi này

được tiến hành Gần đây loài bán hạ (Typhonium blumei) đã được tác giả Khổng

Thị Bình nghiên cứu sàng lọc hóa thực vật [2] Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu

thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) Các kết quả thu được sẽ được trình bày trong phần kết quả và thảo luậ n của luận văn Từ cây Bán hạ Trung Quốc Typhonium giganteum người ta đã phân lập được một số hợp chất cerebrozit [57], từ cây bán hạ Việt Nam (Typhonium blumei) người ta đã phân lập được một hợp chất cerebrozit [2] Nói chung, chi Typhonium thuộc họ Ráy ít được nghiên cứu hơn so với các chi khác Các kết quả

nghiên cứu về chi này còn khá khiêm tốn Theo phân tích sơ bộ trong cây Bán hạ ba

thùy (Typhonium trilobatum), chúng tôi cũng đã phân lập được một cerebrozit, để

xác định cấu trúc hoàn thiện của nó cần có nghiên cứu tiếp theo

1.3 Phổ 13 C-NMR phân giải cao trong nghiên cứu cấu trúc và thành phần của lipit (axít béo và este của nó)

1.3.1 Giới thiệu chung

Phổ 13

C-NMR phân giải cao cung cấp cho chúng ta rất nhiều thông tin hữu ích về cấu trúc hoá học của các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất lipít nói riêng Các chuỗi tín hiệu (pic của độ dịch chuyển hoá học) cho chúng ta 2 giá trị

quan trọng 1 Thông tin về phần định tính (vị trí xuất hiện của pic ppm), 2 Thông

tin về phần định lượng (độ cao hay cường độ của pic) [26]

Phổ 13

C-NMR của dầu béo hoa rượu Rum (Safflower) được thể hiện ở hình 1 1

Hình 1.1 Phổ 13C-NMR phân giải cao của dầu béo hoa rượu Rum (Safflower)

Độ dịch chuyển hoá học (ppm) rất nhạy cảm trên toàn bộ chuỗi các bon (C) của một axít béo cụ thể và còn có thể bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi cấu trúc phân tử cách xa nguyên tử trung tâm từ 6 nguyên tử trở lên Ví dụ: Độ dịch chuyển hoá học

của nguyên tử C trong nhóm axyl (C-1) bị ảnh hưởng bởi liên kết đôi 9 cách

nguyên tử trung tâm (C-1) là 8 nguyên tử C Rất nhiều thông tin về độ dịch chuyển hoá học (ppm) của các hợp chất axít béo, glyceroleste, phospholipit … Cụ thể đã được tập hợp thành thư viện thông tin về chất béo và chúng ta có thể sử dụng những thông tin này để xác định các nhóm chức và vị trí của nó trong chuỗi ankyl mạch dài Việc sử dụng những số liệu đặc trưng của một số loại phân tử cho phép chúng

ta có thể xác định được giá trị định tính cũng như giá trị định lượng của một số hỗn hợp axít béo tự nhiên (hoặc dẫn xuất của nó như: glyceroleste, lipit ) [26]

1.3.2 Axit ankanoic và este

palmitic cho ta biết rõ 6 tín hiệu của các nguyên tử các bon C -1, C-2, C-3 và 1,

2 và 3 Các tín hiệu còn lại xuất hiện gần nhau hoặc trùng lên nhau trong khoảng

29,0-29, 8 ppm Phần tín hiệu này rõ ràng là của các nguyên tử C thuộc các nhóm metylen (CH2) còn lại trong mạch Một vài tín hiệu này có thể nhận biết được trong một số trường hợp đặc biệt nhưng sẽ khó nhận dạng hơn trong một hỗn hợp Riêng

6 tín hiệu pic được nhận biết rõ ràng có thể xuất hiện như một chùm píc trong các

phổ 13

C-NMR của một hỗn hợp các axít béo hoặc dẫn xuất của nó Sự hiểu biết về chùm tín hiệu này là rất quan trọng để nhận biết cặn kẽ hơn về các thành phần có trong hỗn hợp

