- dam (DNA adenine methylase) Enzyme methylase này gắn các nhóm methyl ở vị trí N 6 của adenine trong chuỗi 5’…G me ATC…3’ . Nhưng DNA của eukaryote không bị methyl hóa ở vị trí N 6 của adenine. - dcm (DNA cystosine methylase) Enzyme methylase này gắn các nhóm methyl ở vị trí C 5 của cytosine bên trong các chuỗi 5’…C me CAGG…3’ hoặc 5’…C me CTGG…3’ . Enzyme chủ yếu ảnh hưởng đến sự methyl hóa dcm là EcoRII, enzyme BstNI có thể nhận biết chính xác cùng một trình tự như EcoRII (mặc dù nó cắt DNA ở vị trí xác định khác trong chuỗi này). Nếu không thể thay BstNI cho EcoRII thì DNA phải được chuẩn bị từ các chủng E. coli dcm. 5. Cắt DNA bằng enzyme hạn chế 5.1. Các loại đệm dùng trong phản ứng cắt DNA Mỗi enzyme hạn chế có một điều kiện phản ứng tối ưu, nhiệt độ ủ và thành phần của dung dịch đệm là những yếu tố quan trọng. Nhiệt độ yêu cầu khá chính xác còn sự khác nhau giữa các dung dịch đệm thường là không đáng kể. Để thuận tiện trong nghiên cứu người ta chia các enzyme ra làm ba nhóm: - Nhóm đệm cao (H). Hoạt động tốt nhất ở các dung dịch đệm có hoạt độ ion cao. - Nhóm đệm trung bình (M). Thích hợp với các dung dịch đệm có hoạt độ ion trung bình. - Nhóm đệm thấp (L). Thích hợp với các dung dịch đệm có hoạt độ ion thấp. Như vậy, theo cách phân chia này chỉ có ba loại đệm stock là cần chuẩn bị cho phản ứng cắt DNA bằng RE (Bảng 1.2). Thường các đệm stock trong bảng 1.2 được pha ở nồng độ ( ´ 10), và có thể giữ ở nhiệt độ 4 o C/1-2 tuần hoặc - 20 o C/không hạn định. Bảng 1.2. Các loại dung dịch đệm cho phản ứng cắt DNA bằng RE Chú ý Riêng enzyme SmaI không thể sử dụng các loại đệm ở trên mà cần phải pha dung dịch đệm đặc biệt, bao gồm: 20 mM KCl, 10 mM Tris.Cl (pH 8), 10 mM MgCl 2 , và 1 mM dithiothreitol. 5.2. Phương pháp cắt DNA bằng enzyme hạn chế Các phản ứng đặc trưng dùng khoảng 0,2-1 g DNA/20 L dung dịch phản ứng hoặc ít hơn. Ví dụ: a. Pha dung dịch DNA bằng nước cất hai lần vô trùng trong eppendorf tube vô trùng tới dung tích 17 L. b. Bổ sung 2 L đệm phản ứng ( ×10) thích hợp của RE và trộn đều (vortex). Ví dụ: BstXI : Dùng đệm cao 10×(H) XbaI : 10×(H) EcoRI : 10×(H) c. Bổ sung 1 unit/L RE và lắc đều nhẹ. Một unit (đơn vị, ký hiệu là u) RE được xác định như là số lượng yêu cầu đủ để thủy phân hoàn toàn 1 g DNA plasmid/1 giờ ở dung dịch đệm và nhiệt độ thích hợp trong 20 L phản ứng. d. Ủ ở nhiệt độ thích hợp, thời gian tùy thuộc vào yêu cầu. Ví dụ: BstXI : 1-2 giờ/50 o C XbaI : 1 giờ/37 o C EcoRI : 1 giờ/37 o C e. Dừng phản ứng bằng cách bổ sung 0,5 M EDTA (pH 7,5) để đạt tới nồng độ cuối cùng là 10 mM. - Nếu DNA sau khi cắt bằng RE, được phân tích trực tiếp trên gel thì bổ sung 1 µ L ( × 10) gel-loading-dye I, trộn đều và chạy điện di. - Nếu DNA sau khi cắt bằng RE, cần được tinh sạch thì chiết một lần với phenol, một lần với phenol:chloroform (1:1), một lần với chloroform và kết tủa DNA bằng hai thể tích ethanol hoặc một thể tích isopropanol. Chú ý - Kết quả hoạt động của enzyme hạn chế phụ thuộc rất nhiều vào độ sạch của DNA. Các chế phẩm DNA còn lẫn đệm chiết, phenol hoặc EtOH sẽ làm giảm chất lượng hoạt động của enzyme. - Enzyme hạn chế được giữ ở -20 o C (hoặc -80 o C nếu bảo quản lâu dài). Nếu lấy enzyme ra khỏi tủ lạnh sâu trong một thời gian ngắn để dùng thì phải đặt trên đá tuyết (ice bath). II. Các enzyme trùng hợp 1. DNA polymerase (DNA-dependent DNA polymerase) DNA polymerase được dùng để tổng hợp DNA trong cơ thể hoặc trong điều kiện in vitro. 