2.1.1. Phương thức Điện di trên polyacrylamide gel với sự có mặt của SDS (sodium dodecyl sulfate) là kỹ thuật dùng trong hóa sinh, di truyền và sinh học phân tử để phân tách các protein theo tính linh động điện di của chúng (phụ thuộc vào chiều dài của chuỗi polypeptide hoặc khối lượng phân tử, cấu hình (xoắn) của protein, các biến đổi hậu dịch mã và các nhân tố khác). Điện SDS cho phép phân ly các phân tử protein có khối lượng khác nhau. SDS có điện tích âm rất lớn và có khả năng liên kết với mạch peptide để biến tính các cấu trúc bậc hai và bậc ba (không liên kết bằng cầu disulfide) của protein bằng cách bọc xung quanh khung polypeptide. Như vậy, số lượng SDS tương tác với protein tỷ lệ với khối lượng/kích thước phân tử protein và điện tích của SDS bám vào có thể làm bất cứ phân tử protein nào cũng chuyển động trong điện trường từ cực âm (-) sang cực dương (+). Do đó, bằng phương pháp điện di, có thể phân tách riêng biệt các phân tử protein có khối lượng phân tử khác nhau. Không có SDS, các protein khác nhau có khối lượng phân tử tương tự sẽ dịch chuyển khác nhau do sự khác nhau về cuộn xoắn, bởi vì những khác nhau trong các kiểu cuộn xoắn sẽ làm cho một vài phân tử protein thích hợp tốt hơn với khuôn gel so với những phân tử protein khác. Bổ sung SDS giúp giải quyết vấn đề này, vì nó làm cho các phân tử protein trở thành mạch thẳng sao cho chúng có thể phân tách hoàn toàn theo khối lượng phân tử (cấu trúc sơ cấp, hoặc số lượng (và kích thước) của các amino acid). SDS liên kết với protein theo tỷ lệ khoảng 1,4 g SDS trên 1,0 g protein (mặc dù tỷ lệ liên kết có thể thay đổi từ 1,1-2,2 g/SDS/g protein) tạo ra một tỷ lệ khối lượng/điện tích thống nhất cho mọi phân tử protein để sự dịch chuyển qua gel chỉ liên quan đến kích thước của protein. Một loại thuốc nhuộm vết có thể được bổ sung vào dung dịch protein cho phép theo dõi tiến độ của dịch chuyển protein qua gel trong suốt quá trình điện di. Hình 2.9. Điện di protein bằng kỹ thuật SDS-PAGE và nhuộm bằng Coomassie blue. WM: Chuẩn khối lượng phân tử của protein. Các đường 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 và 8: Mẫu protein. 2.1.2. Khử SDS-PAGE Bên cạnh việc bổ sung SDS, protein có thể được đun nóng nhanh gần đến sôi với sự có mặt của một tác nhân khử, ví dụ như dithiothreitol (DTT) hoặc 2- mercaptoethanol (BME), để biến tính thêm protein bằng cách khử các liên kết disulfide, vì thế khắc phục được một vài dạng cuộn xoắn bậc ba của protein, và bẻ gãy cấu trúc bậc bốn của protein (các tiểu đơn vị oligomer). Phương thức này được xem như là khử SDS-PAGE, và được sử dụng phổ biến nhất. Trường hợp không khử SDS-PAGE (không đun sôi và không có tác nhân khử) có thể được dùng khi cấu trúc nguyên thể là quan trọng trong phân tích về sau (chẳng hạn như hoạt tính enzyme, được trình bày bằng việc sử dụng zymogram). Điện di polyacrylamide gel liên tục nguyên thể pha chế định lượng (quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis, QPNC-PAGE) là một phương pháp mới để phân tách các metalloprotein nguyên thể trong các khuôn sinh học phức tạp. 2.1.3. Điện di và nhuộm Các protein biến tính sau đó được nạp vào một đầu của khuôn polyacrylamide gel đặt trong đệm