thành phần protein của phức chất RNA-protein. Các protein được loại bỏ khỏi mẫu bằng cách chiết (ly tâm) với phenol, phenol:chloroform và chloroform. RNA hòa tan trong pha nước được kết tủa bằng ethanol (hoặc isopropanol) và được thu nhận lại qua ly tâm. RNA được bảo quản trên một năm ở -70 o C trong nước có chứa RNasin (nhân tố ức chế RNase). 1.2. Phân lập RNA poly(A) + RNA tổng số của tế bào chứa khoảng 90-99% rRNA và tRNA, trong đó rRNA chiếm khoảng 80-85% và tRNA chiếm khoảng 15-20%. Các RNA này có kích thước và trình tự xác định và có thể được tách riêng dễ dàng bằng điện di hoặc ly tâm. Riêng mRNA chỉ chiếm khoảng 1-5% RNA tổng số của tế bào, lại có kích thước và trình tự rất đa dạng. Tuy nhiên, chúng có một điểm chung là cấu trúc đuôi polyA (có thể lên tới 100A). Dựa vào cấu trúc này và đặc tính liên kết bổ sung A-T của nucleic acid, có thể tách mRNA ra khỏi mẫu bằng sắc ký ái lực trên cột oligo(dT)-cellulose. Các mRNA sẽ bám lên cột thông qua liên kết bổ sung với oligo(dT) và được thu nhận lại qua ly tâm. Kỹ thuật này cho phép thu nhận mRNA từ những mẫu có khối lượng rất nhỏ. Hình 6.1. Sơ đồ quy trình tinh sạch mRNA từ RNA tổng số 2. Phân tích RNA 2.1. Lai Northern (Northern hybridization) Phân tích RNA là công việc quan trọng của nhiều nghiên cứu về sinh học phân tử, vì nó có thể cung cấp thông tin về sự biểu hiện của gen trong cơ thể sống. Lai bằng màng lọc (nylon hoặc nitrocellulose) các RNA được phân đoạn với đoạn mồi là nucleic acid đánh dấu đồng vị phóng xạ 32 P (hoặc digoxigenin-dUTP) được gọi là phương pháp thẩm tích Northern (Northern blot). Phương thức này bắt nguồn từ phân tích Southern blot (xem chương 5), dựa trên cơ sở khả năng bổ sung của các nucleic acid sợi đơn để tạo thành các phân tử lai. Một cách tóm tắt, RNA được phân chia theo kích thước trên agarose gel dưới các điều kiện biến tính, thẩm tích và liên kết không thuận nghịch với màng nylon hoặc nitrocellulose, lai với đoạn mồi nucleic acid được đánh dấu 32 P. Sau khi rửa trôi đoạn mồi không liên kết hoặc liên kết không đặc hiệu, các phân tử RNA lai được phát hiện như là các băng phóng xạ tự ghi trên phim X-quang (Hình 6.2). Hình 6.2. Phân tích sự biểu hiện của gen bằng lai Northern. Hình phía dưới là điện di RNA tổng số trên agarose gel được biến tính bằng formamide. Hình phía trên là tín hiệu phóng xạ thu được từ phản ứng lai giữa RNA tổng số với mẫu dò được đánh dấu bằng 32 P. Thẩm tích Northern là phương pháp quan trọng để nghiên cứu biểu hiện của gen, do các RNA hiện diện trong tế bào hoặc loại mô quy định mô tả khái quát một phần của genome được biểu hiện trong tế bào hoặc mô đó. Phân tích Northern cho thấy mức độ ổn định của sự tích lũy chuỗi RNA qui định (thường là mRNA) trong mẫu nghiên cứu. Vì thế, phân tích Northern cho phép người ta liên kết các mức độ biểu hiện mRNA với các tính chất hình thái và sinh lý của cơ thể sống. Kỹ thuật lai Northern là một phương pháp được ứng dụng rộng rãi cho việc phân tích biểu hiện gen. Ví dụ: kỹ thuật này đã được sử dụng cho việc mô tả đặc điểm của các cDNA và gen được tạo dòng, nghiên cứu đặc trưng cơ quan/mô của sự biểu hiện gen, phân tích hoạt tính của các gen nội và ngoại sinh trong cơ thể chuyển gen, và nghiên cứu sự biểu hiện của gen trong mối liên quan với sự phát triển và các yếu tố vô sinh và hữu sinh. 2.2. Lai Dot (Dot hybridization) Lai dot được Kafatos và cs. (1979) thực hiện đầu tiên bằng cách chấm các mẫu nhỏ của dung dịch RNA lên màng nitrocellulose, sau đó màng được làm khô, lai với mẫu dò đặc trưng RNA hoặc DNA có đánh dấu 32 P, và ủ với phim X-quang. Mặc dù khó định lượng chính xác do kích thước của các chấm lớn và khác nhau, nhưng trong nhiều trường hợp có thể thu được một ý tưởng tốt về cường độ biểu hiện của một