Hộp Điện Trong Công Nghệ DNA part 24 pptx

Hình 4.16. Tạo dòng trong BAC vector - BAC vector được cắt bằng enzyme hạn chế HindIII (có vị trí nhận biết nằm trên gen lacZ), sau đó hai đầu HindIII của vector được dephosphoryl hóa bằng phosphatase để ngăn cản sự tái tạo lại vòng. - DNA có khối lượng phân tử cao được bọc trong agarose và sau đó phân đoạn cũng bằng HindIII như trường hợp vector. - Gắn vector và các đoạn DNA có kích thước >150 kb bằng enzyme T4 DNA ligase, sau đó biến nạp vào E. coli bằng xung điện. - Chọn lọc thể tái tổ hợp trên môi trường nuôi cấy có bổ sung CM và IPTG. Các khuẩn lạc có màu trắng là khuẩn lạc mang thể tái tổ hợp, còn các khuẩn lạc có màu xanh là khuẩn lạc không mang thể tái tổ hợp. VI. YAC vector 1. Đặc điểm của YAC Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men (yeast artificial chromosome-YAC) là các vector tạo dòng mạch thẳng dựa trên cấu trúc nhiễm sắc thể tự nhiên của nấm men. Chúng có thể được cắt thành hai đoạn hoặc hai nhánh nhiễm sắc thể để nhận các đoạn rất lớn có kích thước lên đến 2.000 kb. Cấu trúc của YAC sau đó có thể đưa vào các tế bào nấm men có thành tế bào đã bị loại bỏ (spheroplast), ở đó chúng được duy trì ổn định như các nhiễm sắc thể tự trị (autonomous). Thư viện YAC được lắp ráp và sử dụng cho việc lập bản đồ các vùng có kích thước lớn của DNA người. Do kích thước lớn của chúng cho nên kỹ thuật phân tích thích hợp hơn cả là điện di gel trường gián đoạn (pulsed field gel electrophoresis-PFGE). Nhược điểm của YAC là hiệu suất tạo dòng của một vài hệ thống tương đối thấp, sự xuất hiện các dòng khảm (các tế bào biến nạp chứa hai mẫu DNA không liền kề nhau), sự không ổn định của đoạn chèn và thao tác chúng tương đối khó khăn so với các hệ thống vi khuẩn. Trước năm 1987, các hệ thống tạo dòng thích hợp chủ yếu dựa trên E. coli và chỉ có thể nhận các đoạn DNA tương đối nhỏ. Các vector vi khuẩn có khả năng lớn nhất cũng chỉ có thể nhận các đoạn DNA trong phạm vi kích thước từ 35-45 kb. Tuy nhiên, các YAC vector có thể tạo dòng các đoạn DNA có kích thước từ 100- 2.000 kb. Sau này, người ta cũng đã phát triển các vector vi khuẩn mới có khả năng tạo dòng các đoạn DNA lớn hơn, nhưng cho đến nay vẫn chưa thể đạt được khả năng như các YAC. Khả năng rất lớn này của YAC đã được khai thác để xây dựng các bản đồ vật lý thế hệ thứ nhất và thứ hai của genome người. Bảng 4.1. So sánh một số đặc điểm của các vector tạo dòng 2. Tạo dòng trong YAC Vector YAC được sử dụng rộng rãi nhất để xây dựng các thư viện YAC là pYAC4 (Hình 4.17). Cắt plasmid mạch vòng dài 11 kb bằng enzyme hạn chế BamHI tạo thành một phân tử mạch thẳng có các trình tự telomere (TEL) ở cả hai đầu. Đoạn nằm giữa hai vị trí chứa gen his3 là đoạn “stuffer” dài 1,8 kb đã được loại bỏ. Vị trí tạo dòng để chèn đoạn DNA ngoại lai là EcoRI. Đây là vị trí cắt phân tử mạch thẳng thành hai nhánh của YAC, nhánh phải là một đoạn dài 3,4 kb và nhánh trái dài 6 kb chứa các nhân tố CEN4 và ARS1. Vị trí EcoRI nằm trong gen sup4. Sản phẩm của gen này là một tRNA đột biến ức chế sự đột biến ochre (nonsense) trong gen ade2. Khi một đoạn DNA được tạo dòng trong gen sup4 thì sự ức chế bị đào thải và quá trình chuyển hóa adenine bị gián đoạn, dẫn đến tích lũy tiền chất trao đổi có màu đỏ (phosphoribosyl-aminoimidazole) cho ra các dòng tái tổ hợp màu đỏ để phân biệt. Hình 4.17. Vector pYAC4. Vị trí tạo dòng EcoRI ở trong gen sup4. trp1 và ura3 là các marker chọn lọc ở nhánh trái và phải của YAC tương ứng. TEL là hai trình tự telomere và CEN4 cung cấp chức năng phần tâm. Hai marker chọn lọc của nấm men, trp1 và ura3 ở các nhánh trái và phải tương ứng, mã hóa các enzyme cho phép các tế bào nấm men mang YAC để sản xuất tryptophan và uracil ở điều kiện de novo. Dòng nấm men vật chủ S. cerevisiae AB 1380 (MATaψ+, ura3, trp1, ade2-1, can1-100, lys2-1, his5) không có khả năng này, và sinh trưởng của nấm men này trong môi trường thiếu các chất chuyển hóa như thế cho phép chọn lọc dương tính đối với các phân tử tái tổ hợp chứa cả hai nhánh của YAC. Tài liệu tham khảo/đọc thêm 1. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K. 2002. Short Protocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5 th ed. John Wiley & Sons, Inc. USA. 2. Glick BR and Pasternak JJ. 2003. Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. 3 rd ed. ASM Press. USA. . - DNA có khối lượng phân tử cao được bọc trong agarose và sau đó phân đoạn cũng bằng HindIII như trường hợp vector. - Gắn vector và các đoạn DNA có kích thước >150 kb bằng enzyme T4 DNA. đoạn DNA tương đối nhỏ. Các vector vi khuẩn có khả năng lớn nhất cũng chỉ có thể nhận các đoạn DNA trong phạm vi kích thước từ 35-45 kb. Tuy nhiên, các YAC vector có thể tạo dòng các đoạn DNA. và ARS1. Vị trí EcoRI nằm trong gen sup4. Sản phẩm của gen này là một tRNA đột biến ức chế sự đột biến ochre (nonsense) trong gen ade2. Khi một đoạn DNA được tạo dòng trong gen sup4 thì sự ức