Kết quả cho thấy, các đoạn lớn được phân tách tốt hơn ở gel 1%, trong khi các đoạn nhỏ thích hợp với gel 2%. Hình 2.3. Điện di các mẫu DNA giống nhau ở các nồng độ agarose khác nhau. A: 1%, B: 1,5% và C: 2%. 1.3. Cấu hình của DNA Các DNA dạng vòng đóng (form-I), vòng đứt (form-II) và mạch thẳng (form- III) có cùng một khối lượng phân tử sẽ dịch chuyển trên agarose gel ở các tốc độ khác nhau. Nhìn chung, DNA của các plasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA của plasmid cùng loại nhưng có dạng mạch thẳng. Hầu hết plasmid mạch vòng chứa ít nhất hai dạng DNA có cấu trúc không gian khác nhau là dạng vòng đóng (siêu xoắn) và vòng đứt. Hình 2.4 minh họa kết quả điện di với plasmid mạch vòng bên trái và plasmid cùng loại mạch thẳng ở bên phải. Hình 2.4. Điện di các plasmid có cấu hình khác nhau 1.4. Thành phần base và nhiệt độ Tập tính điện di của DNA trong agarose gel không bị ảnh hưởng rõ rệt bởi thành phần base của DNA hoặc nhiệt độ mà ở đó gel được chạy. Trong agarose gel, tính linh động điện di tương đối của các đoạn DNA có kích thước khác nhau không thay đổi trong khoảng từ 4 o C đến 30 o C. Nói chung, agarose gel thường được chạy ở nhiệt độ phòng. 2. Phương pháp điện di agarose gel 2.1. Đệm pH Một số đệm điện di thích hợp cho DNA sợi đôi thường được dùng là Tris- acetate-EDTA (TAE), Tris-borate-EDTA (TBE) và Tris-phosphate-EDTA (TPE) ở nồng độ khoảng 50 mM và pH 7,5-7,8 (Bảng 2.2). Thường do thói quen, TAE được sử dụng nhiều nhất, nhưng khả năng đệm của nó lại thấp. Đệm TBE và TPE đều có khả năng hòa tan tốt các đoạn DNA và có khả năng đệm cao hơn một cách rõ rệt. Các đoạn DNA sẽ dịch chuyển với các tốc độ hơi khác nhau một chút trong ba loại đệm trên do sự khác nhau về cường lực ion của đệm. Đệm không những thiết lập một giá trị pH, mà còn cung cấp các ion để hỗ trợ cho độ dẫn (conductivity). Nếu chúng ta dùng nước thay vì là đệm trong quá trình điện di, thì sẽ không có sự dịch chuyển cần thiết của DNA trong gel. Ngược lại, nếu sử dụng đệm nồng độ đậm đặc (ví dụ: dung dịch stock ×10), thì nhiệt độ trong gel có thể tăng cao và làm nóng chảy nó. 2.2. Chuẩn bị agarose gel Có nhiều loại agarose khác nhau thích hợp để chạy điện di, loại agarose dùng tốt nhất trong thí nghiệm là type-II-agarose có nội thẩm thấu thấp (low-endo- osmotic). Nó dễ dàng chảy ra và tạo thành một dung dịch trong suốt, kết quả là gel đàn hồi thậm chí ở các nồng độ thấp. Tuy nhiên, type-II-agarose dễ bị bẩn bởi sulphate polysaccharides (SP), hơn nữa SP còn ức chế các enzyme như ligase, polymerase và RE. Vì thế, các đoạn DNA dung ly từ những gel như thế phải được làm sạch cẩn thận trước khi chúng được dùng như là các khuôn mẫu hoặc cơ chất cho các enzyme này. Bảng 2.2. Các đệm sử dụng phổ biến trong điện di 2.3. Nhuộm DNA trong agarose gel Phương pháp quan sát DNA trong agarose gel thuận lợi nhất là dùng thuốc nhuộm huỳnh quang EtBr. EtBr được dùng để phát hiện DNA sợi đôi và RNA sợi đơn. Tuy nhiên, ái lực (affinity) của thuốc nhuộm đối với nucleic acid sợi đơn là tương đối thấp và có hiệu suất huỳnh quang không cao. Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của nucleic acid và cho phép phát hiện dễ dàng chúng ở trong gel. Thường EtBr (0,5 g/mL) được đưa vào trong agarose gel để phản ứng nhuộm xảy ra trong suốt quá trình điện di. Mặc dù tính linh động điện di của DNA sợi đôi mạch thẳng giảm khi có mặt thuốc nhuộm (khoảng 15%), nhưng khả năng xác định gel trực tiếp dưới ánh sáng UV trong suốt quá trình điện di hoặc ở giai đoạn cuối có ưu thế rõ rệt. Tuy nhiên, nếu cần có thể chạy điện di gel không có EtBr và chỉ nhuộm DNA hoặc RNA sau khi điện di xong. Gel được ngâm trong đệm điện di hoặc H 2 O chứa EtBr (0,5 g/mL)/45 phút ở nhiệt độ phòng. Chú ý Ethidium bromide là một tác nhân gây đột biến mạnh. Vì thế, luôn luôn đeo găng tay khi cầm gel hoặc dung dịch chứa thuốc nhuộm. 