Độ dịch chuyển hoá học của các nguyên tử C1 -3 tương đối khác nhau tùy

thuộc vào bản chất của nhóm acyl Bảng 1 1 còn cho biết thêm về độ dịch chuyển

hoá học của metylpalmitat và glyceroleste của nó Mặc dù độ dịch chuyển hoá học của các nguyên tử C1 -3 có sự thay đổi ít nhiều trong các phổ 13

C-NMR của các

chuỗi , -glyceroleste nhưng sự khác biệt đó ổn định trong khoảng giá trị là 0,41;

0, 17 và 0, 04 ppm Chúng ta rất dễ dàng phát hiện ra sự khác biệt đó ở trường hợp C-1 và C -2 nhưng ở C -3 chúng ta chỉ có thể phân biệt chúng bằng phổ 13C-NMR phân giải cao của nó Trong trường hợp của những axit và este mạch ngắn các nhóm metyl (CH3) và nhóm R-cacboxy (-COOR) bị ảnh hưởng rõ ràng trên toàn mạch C nhưng sẽ có độ dịch chuyển hoá học tương đối khác nhau ở những đồng đẳng mạch dài do có 2 nhóm cuối không bị trùng lặp

Bảng1 1 Độ dịch chuyển hóa học ( , ppm) của các nguyên tử C1-6 và 1-4

của axit palmitic, metyl và glycerol este của nó [28]

Axit palmitic Metyleste Glyceroleste

Từ đó cho thấy tất cả 4 nguyên tử C của axít butanoic và este của nó có độ dịch chuyển hoá học khác nhau, do vậy chúng ta hoàn toàn có thể xác định được những hợp chất C4 Tương tự như vậy đối với những axít chứa 6 nguyên tử C có các tín hiệu đặc biệt C3 -6 còn ở các hợp chất C8 ta có tín hiệu đặc biệt của C -6( 3) [26], [28], [30] Những tín hiệu về độ dịch chuyển hoá học trong phổ 13C-NMR của các axit ankanoic C4, C6, C8 được tập hợp trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C

trong glyceroleste của các axit ancanoic C4, C6, và C8 (trong chuỗi và ) [26]

Axít ankanoic CB4 Axít ankanoic CB6 Axít ankanoic CB8

1.3.3 Các axit béo monoenoic và este

Trong trường hợp của các axit và este mạch dài có chứa một nối đôi ta thấy xuất hiện thêm tín hiện của các nguyên tử C olefin và tín hiệu của các nguyên tử C thuộc các nhóm metylen (CH2) liên kết trực tiếp với các nguyên tử C olefin, những nguyên tử C này được gọi là các nguyên tử C allylic Chúng ta có thể xác định được cấu dạng và vị trí của liên kết đôi này dựa vào độ dịch chuyển hoá học của 2 nguyên

tử C allylic Từ đó có thể sử dụng những thông tin thu được để nghiên cứu những dầu thực vật được hydro hoá từng phần mà thường là những hỗn hợp của các axit béo không no [29]

Đối với phần lớn các axít monoenoic và este thì các nguyên tử C olefin cho

độ dịch chuyển hoá học riêng biệt phụ thuộc vào vị trí, cấu dạng của liên kết olefin

đó trong mạch Trên cơ sở này chúng ta có thể nhận dạng được những đồng phân

cis, trans của các axít monoenoic và este 2-11 và 1-4 Đối với glyceroleste thì độ dịch chuyển hoá học của chúng đôi khi có sự khác nhau đáng kể ở chuỗi và

[27] Một số giá trị của độ dịch chuyển hoá học cụ thể được xem trong bảng 1.3 và

bảng 1.4

Bảng 1.3 Sự chênh lệch về độ dịch chuyển hóa học ( ppm)

giữa 2 nguyên tử C olefinic trong các chuỗi , - glycerol este, cis- 2- 11 [26]