gen đặc biệt nào đó trong các mô đặc trưng hoặc các tế bào nuôi cấy (Hình 6.3). Hình 6.3. Phân tích dot để định lượng RNA. Hàng phía dưới là các nồng độ RNA chuẩn đã biết. Hàng trên là các nồng độ RNA khác nhau được tách chiết từ mô/cơ quan. II. Tổng hợp cDNA (complementary DNA) Phương pháp tổng hợp cDNA có nhiều thuận lợi do: (1) Lấy mRNA đúng của gen. (2) Không tốn công phân tích những đoạn gen trùng lặp. (3) Chọn lọc dễ dàng trong một số trường hợp. Ở đây chỉ trình bày phương pháp tổng hợp cDNA. Quá trình tổng hợp cDNA qua ba giai đoạn như sau: (1) Tổng hợp sợi thứ nhất bằng enzyme reverse transcriptase. (2) Biến tính và cắt RNA trong thể lai mRNA-cDNA tuần tự bằng nhiệt và enzyme RNase H của E. coli. Thay thế khuôn mẫu là chuỗi RNA bằng chuỗi cDNA thứ nhất và tổng hợp sợi cDNA thứ hai nhờ DNA polymerase I của E. coli. (3) Cắt vòng cặp tóc của cDNA sợi đôi nhờ nuclease S1 và sửa chữa hai đầu bằng đoạn Klenow (Hình 6.4). 1. Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất 1.1. Enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) Nhân tố quan trọng nhất trong tổng hợp cDNA là chất lượng của enzyme phiên mã ngược được sử dụng trong phản ứng. Mặc dù chất lượng của enzyme được sử dụng nói chung là tốt, song vẫn khó loại trừ được RNase bẩn. Trở ngại này có thể khắc phục bằng cách dùng các nhân tố ức chế mạnh RNase (RNase inhibitor), ví dụ như: vanadyl-ribonucleoside hoặc RNasin, trong phản ứng phiên mã ngược. Tỷ lệ enzyme phiên mã ngược dùng cho khuôn mẫu mRNA cũng có ảnh hưởng khác nhau đến hiệu suất tổng hợp cDNA hoàn chỉnh. Nếu số lượng khuôn mẫu nhiều thì hiệu suất của sản phẩm phiên mã cDNA sẽ tăng lên cùng với việc tăng số lượng enzyme reverse transcriptase. Trong nghiên cứu, hiệu suất tối đa của các sản phẩm phiên mã cDNA hoàn chỉnh đạt đến 80 tiểu phần enzyme/ g của khuôn mẫu, tỷ lệ enzyme cao như thế đòi hỏi phải sử dụng enzyme tinh sạch cao và bao gồm cả các nhân tố ức chế RNase trong phản ứng. 1.2. Oligo dT primer Các oligo dT primer được sử dụng để làm mồi cho phản ứng tổng hợp sợi cDNA thứ nhất dựa trên khuôn mẫu của mRNA. Các oligo dT primer sẽ liên kết với đuôi polyA của mRNA. 1.3. Deoxynucleoside triphosphate (dNTP) Nồng độ của bốn loại dNTP là yếu tố đặc biệt quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp cDNA. Nếu nồng độ của một trong bốn dNTP giảm xuống dưới 10-50 M thì hiệu suất của sản phẩm phiên mã giảm rõ rệt. Khi sử dụng RNA của avian myeloblastosis virus làm khuôn mẫu thì việc sản xuất các cDNA hoàn chỉnh tăng tối đa ở nồng độ 75 M của cả bốn loại dNTP. Nồng độ của dNTP từ 200-250 M đang được dùng phổ biến. 1.4. Các cation hóa trị 1 và hóa trị 2 Các điều kiện ion ảnh hưởng thật sự đến hiệu quả phiên mã của các khuôn mẫu khác nhau. Đối với các sản phẩm phiên mã dài thì ion K + có hiệu quả cao hơn ion Na + . Nồng độ K + tối ưu cho quá trình tổng hợp và kéo dài kích thước cDNA là khoảng từ 140-150 mM. Các cation hóa trị 2 là yêu cầu tuyệt đối cho hoạt tính của enzyme phiên mã ngược. Không có hoạt tính nào được tìm thấy ở nồng độ <4 mM của ion Mg 2+ , nồng độ ion Mg 2+ tối ưu cho quá trình sản xuất các sản phẩm phiên mã hoàn chỉnh là khoảng 6-10 mM. . Tổng hợp cDNA (complementary DNA) Phương pháp tổng hợp cDNA có nhiều thuận lợi do: (1) Lấy mRNA đúng của gen. (2) Không tốn công phân tích những đoạn gen trùng lặp. (3) Chọn lọc dễ dàng trong. pháp tổng hợp cDNA. Quá trình tổng hợp cDNA qua ba giai đoạn như sau: (1) Tổng hợp sợi thứ nhất bằng enzyme reverse transcriptase. (2) Biến tính và cắt RNA trong thể lai mRNA-cDNA tuần tự bằng. Thay thế khuôn mẫu là chuỗi RNA bằng chuỗi cDNA thứ nhất và tổng hợp sợi cDNA thứ hai nhờ DNA polymerase I của E. coli. (3) Cắt vòng cặp tóc của cDNA sợi đôi nhờ nuclease S1 và sửa chữa hai