Hộp Điện Trong Công Nghệ DNA part 18 doc

Hình 3.9. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nền (baseline). Đầu tiên, tín hiệu huỳnh quang duy trì ở mức độ nền (background), và việc tăng tín hiệu huỳnh quang là không thể phát hiện được (các chu kỳ 1-18, Hình 3.9) cho dù sản phẩm tích lũy theo hàm mũ. Sau đó, sản phẩm khuếch đại tích lũy đủ để đạt tới một hiệu suất cho phép phát hiện được tín hiệu huỳnh quang. Số chu kỳ để đạt được hiệu suất này gọi là chu kỳ ngưỡng (threshold cycle, C T ). Do giá trị C T được đo trong pha hàm mũ khi các tác nhân phản ứng không bị hạn chế, nên real- time qPCR có thể được sử dụng để tính toán chính xác và tin cậy số lượng khởi đầu của khuôn mẫu hiện diện trong phản ứng. C T được xác định chủ yếu bởi số lượng của khuôn mẫu hiện diện ở lúc bắt đầu phản ứng khuếch đại. Khi lượng khuôn mẫu nhiều thì chỉ cần một vài chu kỳ khuếch đại để tích lũy sản phẩm đủ cho một tín hiệu huỳnh quang ở trên background. Vì vậy, phản ứng sẽ có C T thấp hơn hoặc sớm. Ngược lại, nếu lượng khuôn mẫu lúc bắt đầu phản ứng quá ít, thì số chu kỳ khuếch đại cần nhiều hơn để tín hiệu huỳnh quang tăng trên background. Vì vậy, phản ứng sẽ có C T cao hoặc muộn. Các dạng quan hệ này là cơ sở cho hướng định lượng của real-time PCR. 3. Một số ứng dụng chính của real-time PCR - Nghiên cứu biểu hiện gen. Xác định sự hoạt động của gen và định lượng mức độ biểu hiện của nó thông qua RNA bằng kỹ thuật RT-PCR. - Chẩn đoán phân tử. Nghiên cứu mức độ nhiễm virus và vi khuẩn để chẩn đoán các bệnh viêm nhiễm. - Xét nghiệm phân biệt allele. Là phương pháp xét nghiệm đầu cuối được dùng để xác định kiểu gen của mẫu vật (đồng hợp tử: chỉ có allele 1 hoặc chỉ có allele 2, dị hợp tử: có cả hai allele 1 và 2) và phân biệt sự đa hình nucleotide đơn (single nucleotide polymorhism, SNP). VII. Một số ứng dụng của PCR PCR có phạm vi ứng dụng rất rộng trong công nghệ sinh học hiện đại. Theo nguyên tắc trên, đã có nhiều bổ sung và cải tiến để dùng PCR cho nhiều mục đích khác nhau. Ở đây chỉ giới thiệu một số ứng dụng chính: - Trong nghiên cứu genome + Nhân bản phân tử bằng PCR + PCR tái tổ hợp + Kỹ thuật footprinting DNase I + Sàng lọc thư viện λgt11 + Multiplex PCR - Trong y học + Phát hiện tế bào T/virus gây bệnh ung thư máu + Phát hiện virus viêm gan B + Phát hiện virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết + Phát hiện vi khuẩn lao 1. Sử dụng PCR để tạo nhanh các gen tổng hợp Sử dụng phương pháp PCR hai giai đoạn (two-step PCR) để tạo nhanh các gen tổng hợp. Phương pháp này được xây dựng trên cơ sở những nucleotide chồng lên nhau (overlapping), do đó có thể được sử dụng để tạo ra đoạn DNA tổng hợp thông qua nhiều vòng khuếch đại PCR. Khả năng tạo ra DNA tổng hợp có nhiều ứng dụng tùy thuộc vào thiết kế của chúng ta. Người ta có thể thiết kế một gen tổng hợp có chứa codon được dùng để biểu hiện protein trong cơ thể sinh vật. Phương pháp này được hoàn tất nhờ sự giải mã ngược chuỗi amino acid của protein mong muốn. Để thay đổi cấu trúc của codon, gen tổng hợp có thể được thiết kế có những vị trí cắt hạn chế thuận lợi phục vụ cho thí nghiệm tạo dòng về sau. Nguyên tắc của PCR hai giai đoạn đó là hai phản ứng PCR xảy ra liền nhau, phản ứng thứ nhất của PCR phát sinh ra sợi khuôn mẫu tương ứng với gen tổng hợp và sau đó nó được khuếch đại trong phản ứng PCR lần thứ hai (Hình 3.10). Trước khi bắt đầu quá trình này, người ta phải thiết kế cấu trúc và xác định trình tự nucleotide của gen tổng hợp mà mình mong muốn. Sau đó, trình tự các oligonucleotide (primers) theo chiều dài của gen phải được thiết kế và tổng hợp. Thông thường, người ta tổng hợp các oligonucleotide theo số chẵn với chiều dài khoảng 16-30 nucleotide. 