1.1.4. Bổ sung 35 L TEMED vào mỗi 100 mL dung dịch tạo polyacrylamide gel, trộn hỗn hợp bằng cách vortex. Rót dung dịch tạo gel vào giữa hai tấm kính. Gắn nhanh lược vào, tránh bọt khí ở răng lược (giếng). Đỉnh của răng lược phải hơi cao hơn mép gel. Nếu cần, bổ sung thêm một ít dung dịch tạo gel để làm đầy mép gel. Bảng 2.4. Dung tích của các chất dùng cho polyacrylamide gel 1.1.5. Cho phép acrylamide polymer hóa trong khoảng 60 phút ở nhiệt độ phòng, bổ sung thêm dung dịch tạo gel nếu thấy gel co vào nhiều. 1.1.6. Sau khi polymer hóa hoàn toàn, rút lược cẩn thận, tháo băng dính ra khỏi đáy khuôn gel. Gắn khuôn gel vào buồng điện di và làm đầy buồng điện di bằng đệm 1× TBE, dùng Pasteur pipette để phá các bọt khí ra khỏi đáy gel và các giếng bằng đệm 1× TBE. 1.1.7. Trộn các mẫu DNA với một lượng thích hợp của đệm 6× gel-loading dye. Đặt mẫu vào trong giếng bằng micropipette hoặc Hamilton syringe. 1.8. Nối buồng điện di với bộ nguồn. Polyacrylamide gel không biến tính thường chạy điện di trong khoảng 1 V/cm đến 8 V/cm. Chạy gel cho đến khi thuốc nhuộm chỉ thị dịch chuyển đến vị trí mong muốn. Tắt nguồn, lấy khuôn gel ra và đặt lên bàn. Tháo tấm kính nhỏ ở mặt trước ra, tấm kính lớn ở phía sau được dùng làm giá đỡ, và chuẩn bị nhuộm gel. 1.2. Phát hiện DNA trong polyacrylamide gel 1.2.1. Nhuộm bằng ethidium bromide Polyacrylamide có thể làm mất huỳnh quang của EtBr, do đó không thể phát hiện các băng DNA bằng phương pháp này nếu hàm lượng của nó thấp hơn 10 ng. Ngâm nhẹ gel cùng với tấm kính đỡ vào trong dung dịch nhuộm (0,5 g/mL EtBr trong 1 TBE). Cho vừa đủ dung dịch nhuộm phủ hoàn toàn lên bề mặt gel. Sau khi nhuộm 30-45 phút ở nhiệt độ phòng, lấy gel và tấm kính đỡ ra, cẩn thận thấm khô bề mặt gel bằng giấy thấm Kimwipe. Phủ lên bề mặt gel bằng giấy nylon (Saran wrap), tránh tạo ra bọt khí hoặc nếp gấp của Saran wrap. Sau đó lật ngược gel và đặt nó trên máy soi tử ngoại ultraviolet transilluminator (Gel Documentation System), lấy tấm kính đỡ ra để tiến hành chụp ảnh. 1.2.2. Nhuộm bằng thuốc nhuộm bạc Thuốc nhuộm bạc được sử dụng từ những năm 1980, cho phép phát hiện một lượng protein rất nhỏ ở dạng vết trong polyacrylamide gel. Sau đó, loại thuốc nhuộm này được hoàn thiện và mở rộng phạm vi ứng dụng cho các phân tử nucleic acid. Hai phương pháp nhuộm bạc thường được sử dụng là: 1) Dùng các dung dịch diamine silver hoặc ammonical silver cho thấm vào gel và pha loãng các dung dịch acid của formaldehyde để phát triển hình ảnh. 2) Thấm dung dịch silver nitrate vào gel trong môi trường acid yếu và dùng formaldehyde khử có chọn lọc các ion bạc thành bạc kim loại dưới điều kiện kiềm. Nhìn chung, phương pháp diamine kiềm kém nhạy hơn nhưng thích hợp đối với các gel dày, trong khi phương pháp acid nhanh và bắt màu tốt hơn đối với các gel mỏng. Thuốc nhuộm bạc được sử dụng hiệu quả để phát hiện một lượng nhỏ (picogram, pg) nucleic acid. Giới hạn phát hiện