Bảng 1.4 Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C olefinic

trong metyl este chọn lọc [26]

Metyleste Độ dịch chuyển hóa học (ppm) Chênh lệch

Trong các trường hợp đồng phân 2-11 thì sự khác nhau giữa 2 độ dịch

chuyển hoá học của 2 nguyên tử C olefin đủ cho phép xác định vị trí của liên kết đôi Người ta đã sử dụng những số liệu này để nghiên cứu những dầu thực vật có chứa axít petroselinic (là các đồng phân của axít oleic) Những nguyên tử C allylic

có độ dịch chuyển hoá học = 27,2 - 27, 3 ppm cho ta biết liên kết đôi (olefin) có

cấu hình cis (Z) còn độ dịch chuyển hoá học của chúng nằm trong khoảng = 32,6 -

32, 7 ppm thì liên kết olefin có cấu hình trans (E) Từ đó thấy rằng những tín hiệu

của các nguyên tử C allylic này làm sáng tỏ cấu hình của cả phân tử Những độ dịch

chuyển hoá học của các nguyên tử C allylic và các nguyên tử C 2-5 sẽ khác nhau trong cả 2 cấu hình cis (Z) và trans (E) của các hợp chất axit monoenic và este 3-7

cho phép nhận dạng các đồng phân bằng tín hiệu của các C allylic và khi đã xác

định được các tín hiệu của các nguyên tử C allylic của cả cấu hình cis và trans thì cho phép chúng ta rút ra kết luận về tỷ lệ đồng phân cis/trans trong hỗn hợp [30] Các liên kết olefin tạo ảnh hưởng nhỏ lên nhóm -metylen ( -CH2) trong các đồng

phân cis, trans Những thay đổi nhỏ này có thể nhận thấy được khi ta chồng các tín

hiệu của các nguyên tử C1 -3 và 1-3 Từ đó nhận biết được liên kết đôi ở các vị

trí 4-7 và 4-7 [27]

Phổ 13

C-NMR cũng cho ta biết liên kết đôi của axít béo và este nằm gần nhóm cuối metyl (-CH3) hoặc R -carboxy (-COOR) trong mạch Axit petroselinic (18 : 16c) là một ví dụ về axít monoenoic với nối đôi nằm gần nhóm R-carboxy (=COOR) Một vài tín hiệu đặc trưng độ dịch chuyển hoá học của dầu béo hạt cà rốt trong phổ 13

C-NMR của nó được liệt kê trong bảng 1.5

Phổ 13

C-NMR của axit petroselinic rất dễ dàng xác định tín hiệu của các nguyên tử C1-3, các nguyên tử C olefin và các nguyên tử C allylic Người ta đã sử dụng cường độ của các tín hiệu C1-3 để xác định tỷ lệ % của axít petroselinic có trong dầu hạt cà rốt và chúng có giá trị lần lượt là 70,9% (theo cường độ của tín hiệu pic C -1), 70,3% (theo C-2) và 70,5% (theo C-3) Các phép tính toán cũng chỉ

ra rằng hàm lượng của axít petroselinic đạt tới 80-83% của tổng axít chuỗi và có

tới 48-51% trong chuỗi [29] Những giá trị này rất có ý nghĩa vì việc phân tích

thành phần axít petroselinic có trong dầu thực vật là rất khó khăn và việc phân lập metyloleat cũng như metylpetroselinat bằng sắc ký không phải là việc làm dễ dàng hơn nữa phân giải lipit cũng không phải là phương pháp thích hợp cho việc xác định các axít béo có liên kết đôi nằm gần nhóm R-cacboxy (COOR)