thích hợp. Dòng điện được sử dụng từ đầu này đến đầu kia của gel, sẽ làm cho các protein tích điện âm dịch chuyển qua gel. Tùy thuộc vào kích thước của chúng, mỗi protein sẽ dịch chuyển với các tốc độ khác nhau qua khuôn gel: protein ngắn dễ dàng đi qua các lỗ của gel, trong khi protein lớn hơn sẽ gặp khó khăn hơn. Sau một vài giờ (tùy thuộc điện áp sử dụng trên gel, nếu điện áp cao protein chạy nhanh hơn nhưng sẽ cho độ phân giải kém hơn), các protein sẽ có sự dịch chuyển khác nhau dựa trên kích thước của chúng, các protein nhỏ hơn sẽ đi nhanh hơn xuống phía dưới của gel, trong khi các phân tử lớn vẫn còn ở vị trí gần với điểm xuất phát. Vì thế, protein có thể được phân tách theo kích thước (và vì thế, theo khối lượng phân tử). Sau điện di, gel được nhuộm (phổ biến nhất là Coomassie Brilliant Blue hoặc thuốc nhuộm bạc), cho phép quan sát các protein được phân tách, hoặc những tiến trình xa hơn (ví dụ: Western blot, xem chương 7). Sau khi nhuộm, các protein khác nhau sẽ xuất hiện ở các băng phân biệt trong gel. Quá trình điện di thường được chạy kèm với protein marker của các khối lượng phân tử đã biết ở một đường riêng biệt trong gel, để canh chỉnh gel và xác định khối lượng của protein chưa biết bằng cách so sánh với khoảng cách dịch chuyển liên quan với marker. Điện di polyacrylamide gel thường là chọn lựa đầu tiên khi thử nghiệm sự tinh sạch protein do tính đáng tin cậy và dễ dàng của nó. Sự có mặt của SDS và bước gây biến tính làm cho các protein được phân tách đơn độc dựa trên kích thước. Các tác nhân bẩn cũng có thể cùng dịch chuyển và xuất hiện một băng không mong muốn tương tự protein. Sự đồng dịch chuyển này cũng có thể làm cho một protein sẽ chạy ở một vị trí khác hoặc không thể xâm nhập vào gel. Đây là điều quan trọng để nhuộm gel hoàn toàn bao gồm phần stacking. Coomassie blue có ái lực liên kết yếu với glycoprotein và các protein dạng sợi, đã làm cản trở chất lượng điện di. 2.1.4. Hệ thống đệm Hầu hết điện di phân tách protein được thực hiện với một hệ thống đệm không liên tục tăng cường một cách ý nghĩa hình dạng của băng trong gel. Trong suốt quá trình điện di ở hệ thống gel không liên tục, một gradient ion được tạo thành trong giai đoạn sớm của điện di làm cho tất cả protein tập trung trong một băng dạng đơn. Nhiều người sử dụng liên tục đệm Tris-glycine hoặc Laemmli tập trung và phân giải ở pH 8,3-9,0. Các pH này khởi động sự tạo thành cầu nối disulfide giữa các gốc cysteine trong protein, đặc biệt khi chúng hiện diện ở nồng độ cao do pKa của cysteine nằm trong phạm vi từ 8-9 và bởi vì tác nhân khử hiện diện trong đệm nạp (loading buffer) không đồng dịch chuyển với các protein. Những tiến bộ gần đây trong công nghệ đệm đã làm nhẹ bớt vấn đề này bằng cách hòa tan protein ở pH tốt dưới pKa của cysteine (ví dụ: bis-Tris, pH 6,5) và bao gồm các tác nhân khử (ví dụ: sodium bisulfite) là yếu tố di chuyển vào gel phía trước các protein để duy trì một môi trường khử. Một lợi ích nữa của đệm được sử dụng với các pH thấp là acrylamide gel ổn định hơn vì thế gel có thể được bảo quản trong một thời gian dài trước khi sử dụng. 2.2. Điện di 2D-PAGE Ngoài điện di SDS, có thể điện di các protein tùy theo điểm đẳng điện (isoelectric point, IEP) của chúng. Phương pháp này được gọi là điện di tập trung đẳng điện (isoelectric focusing, IEF). Trong dung dịch đệm có pH biến thiên liên tục (gradient pH), các protein sẽ phân ly đến vị trí tương thích với điểm đẳng điện của mình. Một hỗn hợp protein phức tạp được nạp vào ở giữa của mặt trái, ở đó pH là trung tính và một điện áp được sử dụng trên khuôn gel. Các protein sau đó dịch chuyển thông qua gel cho đến khi chúng hướng tới điểm đẳng điện của mình, là điểm mà ở đó điện tích của chúng tương tự như pH ở vùng chung quanh. Gel sau đó được ngâm trong dung dịch biến tính (để làm cho các protein không cuộn xoắn) chứa chất tẩy là SDS. Phân tử này tích điện âm rất mạnh và liên kết với tất cả protein, làm cho tất cả chúng đều mang điện âm. Một điện áp sau đó được sử dụng trên khuôn gel từ đầu này đến đầu kia để tất cả protein sẽ chuyển động hướng tới anode, nhưng những protein nhỏ hơn sẽ chuyển động qua gel nhanh hơn, vì thế các protein được phân tách theo kích thước của chúng. Kỹ thuật điện di 2 chiều (2D-PAGE, 2 dimension polyacryamide gel electrophoesis) được dùng để phân tách hỗn hợp protein, và đặc biệt hữu ích cho việc so sánh các mẫu liên quan như mẫu mô bình thường và mẫu mô đột biến. Comparative 2D-PAGE cũng có thể được dùng để tìm kiếm các protein mà sự biểu hiện của chúng rất tương đồng dưới cùng một tập hợp các điều kiện (những yếu tố này có các chức năng liên quan) và nhận dạng các protein được sản xuất trong phản ứng với liệu pháp thuốc. Hình 2.10. Điện di protein hai chiều Có khoảng 10.000 protein khác nhau trong tế bào, tập trung trong hơn sáu loại quan trọng. Kỹ thuật 2D-PAGE không đủ nhạy để phát hiện các protein hiếm và nhiều protein sẽ không được phân giải. Vì thế, cần phải phân cắt mẫu trong các phần khác nhau để làm giảm sự phức tạp của hỗn hợp protein trước khi thực hiện 2D-PAGE. Hai phương pháp điện di theo khối lượng phân tử và điểm đẳng điện có thể kết hợp với nhau tạo nên kỹ thuật điện di 2 chiều. Điện di protein trên polyacrylamide gel cho phép phân đoạn, xác định khối lượng phân tử và phân lập protein. Ngoài ra, khối lượng protein còn được xác định chính xác bằng phương pháp sắc ký khối phổ. Tài liệu tham khảo/đọc thêm 1. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K. 2002. Short Protocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5 th ed. John Wiley & Sons, Inc. USA. 2. Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J. 2000. Molecular Cloning-A Laboratory Manual. Cold Spring Habor Laboratory Press, USA. 3. Rapley R and Walker JM. 1998. Molecular Biomethods Handbook. Humana Press Inc. New Jersey, USA. . thế gel có thể được bảo quản trong một thời gian dài trước khi sử dụng. 2.2. Điện di 2D-PAGE Ngoài điện di SDS, có thể điện di các protein tùy theo điểm đẳng điện (isoelectric point, IEP). nguyên thể trong các khuôn sinh học phức tạp. 2.1.3. Điện di và nhuộm Các protein biến tính sau đó được nạp vào một đầu của khuôn polyacrylamide gel đặt trong đệm thích hợp. Dòng điện được. lượng điện di. 2.1.4. Hệ thống đệm Hầu hết điện di phân tách protein được thực hiện với một hệ thống đệm không liên tục tăng cường một cách ý nghĩa hình dạng của băng trong gel. Trong