DNA sợi đôi khi quan sát bằng mắt thường là vào khoảng 1 pg/mm 2 mặt cắt ngang của băng DNA, nhạy gấp 1.000- 10.000 lần phương pháp nhuộm bằng EtBr. Mức độ phát hiện này có thể so sánh với phương pháp đánh dấu đồng vị phóng xạ hoặc huỳnh quang. Quá trình nhuộm bao gồm các bước sau: - Cố định nucleic acid trong acetic acid 7,5% tối thiểu 5 phút để ngăn cản sự khuếch tán của các phân tử nucleic acid đã được phân tách trong gel, loại bỏ và trung hòa các hóa chất không mong muốn (urea và đệm). - Rửa gel trong nước khử ion tối thiểu 2 phút để loại bỏ acetic acid, các chất bẩn dạng vết và phần thừa của các thành phần gel hòa tan sau khi cố định. - Nhuộm gel trong dung dịch bạc với sự có mặt của formaldehyde để cải thiện độ nhạy và độ tương phản. Thời gian nhuộm tối ưu khoảng 20 phút. Tuy nhiên, đối với loại gel có tấm đỡ polyester (8×10 cm) thì chỉ cần 10 phút là đủ để có chất lượng hình ảnh cao mà không làm giảm độ nhạy. - Rửa gel sau khi nhuộm bạc để loại bỏ thuốc nhuộm thừa có thể gây ra kết tủa màu nâu trong quá trình phát triển màu. Thông thường, có thể dùng dung dịch phát triển màu để rửa gel. - Phát triển màu của gel bằng hỗn hợp dung dịch sodium carbonate (4 g/L), sodium thiosulfate (4 M) và formaldehyde (khoảng 0,028-0,111%) để giảm các background không đặc hiệu một cách hiệu quả. Nhiệt độ rửa thích hợp từ 8-10 o C, thời gian rửa thay đổi tùy thuộc vào thành phần của dung dịch phát triển màu trong khoảng từ vài giây đến vài phút. - Dừng phản ứng phát triển màu khi thu được hình ảnh tối ưu càng nhanh càng tốt bằng cách dùng acetic acid lạnh (4 o C) 7,5%. 1.2.3. Phóng xạ tự ghi + Không cố định, làm ẩm gel Nếu muốn thu hồi băng DNA có hoạt tính phóng xạ từ gel thì gel phải được cố định hoặc làm khô. Nếu chỉ muốn quan sát kết quả điện di thì có thể tiến hành nhanh như sau: - Gói bản gel cùng với tấm kính đỡ trong giấy nylon Saran wrap. Tránh tạo bọt khí hoặc nếp gấp của Saran wrap. Đánh dấu bằng mực phóng xạ lên bề mặt Saran wrap. - Lật ngược gel và ủ với phim X-quang (tiến hành trong phòng tối) ở -70 o C trong khoảng thời gian thích hợp. + Cố định, làm khô gel Các polyacrylamide gel chứa DNA có hoạt tính phóng xạ có thể được cố định và làm khô trước khi phóng xạ tự ghi. - Ngâm gel cùng với tấm kính đỡ trong acetic acid 7% trong 5 phút. Lấy gel khỏi thuốc hãm màu một cách cẩn thận bằng cách cầm nhẹ tấm kính ra khỏi chất lỏng. - Rửa nhanh gel trong nước khử ion. Dùng giấy thấm Kimwipe để thấm khô bề mặt gel (không dùng giấy thấm thường). Bọc gel và tấm kính đỡ trong Saran wrap, thiết kế phóng xạ tự ghi như trên. Một cách khác là làm khô gel trên giấy Whatman 3MM bằng cách dùng máy làm khô gel (sấy ở 80 o C trong điều kiện chân không từ 1-2 giờ). Làm khô gel cần thiết chỉ khi gel chứa DNA được đánh dấu đồng vị phát xạ yếu như 35 S hoặc một lượng nhỏ 32 P (cần phải ủ phim 24 giờ hoặc lâu hơn) (Hình 2.8). 