Bảng 1.5 Một vài độ dịch chuyển hóa học ( ppm) từ phổ 13

C-NMR của dầu hạt Cà rốt [26] Nguyên tử

C

Độ dịch chuyển hóa học

Cường độ Nguyên tử

C

Độ dịch chuyển hóa học

1.3.4 Các axit béo polyenoic và este

Thông thường các hợp chất axit béo polyenoic tự nhiên có những nhóm metylen (CH2) chia cắt giữa các nối đôi Người ta đã chia các axít polyenoic này thành các nhóm khác nhau, tuỳ thuộc vào vị trí của nối đôi đầu tiên so với nhóm metyl (CH3) cuối Các nhóm thường gặp nhất là (n-3) và (n-6) tương ứng với các axít -linoleic và linolenic Hệ thống polyen càng dài thì càng dễ dàng nhận biết các tín hiệu của các nguyên tử C ở một hoặc cả 2 đầu mạch Tất cả các axit polyenoic

(n-3) và este đều có tín hiệu chung cho các nguyên tử C -5 (bảng 1.6) và tất cả

các hợp chất axít polyenoic (n-6) và este có tín hiệu chung cho các nguyên tử C -8

(bảng 1.6) Các hợp chất axit polyenoic và este với nối đôi đầu tiên có vị trí C như

nhau cũng chỉ ra được một số tính chất chung (xem tín hiệu của các nguyên tử C1x

-8 trong axít và este 6 ở bảng 1.6) Điều này cho thấy trong axit polyenoic và este

có sự ngăn cách của nhóm methylen (CH2) giữa những nối đôi dạng cis và ta có thể

xác định được vị trí của nối đôi ngoài cùng so với nhóm cuối

Trong các phổ 13

C-NMR của dầu thực vật tín hiệu của các nguyên tử C 1-3

cho ta biết thông tin về sự có mặt, thành phần % của các este (n-9), no (thường là không tách được), (n-6), (n-3) và (n-7) thông qua độ dịch chuyển hoá học và cường

độ píc của các nguyên tử C đó phần lớn là những este của axít -linoleic và

linolenic (bảng 1.7)

Bảng 1.6 Độ dịch chuyển hóa học ( ppm)

của các nguyên tử C trong phổ 13

C-NMR của polyenoat este n -3, n-6 và 6 [26]

nối đôi 5 [25], [26]

Bảng 1.7 Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C 1-3

của một vài axít và este [25]

C-NMR của dầu thực vật Borage [48]

C Axit (ppm) Cường độ C- Allylic (ppm) Cường

Kết quả phân tích dầu thực vật Borage được liệt kê ở bảng 1.8 Axit

-linoleic có thể nhận biết được từ tín hiệu của các nguyên tử C1-3, của C-5-allylic và

6 tín hiệu của các nguyên tử C olefin của 3 axit G9, G10 và G12 (G: axit -linoleic) được xuất hiện như những vạch kép đối với chuỗi và Những kết quả này cũng

được sử dụng bằng phương pháp tương tự để nghiên cứu thành phần axit petroselinic, và thành phần % của axit -linoleic là 27% (Từ cường độ tín hiệu píc C-1) và 24% (từ C-3) Hàm lượng của axit này đạt tới 16% trong chuỗi và 41% của chuỗi Wollenberg cũng chỉ ra rằng nếu từ phổ 13

C-NMR người ta thu thập các số liệu ở những thời gian phục hồi thích hợp trong khoảng 5-10 giờ thì những mạch acyl 9 ( oleat, linoleat, -linoleat) có thể xác định từ cả các tín hiệu của C-1

và các tín hiệu của nguyên tử C olefin thích hợp, ví dụ như trên cơ sở của tín hiệu nguyên tử C-1 thì trong dầu lúa mạch thành phần axít oleic chiếm 27% còn thành phần axít linoleic chiếm 57% [59] Những giá trị này hoàn toàn phù hợp với kết quả thu được bằng phương pháp phân tích GC (27, 4 và 57,7%) Từ những số liệu của phổ 13

