2.1. Chuẩn bị dung dịch master mix và cho vào eppendorf tube (E-tube) loại 0,5 mL, trộn đều các thành phần sau: Đ ệ m 10× PCR 4,5 L Hỗn hợp 4 dNTP (2,5 mM mỗi loại) 4 L Primer - F (10 pmol/ L ) 2,5 L Primer - R (10 pmol/ L ) 2,5 L Thêm H 2 O tới 40 L 2.2. Chuẩn bị dung dịch pha loãng của Taq pol: Đệm × 10 2 L Taq pol (5 unit s / L) 1 L Thêm H 2 O tới 20 L Hình 3.6. Sơ đồ kỹ thuật PCR đảo ngược 2.3. Bổ sung 5 L DNA khuôn mẫu (100 ng) vào 40 L dung dịch của master mix tube. 2.4. Bổ sung 2 L/1 tube dung dịch pha loãng của Taq pol. 2.5. Đặt E-tube đựng dung dịch phản ứng vào heating block của máy PCR để thực hiện chế độ nhiệt theo chu kỳ như sau: - Start program - 95 o C/5 phút - Thực hiện 30 chu kỳ: 95 o C/30 giây, 50 o C/30 giây và 72 o C/1 phút - 72 o C/10 phút - Giữ sản phẩm PCR ở 4 o C - Chạy điện di để kiểm tra kết qủa PCR (Hình 3.7) - Nếu chưa chạy điện di thì bảo quản sản phẩm PCR ở -20 o C Chú ý - Các thành phần và điều kiện của phản ứng như: Độ dài của primer, chế độ nhiệt trong một chu kỳ, số chu kỳ đối với mỗi đối tượng có thể thay đổi ít nhiều bằng thực nghiệm. Các thông số trên chỉ có ý nghĩa tham khảo. - Nếu làm nhiều mẫu, có thể trộn chung các thành phần khác trừ DNA và Taq pol, sau đó chia ra từng tube rồi cho DNA và Taq pol vào sau cùng. - Thao tác trong tủ cấy vô trùng (hoặc không). Hình 3.7. Điện di các sản phẩm PCR. SM: Chuẩn kích thước DNA. Các đường số 1, 2, 3, 4 và 5: Các sản phẩm PCR khác nhau. III. Tối ưu hóa các điều kiện cho PCR 1. Trình tự của primer Đối với genome của eukaryote người ta thường dùng các primer dài khoảng 18 nucleotide trở lên. Tuy nhiên, cũng tùy từng trường hợp, có những primer của các chỉ thị phân tử ngẫu nhiên như RAPD 1 rất ngắn (10-16 mer) hoặc STS 2 cần primer dài hơn (20-24 mer). Nói chung, genomic DNA không hoàn toàn là một trình tự ngẫu nhiên mà nó còn mang đặc tính của các họ gen, những nhân tố có tính lặp lại (sự lặp đoạn đơn giản hay phức tạp). Tùy theo loài sinh vật và tùy theo cách thể hiện của trình tự DNA khuôn mẫu, người ta sẽ thiết kế trình tự của primer và đối chiếu cẩn thận nó với số liệu lưu trữ trước đây nhằm loại trừ các sai sót về kỹ thuật. Gần đây, người ta thường sử dụng phần mềm trong computer để thiết kế các primer thích hợp cho từng mục tiêu nghiên cứu và có thể giúp loại bỏ các cặp primer được thiết kế không tối ưu. Khi thiết kế primer cần chú ý một số điểm như sau: Cố gắng chọn trình tự primer có khoảng 50% GC. Tránh G và C ở đầu 3’ của primer vì nó có thể làm tăng cơ hội tạo ra hiện tượng primer-dimers (hai primer bắt cặp với nhau). Tránh chọn các vùng có trình tự tương đồng để hạn chế các primer tự gắn với nhau. Tính toán nhiệt độ nóng chảy (T m ) của primer với tổng số 4 o C cho GC và 2 o C cho AT, sau đó trừ đi 5 o C từ giá trị này và đây chính là nhiệt độ ủ (T a ) của primer. Nói chung, nhiệt độ ủ có giá trị thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của primer. Sự khác nhau từ 4-6 o C giữa T m primer và T a dường như không ảnh hưởng đến hiệu suất của PCR. 2. Nhiệt độ của quá trình ủ Nhiệt độ ủ thích hợp là nhiệt độ sao cho ở đó đó 1/2 số primer sẽ gắn với DNA khuôn mẫu. Công thức dưới đây ứng dụng trong trường hợp primer có khoảng 20 oligonucleotide: T a = 4 (G + C) + 2 (A + T) – 5 o C (1) Tuy nhiên, công thức này chỉ có tính tương đối, bằng kinh nghiệm nghiên cứu chúng ta mới có thể có số liệu đúng về nhiệt độ cho quá trình ủ. Số base của primer càng ít thì nhiệt độ này càng thấp và ngược lại. 3. Magnesium Nồng độ của Mg 2+ (được cung cấp dưới dạng MgCl 2 ) có thể ảnh hưởng đến nhiệt độ biến tính DNA khuôn mẫu, quá trình ủ của primer, tính đặc hiệu của sản phẩm PCR, hoạt tính của Taq pol và độ chính xác của kết quả. Nồng độ thích hợp của Mg 2+ là từ 0,5-2,5 mM ứng với nồng độ dNTP tổng số đã cho. Nồng độ Mg 2+ cao sẽ làm cho phân tử DNA sợi đôi ổn định hơn và ngăn ngừa được sự biến chất hoàn toàn (mở xoắn để giải phóng sợi đơn của sản phẩm PCR trong mỗi chu kỳ) làm cho kết quả PCR nghèo đi. Mặt khác, nó còn làm cho hiện tượng bắt cặp