2. Tạo dòng cDNA bằng PCR Kỹ thuật tạo dòng kinh điển cDNA đòi hỏi nhiều công sức về xây dựng thư viện để bảo quản bacteriophage hoặc plasmid, nó cần một khối lượng công việc chọn lọc một số lượng lớn các phage hoặc plasmid có tính chất tái tổ hợp. Có ba hạn chế trong phương pháp này: - Cần có một lượng cơ chất (ít nhất 1 µg) mRNA tinh sạch làm vật liệu khởi đầu để xây dựng thư viện với mức độ đa dạng đầy đủ cho nghiên cứu. - Khó khăn thuộc về bản chất bên trong của những phản ứng enzyme tiếp nối nhau làm cho việc tạo dòng cDNA có kết quả thấp, và những dòng gen bị đứt đoạn. - Việc sàng lọc một thư viện với kỹ thuật lai đòi hỏi nhiều thời gian. Kỹ thuật PCR hiện nay có thể giúp chúng ta khắc phục những nhược điểm nói trên, làm cho việc tạo dòng cDNA trở nên dễ dàng hơn. Sử dụng hai primer đặc hiệu của gen, một cDNA có trình tự đã được biết rõ, người ta cho khuếch đại trong PCR. Tuy nhiên, cái khó là làm sao phân lập được những bản sao của cDNA hoàn chỉnh (full-length) từ mRNA, trên cơ sở thông tin về trình tự rất hạn chế. Trình tự chưa biết này nằm kề một đoạn nhỏ của trình tự đã biết rõ. Trình tự chưa biết không thể khuếch đại bằng phương pháp PCR thông thường. Do đó, phương pháp PCR mỏ neo và phương pháp PCR đảo ngược đã được phát triển trong thời gian gần đây để giải quyết vấn đề này. Hình 3.10. Sơ đồ minh họa một phản ứng tạo nhanh gen tổng hợp thông qua phương pháp PCR hai giai đoạn. Gen quan tâm được khuếch đại trong phản ứng PCR thứ nhất với cặp oligonucleotide đặc hiệu gen nhưng có đưa vào vùng chồng lên nhau (primer A và primer B). Trong phản ứng PCR thứ hai, các primer mở rộng C và D gắn với vùng chồng lên nhau của sản phẩm PCR lần thứ nhất và bổ sung tất cả các nhân tố điều hòa cần thiết cho sự phiên mã và dịch mã. Sản phẩm PCR lần thứ nhất được pha loãng 200 lần để làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR thứ hai. 2.1. PCR mỏ neo Kỹ thuật PCR mỏ neo có một điểm chung là: Tạo dòng DNA đi từ một đoạn trình tự đã biết rồi tới đoạn trình tự kế cận chưa biết nhờ sự giúp đỡ của một primer đặc hiệu đối với gen tại một đầu sợi đơn và một primer tổng hợp tại một đầu sợi đơn khác. Do chỉ có primer đặc hiệu đối với gen mới có thể neo trong PCR làm dễ dàng hơn cho việc thu thập một lượng lớn sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu so với PCR chuẩn. Kỹ thuật này khác với PCR chuẩn là chỉ cần một primer đặc hiệu cho phản ứng. Trong kỹ thuật PCR mỏ neo, một đuôi nhân tạo của các gốc dA được thêm vào đoạn cuối của DNA khuôn mẫu. Sự khuếch đại DNA xảy ra khi có primer của một trình tự đã biết trước và một primer thứ hai có các gốc oligo(dT). 2.2. PCR đảo ngược Phương pháp PCR đảo ngược có thuận lợi lớn hơn nhờ khuếch đại trình tự kế cận chưa biết bằng hai primer đặc hiệu của gen. PCR đảo ngược hoạt động theo nguyên tắc tạo dòng sợi đơn một trình tự DNA. Sau đó, DNA này được cắt bằng RE ở vị trí tương ứng để tạo ra DNA đích, tiếp theo nó hoạt động theo chu trình có tính chất monomer. DNA này được khuếch đại lên bằng các primer tương đồng tại hai đầu sợi đơn của DNA có trình tự đã biết. Hình 3.11. Ứng dụng PCR đảo ngược. Hai primer đặc hiệu được gắn vào trình tự đã biết và sau đó DNA được khuếch đại theo chiều mũi tên. Ban đầu là sợi 5’3’của mRNA cho vào phản ứng phiên mã ngược thành sợi đơn cDNA 3’5’, tiếp tục tổng hợp sợi đơn của cDNA lần thứ hai, cho ra sợi đôi cDNA (5’3’và 3’5’). Sợi này có chứa một trình tự đã biết rõ. Kỹ thuật tạo dòng làm cho cDNA thẳng biến thành cDNA vòng sợi đôi. Tiếp đến, mở vòng nhờ RE cắt trình tự được biết làm đôi, một nửa ở đầu sợi thẳng bên này, một nửa bên kia. Kéo thẳng sợi DNA và khuếch đại trong PCR (Hình 3.11). 3. Ứng dụng trong di truyền PCR giúp đắc lực cho việc lập bản đồ gen (gene mapping) của sinh vật. Phương pháp này có tên là phân tích DNA đa hình được khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD). Trong phương pháp RAPD, PCR được thực hiện với các primer chọn ngẫu nhiên. Kết quả là tạo ra một số đoạn DNA có chiều dài . cDNA 3’5’, tiếp tục tổng hợp sợi đơn của cDNA lần thứ hai, cho ra sợi đôi cDNA (5’3’và 3’5’). Sợi này có chứa một trình tự đã biết rõ. Kỹ thuật tạo dòng làm cho cDNA thẳng biến thành cDNA. 2. Tạo dòng cDNA bằng PCR Kỹ thuật tạo dòng kinh điển cDNA đòi hỏi nhiều công sức về xây dựng thư viện để bảo quản bacteriophage hoặc plasmid, nó cần một khối lượng công việc chọn lọc. dòng sợi đơn một trình tự DNA. Sau đó, DNA này được cắt bằng RE ở vị trí tương ứng để tạo ra DNA đích, tiếp theo nó hoạt động theo chu trình có tính chất monomer. DNA này được khuếch đại lên