C-NMR Wollenberg đã tính được tỷ lệ phân bổ của những axít này giữa mạch

và của oleat este là 66/34 và của linoleat este là 59/41 Những kết quả tương tự

cũng đã được rút ra từ tín hiệu olefin của dầu lạc (các kết quả chỉ đúng cho các axít béo không no) [60]

1.3.5 Các axit béo không no và este khác

Chúng ta ít gặp những axít béo có chứa nhiều nối đôi liên hợp trong tự nhiên hơn so với những axít cùng loại nhưng nhưng các nối đôi của chúng bị xen kẽ bởi các nhóm metylen (CH2) Tuy nhiên người ta cũng đã biết một số axít béo có nhiều

nối đôi liên hợp như các axít octadecatrienoic với các nối đôi 9,11,13 và 8,10,12

và có cấu hình cis, trans khác nhau Trong những trường hợp này người ta dễ dàng xác định được cấu hình của nối đôi ngoài cùng là cis hoặc trans dựa vào độ dịch

chuyển hoá học của các nguyên tử C allylic Hai mạch trien khác nhau cũng có thể

nhận biết được thông qua độ dịch chuyển hoá học của các nguyên tử C 1-4 của

chúng Những kết quả nghiên cứu trên cũng có thể áp dụng để xác định các axít acetylenic và allenic Độ dịch chuyển hoá học cho acetylenic là 80, 2 ppm và nguyên tử C propargylic là 18, 8 ppm có sự khác biệt rất lớn so với độ dịch chuyển

hoá học của các nguyên tử C olefin và C allylic trong cả 2 cấu hình cis và trans Đối

với nguyên tử C allenic có độ dịch chuyển hoá học vào khoảng 91, 204 ppm và 91 ppm, nhưng cả khối 3 nguyên tử C này ít ảnh hưở ng đến nguyên tử C của nhóm metylen (CH2) liền kề (29,1 ppm) còn độ dịch chuyển hoá học của nguyên tử C của nhóm CH2 bên cạnh cis-olefin là 27, 2 ppm và trans-olefin là 32,6 ppm , nguyên tử

C của nhóm CH2 liền kề với liên kết 3 là 18,8 ppm [13], [14], [26], [28], [29], [36], [37]

1.3.6 Axit cyclopropen và este

Những axit này có trong dầu hạt gòn (gạo), hàm lượng vào khoảng 12% còn trong dầu hạt bông chỉ có vào khoảng 1% Dầu hạt gòn có một số tín hiệu được xác định là của 2 axit sterculic và malvanic

Những độ dịch chuyển hoá học đáng chú ý được liệt kê trong bảng 1.9 Từ

những cường độ píc đó ta có thể xác định được tỷ lệ % của 2 axít trên trong dầu hạt gòn [26]

Bảng 1.9 Một vài độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C

Vernonia galamenis Trong dầu Hải ly axit ricinoleic (12-hydroxyoleic) có hàm

lượng rất cao (98%) Những tín hiệu đặc trưng cho glyceroleste của axit này dễ dàng được xác định tương ứng với 7 nguyên tử C giữa C -8 và C -14: C-8 (27,38 ppm), C-9 (125,39 ppm), C-10 (133 ppm), C-11 (35,7 ppm) , C-12 (71,44 ppm), C-

13 (36,85 ppm) và C -14 (25,73 ppm) Những tín hiệu nhỏ đi kèm gần với giá trị của nguyên tử C -12 là 71, 68 ppm và 71, 18 ppm cho biết sự có mặt của hydroxyaxit khác có hàm lượng nhỏ hơn chiếm vào khoảng 1,25% tổng tín hiệu của

C -12 [31] Tín hiệu của nguyên tử C 2 (22,63 ppm) đi kèm với các tín hiệu 22, 85

và 22, 40 ppm chiếm khoảng 1,25% tổng tín hiệu của nguyên tử C 2 [31]

