2000 nm. Phần lớn virus chỉ nhìn thấy được qua kính hiển vi điển tử. Chất mang thông tin di truyền của virus là nucleic acid: DNA hoặc RNA. Vì vậy, có thể phân virus thành hai loại: loại mang DNA và loại mang RNA. Vị trí cos (cos site) hay đầu cos (cos end). Trình tự nucleotide được cắt ra để tạo thành các phần mở rộng sợi đơn, kết dính ở hai đầu cuối của các phân tử DNA mạch thẳng của một phage nào đó (ví dụ: phage λ). Vòng cặp tóc (hairpin loop). Vùng chuỗi đơn bổ sung tạo nếp gấp chứa các cặp base tạo thành xoắn kép, được dùng làm mồi (primer) cho quá trình tổng hợp sợi cDNA thứ hai. Vùng cùng hướng (downtream). Đề cập đến vị trí của một đoạn trình tự nào đó nằm ở phía đầu 3’ của gen hoặc một đoạn gen quan tâm. Vùng liên kết ribosome (ribosome binding sites, RBS). Là trình tự nuleotide trên phân tử mRNA giúp cho nó bám vào ribosome trong quá trình dịch mã (xem trình tự Shine-Dalgarno). Vùng ngược hướng (upstream region). Vị trí của một trình tự nucleotide nào đó nằm ở phía đầu 5’ của phân tử DNA so với gen quan tâm. Vùng tạo dòng (multiple cloning sites, MCS) hay vùng đa nối (polylinker hay polycloning sites). Đoạn DNA ngắn trong một vector thế hệ thứ ba (ví dụ: các nhóm pUC, pGEM, pBluescript…) có chứa các vị trí nhận biết cho một số enzyme cắt hạn chế thông dụng, được thiết kế để chèn đoạn DNA ngoại lai vào đây. Western blot. Kỹ thuật chuyển protein tổng số đã được phân tách bằng điện di SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) lên màng nylon hoặc nitrocellulose để lai với kháng thể một đặc hiệu và sau đó là kháng thể hai có đánh dấu enzyme nhằm phát hiện protein kháng nguyên tương ứng của nó. YAC (Yeast artificial chromosome). Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men, được dùng làm vector để tạo dòng những đoạn DNA có kích thước rất lớn trong nấm men. Tài liệu tham khảo/đọc thêm 1. Ban Từ điển-NXB Khoa học và Kỹ thuật. 2002. Từ điển Bách khoa Sinh học. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 2. Lawrence E. 1995. Henderson’s Dictionary of Biological Terms. 7 th ed. Longman Group Ltd. Singapore. 3. Nill K. 2002. Glossary of Biotechnology Term. 3 rd ed. CRC Press LLC, USA. 4. Old RW and Primrose SB. 1994. Principles of Gene Manipulation. Blackwell Scientific Publications, Osney Mead, Oxford, UK. 5. Singleton P and Sainsbury D. 2001. Dictionary of Microbiology and Molecular Biology. 3 rd ed. John Wiley & Sons, Ltd. UK. Chương 1 Các enzyme dùng trong tạo dòng phân tử I. Các enzyme hạn chế Các enzyme hạn chế được phân lập từ các sinh vật prokaryote, có khả năng phân hủy DNA của bacteriophage để hạn chế khả năng sinh trưởng của chúng ở trong vi khuẩn. Hiện nay, người ta đã tìm thấy hơn 900 enzyme hạn chế khác nhau từ khoảng 250 chủng vi sinh vật. Các enzyme hạn chế có ba loại (type): I, II và III. Các enzyme được dùng phổ biến hiện nay thuộc type II, có cơ chế tác động đơn giản nhất. Đây là các nuclease cắt ở một vị trí đặc hiệu nằm bên trong sợi DNA (chứ không phân hủy DNA từ hai đầu), nên được gọi là endonuclease. Tên gọi đầy đủ của chúng là các restriction endonuclease type II, hay được gọi đơn giản là enzyme hạn chế (restriction enzyme, RE). 1. Các enzyme hạn chế type II Cách gọi tên các enzyme hạn chế dựa trên các qui ước quốc tế. Tên chi và tên loài của sinh vật, mà ở đó tìm thấy enzyme, được dùng để đặt cho phần đầu của tên enzyme (viết nghiêng) bao gồm: chữ thứ nhất của tên chi và hai chữ đầu của tên loài. Ví dụ: enzyme được tách chiết từ vi khuẩn Escherichia coli thì có tên là Eco, còn enzyme được tách chiết từ vi khuẩn Bacillus globigii thì viết là Bgl… Ngoài ra, tên gọi enzyme hạn chế còn được bổ sung thêm phần sau (viết thẳng), tùy thuộc vào chủng vi khuẩn liên quan và tùy thuộc vào sự có mặt hay không của các yếu tố ngoài nhiễm sắc thể. Ví dụ: RI trong enzyme EcoRI có nghĩa như sau: R là viết tắt của chủng RY13, I là bậc xác định đầu tiên trong vi khuẩn (first identified order in bacterium). Giá trị của enzyme hạn chế là ở tính đặc hiệu của chúng. Các enzyme này cắt DNA ở các vị trí nhận biết riêng biệt bao gồm từ 4-6 cặp nucleotide có trình tự đối xứng đảo ngược nhau, các đoạn ngắn này gọi là palindrome (đoạn đối xứng: là đoạn DNA có hai sợi hoàn toàn đối xứng giống hệt nhau nếu lật ngược đầu đuôi). Ví dụ: enzyme EcoRI nhận biết chuỗi hexanucleotide (6 nucleotide): Giống như EcoRI, nhiều enzyme hạn chế đã tạo ra các đoạn DNA với đầu lồi (protruding) 5’. Một số enzyme hạn chế khác (ví dụ: PstI) tạo ra các đoạn DNA có đầu lồi 5’. Trong khi đó, một số enzyme hạn chế (ví dụ: SmaI) lại cắt ở trục đối xứng để tạo ra các đoạn DNA mang đầu bằng (DNA mạch đôi có hai đầu sợi đơn bằng nhau) (Bảng 1.1). Bảng 1.1. Trình tự nhận biết của một số enzyme hạn chế tiêu biểu Với bốn loại nitrogen base trong phân tử DNA và giả thiết rằng trình tự sắp xếp của chúng là ngẫu nhiên, thì tần số mong đợi (kỳ vọng) của bất kỳ đoạn trình tự xác định nào, theo tính toán sẽ là 4 n , n ở đây là chiều dài của đoạn nhận biết. Từ đó, có thể thấy rằng với các đoạn có bốn nucleotide thì cứ cách 256 cặp base chúng lặp lại một lần, các đoạn sáu nucleotide thì cách 4096 cặp base mới lặp lại. Tất nhiên, các giá trị này có thể dao động rất lớn, nhưng nói chung chiều dài của các đoạn sinh ra đều gần với các giá trị tính toán. Chẳng hạn, một enzyme nhận biết đoạn trình tự bốn nucleotide sẽ sản sinh ra các đoạn ngắn hơn so với đoạn sáu nucleotide. 2. Gắn các đầu tận cùng được cắt bởi enzyme hạn chế - Các đầu dính (cohesive ends) , còn gọi là đầu lồi hay đầu so le. Ví dụ: đầu dính được tạo ra nhờ PstI - Các đầu bằng (blunt ends) , còn gọi là đầu thô Ví dụ: đầu bằng được tạo ra nhờ HaeIII - Dùng enzyme DNA ligase của phage T4 có thể gắn lại các đầu dính hoặc đầu bằng. Tuy nhiên, trường hợp đầu bằng thường cho hiệu quả thấp vì thế người ta có thể dùng các biện pháp khác như: + Gắn vào đầu bằng một đoạn bổ sung để tạo ra đầu dính. Ví dụ: gắn đoạn linker (đoạn nối) bằng cách tổng hợp những trình tự oligonucleotide nhân tạo có từ 10-20 nucleotide để làm linker như sau: 5' NN GAATTC NN 3' 3' NN CTTAAG NN 5' + Dùng terminal transferase. Enzyme này sẽ tạo ở đầu 3’ của DNA sợi đôi một homopolymer (xem chương 6). 3. Isochizomer Nói chung, các RE khác nhau nhận biết các trình tự khác nhau (Bảng 1.1), tuy nhiên cũng có một số trường hợp cho thấy có những enzyme được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau nhưng lại cắt trong một trình tự, các enzyme đó được gọi là isochizomer. Hơn nữa, một vài enzyme nhận biết các chuỗi tetranucleotide (4 nucleotide) mà trong một số trường hợp các tetranucleotide này lại xuất hiện trong các chuỗi hexanucleotide của các enzyme khác. Ví dụ: - MboI và Sau3AI cùng nhận biết trình tự: - Trong khi đó BamHI nhận biết trình tự: Trong một vài trường hợp khác các đoạn được tạo ra nhờ một enzyme hạn chế này khi gắn với các đoạn được tạo ra nhờ một enzyme hạn chế khác đã hình thành các thể lai (hybrid) mà các enzyme bố mẹ không thể nhận biết được. Ví dụ: SalI cắt trình tự (GTCGAC) và XhoI cắt trình tự (CTCGAG), các trình tự được sinh ra này đã gắn với nhau tạo thành thể lai mà các vị trí cắt hạn chế của chúng không thể nhận biết bởi các enzyme SalI và XhoI: 4. Methyl hóa Sự methyl hóa (methylation) nhằm mục đích bảo vệ DNA của các đoạn palindrome, nghĩa là gắn gốc methyl (CH 3 ) ở vị trí cần thiết nên không bị RE cắt. Ví dụ: EcoRI nhận biết chuỗi: Khi có sự methyl hóa thì enzyme không nhận biết được vị trí cắt hạn chế và do đó DNA không bị cắt, những DNA của phage không có gắn gốc methyl sẽ bị cắt bởi RE. Trong kỹ thuật gen, enzyme methyl hóa được gọi là methylase enzyme. Methylase được dùng để bảo vệ đoạn DNA cần gắn vào. Tất cả các chủng E. coli đều chứa hai enzyme methyl hóa DNA là: dam và dcm. . hexanucleotide (6 nucleotide): Giống như EcoRI, nhiều enzyme hạn chế đã tạo ra các đoạn DNA với đầu lồi (protruding) 5’. Một số enzyme hạn chế khác (ví dụ: PstI) tạo ra các đoạn DNA có đầu lồi 5’. Trong. đoạn DNA mang đầu bằng (DNA mạch đôi có hai đầu sợi đơn bằng nhau) (Bảng 1.1). Bảng 1.1. Trình tự nhận biết của một số enzyme hạn chế tiêu biểu Với bốn loại nitrogen base trong phân tử DNA. đó DNA không bị cắt, những DNA của phage không có gắn gốc methyl sẽ bị cắt bởi RE. Trong kỹ thuật gen, enzyme methyl hóa được gọi là methylase enzyme. Methylase được dùng để bảo vệ đoạn DNA