1.1. DNA polymerase I của E. coli Enzyme này dịch chuyển điểm đứt (nick) của DNA, nick là điểm đứt trên một sợi của DNA sợi đôi. Chức năng chính của enzyme là sửa sai dọc theo phân tử DNA. Nếu gặp chỗ sai sót, nó sẽ đi ngược lại để cắt bỏ sau đó mới tổng hợp DNA. DNA polymerase I của E. coli mang chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử (M) là 109.000 Da với ba hoạt tính riêng biệt: - Hoạt tính polymerase 5’3’ . DNA polymerase I của E. coli xúc tác cho sự tổng hợp DNA theo chiều 5’3’ bằng cách bổ sung các gốc nucleotide vào đầu tận cùng 3’-OH được tạo ra khi một sợi của phân tử DNA sợi đôi bị đứt. - Hoạt tính exonuclease 3’5’. DNA polymerase I của E. coli cắt các chuỗi nucleotide ở các đầu tự do của DNA, xúc tác cho sự thoái biến bậc thang từ đầu 3’ của cả DNA sợi đôi và sợi đơn khi không có dNTPs. Trong trường hợp có dNTPs, hoạt tính exonuclease trên sợi đôi sẽ bị ức chế bởi hoạt tính polymerase. Trong quá trình tổng hợp DNA, hoạt tính exonuclease thực hiện chức năng đọc sửa (proofreading) bằng cách cắt bỏ những nucleotide lắp ráp sai. - Hoạt tính exonuclease 5’3’. DNA polymerase I của E. coli có thể chuyển chỗ các nucleotide từ phía 5’ của điểm đứt và bổ sung tức thời các nucleotide từ phía 3’ tạo ra chuyển động của điểm đứt dọc theo DNA. - Ứng dụng chính + Đánh dấu đoạn DNA để làm mẫu dò bằng dịch chuyển điểm đứt. + Khởi đầu cho sự tổng hợp sợi thứ hai trong tạo dòng cDNA. + Xác định trình tự DNA bằng phương pháp dideoxynucleotide. 1.2. Đoạn Klenow của DNA polymerase I của E. coli Enzyme này có tác dụng lấp đầy các đầu khuyết 3’ của DNA sợi đôi. Do DNA polymerase I có ba hoạt tính, nhưng hoạt tính exonuclease 5’3’ ít sử dụng nên Klenow đã dùng protease để cắt bớt đoạn có hoạt tính đó. Vì vậy, khối lượng phân tử của enzyme chỉ còn lại 76.000 Da (được gọi là đoạn lớn của DNA polymerase I). - Ứng dụng chính + Làm đầy đầu khuyết 3’ do enzyme hạn chế tạo ra. + Đánh dấu đầu tận cùng của các đoạn DNA bằng cách dùng [ a - 32 P]dNTPs để làm đầy đầu khuyết 3’. + Đánh dấu đầu tận cùng của các phân tử DNA mang đầu lồi 3’. Đầu tiên, hoạt tính exonuclease 3’5’ loại bỏ đầu lồi 3’ để tạo ra đầu khuyết 3’. Sau đó, nhờ sự có mặt ở nồng độ cao của một tiền chất được đánh dấu đồng vị phóng xạ, sự thoái biến bậc thang được cân bằng do sự hợp nhất của các dNTP ở đầu 3’. + Tổng hợp sợi thứ hai của cDNA trong tạo dòng cDNA. + Tổng hợp DNA sợi đôi từ các khuôn mẫu sợi đơn trong phát sinh đột biến in vitro. 1.3. DNA polymerase của bacteriophage T4 (T4-infected E. coli) Enzyme này giống đoạn Klenow của DNA polymerase I của E. coli . DNA polymerase của phage T4 (M = 114.000 Da) có hoạt tính polymerase 5’3’ và exonuclease 3’5’ . Tuy nhiên, hoạt tính exonuclease của DNA polymerase phage T4 lớn hơn của DNA polymerase I đến 200 lần. Đoạn Klenow phải cần có đoạn mồi (primer) mới tổng hợp DNA được, còn DNA polymerase phage T4 thì không cần mồi cũng tổng hợp được DNA. - Ứng dụng chính + Làm đầy hoặc đánh dấu đầu khuyết 3’ do enzyme hạn chế tạo ra. . sâu trong một thời gian ngắn để dùng thì phải đặt trên đá tuyết (ice bath). II. Các enzyme trùng hợp 1. DNA polymerase (DNA- dependent DNA polymerase) DNA polymerase được dùng để tổng hợp DNA. đầu 3’. + Tổng hợp sợi thứ hai của cDNA trong tạo dòng cDNA. + Tổng hợp DNA sợi đôi từ các khuôn mẫu sợi đơn trong phát sinh đột biến in vitro. 1.3. DNA polymerase của bacteriophage T4 (T4-infected. đứt dọc theo DNA. - Ứng dụng chính + Đánh dấu đoạn DNA để làm mẫu dò bằng dịch chuyển điểm đứt. + Khởi đầu cho sự tổng hợp sợi thứ hai trong tạo dòng cDNA. + Xác định trình tự DNA bằng phương