1.3. Phân lập các đoạn DNA từ polyacrylamide gel Phương pháp tốt nhất để phân lập DNA từ polyacrylamide gel là kỹ thuật “ép và ngâm” (crush and soak) của Maxam và Gilbert (1977). DNA thu được có độ tinh sạch cao và không chứa các chất nhiễm bẩn ức chế enzyme. Mặc dù phương pháp này phải tiến hành qua nhiều bước và không hiệu quả (ít hơn 30% sản lượng các đoạn DNA >3 kb), nhưng nó có thể được dùng để phân lập cả hai loại DNA sợi đôi và sợi đơn từ các polyacrylamide gel không biến tính và biến tính, tương ứng. Phương thức sau đây được cải tiến từ kỹ thuật của Maxam và Gilbert (1977): - Chạy điện di polyacrylamide gel. Xác định vị trí của DNA quan tâm bằng phóng xạ tự ghi hoặc bằng EtBr quan sát dưới ánh sáng UV. - Dùng dao cắt mảnh gel chứa băng DNA quan tâm. Không loại bỏ Saran wrap khỏi gel trước khi cắt, cắt cả gel lẫn Saran wrap, sau đó bóc mảnh gel nhỏ có chứa DNA quan tâm ra khỏi Saran wrap. - Chuyển mảnh gel vào trong E-tube (eppendorf tube), dùng tip của micropipette để ép mảnh gel theo thành của tube. - Tính toán thể tích thích hợp của mảnh gel và bổ sung 1-2 thể tích của đệm chiết (0,5 M ammonium acetate, 10 mM magnesium acetate, 1 mM EDTA pH 8 và 0,1% SDS) vào E-tube. - Đóng tube và ủ ở 37 o C kèm theo lắc vòng nhẹ. Đoạn DNA nhỏ (<500 bp) được dung ly trong khoảng 3-4 giờ, đoạn lớn hơn mất khoảng 12-16 giờ. - Ly tâm 12.000 g trong 1 phút ở 4 o C. Chuyển thể nổi vào E-tube sạch. - Bổ sung thêm 0,5 thể tích đệm chiết vào E-tube cũ có mảnh polyacrylamide gel, vortex nhanh và ly tâm. Trộn hai thể nổi lại với nhau. - Bổ sung hai thể tích ethanol ở 4 o C, bảo quản dung dịch trên đá tuyết 30 phút. Thu hồi DNA bằng cách ly tâm 12.000 g trong 10 phút ở 4 o C. - Hòa tan trở lại DNA trong 200 L đệm TE (pH 7,6) và bổ sung 25 L của 3 M sodium acetate (pH 5,2) và kết tủa DNA với hai thể tích ethanol như bước trên. - Rửa cẩn thận tiểu thể với ethanol 70% và hòa tan trở lại DNA trong đệm TE (pH 7,6) tới thể tích cuối cùng là 10 L. - Kiểm tra số lượng và chất lượng của đoạn DNA bằng điện di polyacrylamide gel. Lấy một thể tích nhỏ tối thiểu (được ước lượng khoảng 50 ng DNA) trộn với 10 L TE (pH 7,6), bổ sung thêm 2 L gel-loading dye. Nạp mẫu và chạy điện di polyacrylamide gel ở nồng độ thích hợp bằng cách dùng các DNA marker chuẩn đã biết số lượng. Các đoạn DNA phân lập sẽ cùng dịch chuyển với DNA marker trong quá trình điện di. 2. Điện di protein 2.1. Điện di SDS-PAGE . DNA marker chuẩn đã biết số lượng. Các đoạn DNA phân lập sẽ cùng dịch chuyển với DNA marker trong quá trình điện di. 2. Điện di protein 2.1. Điện di SDS-PAGE . phút. Thu hồi DNA bằng cách ly tâm 12.000 g trong 10 phút ở 4 o C. - Hòa tan trở lại DNA trong 200 L đệm TE (pH 7,6) và bổ sung 25 L của 3 M sodium acetate (pH 5,2) và kết tủa DNA với hai thể. thể với ethanol 70% và hòa tan trở lại DNA trong đệm TE (pH 7,6) tới thể tích cuối cùng là 10 L. - Kiểm tra số lượng và chất lượng của đoạn DNA bằng điện di polyacrylamide gel. Lấy một thể