giả (tại những vị trí không tương đồng) ổn định hơn dẫn đến xuất hiện những sản phẩm PCR không đặc hiệu với số lượng khá lớn. Ngược lại, nếu nồng độ Mg 2+ quá thấp sẽ ảnh hưởng xấu đến quá trình tổng hợp DNA (Mg 2+ đóng vai trò là một co- factor của Taq pol). Do đó, cần phải xác định nồng độ tối ưu của Mg 2+ nhằm đảm bảo hiệu suất khuếch đại và tính đặc hiệu của sản phẩm PCR. 4. Các deoxyribonucleotide triphosphate (dNTPs) Dung dịch stock của các dNTP phải có pH 7, nồng độ thường dùng là 10 mM (2,5 mM mỗi loại) được bảo quản ở -20 o C. Hàm lượng của các dNTP trong khoảng 20-200 M cho kết quả ổn định, chính xác và đặc hiệu. Bốn loại dNTP được sử dụng cần có nồng độ tương đương nhau để giảm thiểu tối đa hiện tượng sai biệt do kết hợp sai (misincorporation) mã di truyền nào đó. 5. Enzyme Taq pol Nồng độ Taq pol thích hợp là từ 1-2,5 unit cho 100 L dung dịch phản ứng. Thông thường có thể sử dụng 0,5 unit/25 L. Nếu nồng độ Taq pol quá cao, có thể xuất hiện các sản phẩm PCR không đặc hiệu và làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq pol quá thấp, sẽ không đủ lượng enzyme để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR mong muốn. 6. Đệm ổn định hoạt động của Taq pol Những chất ổn định Taq pol được sử dụng là gelatin và Triston X-100 trong đệm bảo quản enzyme. Nồng độ thường dùng là 0,01% gelatin và 0,1% (v/v) Triston X-100. 7. Nồng độ các primer Trong hầu hết các ứng dụng của PCR, hai primer F và R đều phải có nồng độ bằng nhau. Nồng độ cuối cùng của mỗi primer là 0,1 M, tương đương với 2,5 pmol (16,25 ng của 20-mer) trong 25 L dung dịch phản ứng. Sử dụng nồng độ primer cao không cần thiết và thường tạo ra bất lợi, vì quá thừa primer sẽ có hiện tượng primer-dimers và hiện tượng gắn primer nhầm vị trí trên khuôn mẫu. 8. Nồng độ DNA khuôn mẫu PCR bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn sàng lọc và giai đoạn khuếch đại. Nếu các chất trong thành phần phản ứng (bao gồm primer) có nồng độ cao trong khi DNA khuôn mẫu lại có nồng độ thấp thì giai đoạn sàng lọc của PCR sẽ trở nên khó khăn hơn, vì tần suất để primer và DNA khuôn mẫu gặp nhau giảm rõ rệt, trong khi sự tiếp xúc giữa primer và primer lại tăng lên gây ra hiện tương primer-dimers trong giai đoạn khuếch đại. Thông thường, nồng độ DNA khuôn mẫu được sử dụng trong khoảng từ 10-100 ng/25 L dung dịch phản ứng. 9. Tỷ lệ giữa primer và DNA khuôn mẫu Một trong những yếu tố quan trọng nhất của PCR là tỷ lệ tối ưu giữa primer và DNA khuôn mẫu. Nếu tỷ lệ này quá cao thì hiện tượng primer-dimers sẽ xuất hiện, giống như trường hợp mẫu DNA quá loãng. Nếu tỷ lệ này quá thấp kết quả sản phẩm PCR sẽ không nhiều. Trong hầu hết các trường hợp áp dụng PCR, người ta đều dùng nồng độ primer không quá 0,5 M (12,5 pmol/25 L) và tính toán nồng độ DNA khuôn mẫu để tránh hiện tượng primer-dimers. 10. Khởi động nóng PCR Khởi động nóng PCR (“host-start” PCR) là phương pháp sản xuất các sản phẩm PCR sạch hơn. DNA khuôn mẫu và primer được trộn với nhau và giữ ở nhiệt độ trên ngưỡng của liên kết không đặc hiệu giữa primer và khuôn mẫu. Tất cả các thành phần của PCR được bổ sung trước ngoại trừ một chất then chốt (thường là Taq pol). Chỉ trước khi đi vào chu kỳ khuếch đại, thành phần chưa có mới được bổ sung để cho phép phản ứng xảy ra ở nhiệt độ cao hơn. Do không có hiện tượng lai không đặc hiệu của primer với khuôn mẫu, nên các băng DNA được khuếch đại trở nên sáng hơn, các đoạn primer . trừ DNA và Taq pol, sau đó chia ra từng tube rồi cho DNA và Taq pol vào sau cùng. - Thao tác trong tủ cấy vô trùng (hoặc không). Hình 3.7. Điện di các sản phẩm PCR. SM: Chuẩn kích thước DNA. . primer sẽ gắn với DNA khuôn mẫu. Công thức dưới đây ứng dụng trong trường hợp primer có khoảng 20 oligonucleotide: T a = 4 (G + C) + 2 (A + T) – 5 o C (1) Tuy nhiên, công thức này chỉ có. 8. Nồng độ DNA khuôn mẫu PCR bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn sàng lọc và giai đoạn khuếch đại. Nếu các chất trong thành phần phản ứng (bao gồm primer) có nồng độ cao trong khi DNA khuôn mẫu