Dầu hạt Vernonia galamenis có chứa axit vernolic (axit 12,13-epoxyoleic)

Các độ dịch chuyển hoá học của các nguyên tử C từ C8 -18 cũng rất đặc trưng, tuy

nhiên có một vài tín hiệu không chắc chắn: 8 và C -14 (27, 79 và 27,40 ppm),

C-9 (124,05 ppm), C-10 (132,4 ppm), C-11 và C -15 (26, 33 và 26,28 ppm), C-12

(57,05 ppm), C-13 (56,4 ppm), C-16/ 3 (31,77 ppm), C-17/ 2 (22, 61 ppm trùng với pic 2 của linoleate) và C -18/ 1 (14,01 ppm) So sánh cường độ píc của C - 16/ 3 với tổng cường độ píc 3 ta thấy hàm lượng của axít vernolic là 75% còn tính theo pic C -18/ 1 thì hàm lượng của nó là 70% Đi kèm với 2 tín hiệu của 2

nguyên tử C epoxy (57, 05 và 56,40 ppm) là các tín hiệu 56,80; 56, 70 và 56, 10 ppm với tỷ lệ píc lần lượt là 0,7; 0, 6 và 0,5% cho thấy các epoxyaxit khác có hàm lượng nhỏ đi kèm Sự có mặt của các axít béo no, oleate, linoleate cũng được xác

định bằng các tín hiệu của các nguyên tử C 1-3 và C olefin cũng như C allylic

1.3.8 Những nguyên tử C1 3 trong các gốc acyl và ankyl

Độ dịch chuyển hoá học của nguyên tử C1 3 phụ thuộc vào những nhóm liên kết trực tiếp với nhóm acyl hoặc ankyl của mạch và các gi á trị của chúng được

liệt kê trong bảng 1.10 và bảng 1.11 Những hợp chất acyl bao gồm các axít,

methyleste, este mạch dài, glyceroleste, amit, nitril Phần ankyl gồm các lớp chất sau: ancol, axêtat, este mạch dài v.v Hai nhóm này cho độ dịch chuyển hoá học rất khác nhau Trong một nhóm chất tuy rằng mức chênh lệch của độ dịch chuyển hoá học là nhỏ nhưng đó là sự khác nhau đáng chú ý Trong những dẫn xuất của axít oleic và axít linoleic thì độ dịch chuyển hoá học của các nguyên tử C olefin có độ chênh lệch không lớn [26 ], [27], [29], [30]

Đối với hỗn hợp của ancol và axetat ta sẽ nhận được 2 tín hiệu cho mỗi nguyên tử C1 -3, còn hỗn hợp của axít, este và glyceroleste sẽ có 4 tín hiệu cho mỗi nguyên tử C1 -3 O’connor và các cộng sự đã sử dụng sự khác nhau giữa các độ dịch chuyển hoá học này để nghiên cứu quá trình phản ứng với xúc tác enzym giữa axít và ancol Tiến trình phản ứng được theo dõi thông qua sự giảm tín hiệu của độ dịch chuyển hoá học 61,1 ppm (tín hiệu của C -1 ancol) và sự tăng tín hiệu của độ dịch chuyển hoá học 64,3 ppm (tín hiệu của C -1 este) [45]

Bảng 1.10 Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C1 -3

P CDCl3

S CDCl3

O và P CDCl3/CD3OD (2:1)

Trong trường hợp của các glyceroleste “đối xứng” (2-monoacyl; 1,3-diacyl

và triacyleste) nó cho chúng ta 2 tín hiệu với tỷ lệ píc 2:1, còn trong trường hợp glyceroleste “không đối xứng” (1-monoacyl và 1,2-diacyleste) nó cho ta 3 tín hiệu píc với tỷ lệ 1:1: 1 Trong dung dịch chloroform một vài tín hiệu này rất gần nhau

và có khi trùng lên nhau, đặc biệt là trong trường hợp một tín hiệu có cường độ lớn