2.4. Thu hồi DNA từ agarose gel Nhiều phương pháp đã được xây dựng để thu hồi DNA từ agarose gel, nhưng không có phương pháp nào là hoàn toàn tối ưu. Có hai vấn đề chính: thứ nhất đa số các loại agarose đều bị nhiễm bẩn bởi sulphate polysaccharides, các sản phẩm sau đó được chiết từ gel cùng với DNA, chúng là nhân tố ức chế có hoạt tính của nhiều loại enzyme (RE, ligase, kinase, polymerase) dùng trong các bước tạo dòng tiếp theo sau; thứ hai hiệu suất chiết DNA từ agarose gel phụ thuộc vào khối lượng phân tử của nó, các đoạn DNA có chiều dài <1 kb có thể được thu hồi hoàn toàn, khi khối lượng phân tử của DNA tăng thì hiệu suất chiết giảm, các đoạn DNA có kích thước >20 kb được thu hồi kém (khoảng hơn 20% sản lượng). Có nhiều phương pháp thu hồi và tinh sạch DNA từ agarose gel, dưới đây là một vài phương pháp chính: 2.4.1. Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp (low melting temperature) Mẫu agarose gel có nhiệt độ nóng chảy thấp chứa đoạn DNA quan tâm được cắt ra khỏi bản gel và cho vào trong đệm với tỷ lệ 1:1, bổ sung muối đến nồng độ 0,5 M, sau đó được nóng chảy ở 70 o C để hòa tan hoàn toàn trong đệm. Dung dịch gel có DNA được chiết bằng phenol/chloroform và kết tủa. Lưu ý DNA được tách chiết bằng phương pháp này không thích hợp cho mọi phương thức thao tác tiếp theo, do sự hiện diện của các nhân tố ức chế trong agarose. 2.4.2. Ly tâm Mẫu agarose gel có chứa băng DNA quan tâm được cắt ra và cho vào đệm chiết, làm nóng để hòa tan hoàn toàn, sau đó cho dung dịch gel lên trên một lớp (màng) bông thủy tinh đã silicon hóa đặt trong một cột lọc nhỏ loại 0,5 mL (còn gọi là spin column). Cột này được cho vào một tube vi ly tâm loại 1,5 mL và được ly tâm ở tốc độ cao 10.000-15.000 rpm trong 10-15 phút. DNA sẽ liên kết với màng còn dung dịch đệm sẽ đi qua lớp bông thủy tinh vào tube vi ly tâm. Cho đệm rửa vào cột và rửa cột vài lần bằng cách ly tâm nhanh. Thay tube vi ly tâm mới, cho đệm hòa tan DNA vào cột và ly tâm để dung ly (elution) DNA ra khỏi màng vào tube. Dung dịch DNA thu được có thể được tinh sạch thêm nếu cần. Cũng có thể đông lạnh mẫu gel trước khi dùng phương pháp ly tâm để cải thiện hiệu suất thu hồi DNA. 2.4.3. Điện di vào bẫy Một cái rãnh nhỏ được cắt trong agarose gel ngay phía trước của băng DNA quan tâm. Rãnh này được làm đầy bằng glycerol và gel được điện di nhanh trở lại để chuyển DNA từ gel vào trong dung dịch glycerol (quá trình điện di có thể được kiểm soát bằng UV). Dung dịch glycerol-DNA sau đó được chiết bằng pipette. Hoặc sau khi điện di, một khe nhỏ được cắt trong gel ngay phía trước băng DNA quan tâm và đặt trong khe một mẫu giấy loại NA-45. Gel sau đó được điện di trở lại và băng DNA quan tâm sẽ dịch chuyển vào trong mẫu giấy. Mẫu giấy sau đó được rửa và DNA được dung ly trong đệm bằng cách đun nóng mẫu giấy tới 70 o C. DNA sau đó có thể được tách chiết bằng phenol và kết tủa. 2.4.4. Dùng hạt thủy tinh Mẫu gel quan tâm được hòa tan trong dung dịch muối NaI (một loại chaotropic salt) ở nồng độ khoảng 4 M. Các hạt thủy tinh sau đó được bổ sung vào dung dịch để liên kết hiệu quả với các đoạn DNA được phóng thích ở nồng độ đã cho của NaI. RNA, protein và các tạp chất khác không liên kết với các hạt thủy tinh. Tiếp theo là các chu kỳ rửa và kết tủa tiểu thể, DNA tinh sạch được dung ly khỏi hạt thủy tinh trong đệm muối thấp. Tuy nhiên, phương pháp này mặc dù nhanh và hiệu quả nhưng lại có phạm vi tối ưu hẹp. Thu hồi các đoạn DNA nhỏ (500-800 bp) là không hiệu quả lắm và các đoạn lớn (>15 kb) có thể liên kết với các hạt thủy tinh khác nhau và các sợi DNA có thể bị phá vỡ trong suốt các chu kỳ rửa. 3. Quy trình điện di 3.1. Chuẩn bị agarose gel Cho 1% type-II-agarose vào 100 mL đệm 0,5× TAE (nếu khuôn đổ gel lớn thì tăng theo tỷ lệ trên). Đun trong nồi khử trùng hoặc lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Nếu quá trình đun mất nước quá nhiều thì phải thêm nước cho đủ 100 mL. Để nguội khoảng 60 o C và đổ vào buồng điện di có cài sẵn lược. Chiều dày gel khoảng 5 mm là thích hợp. Sau 30-40 phút, khi gel đã đông cứng, có thể gỡ lược ra. . nhiệt độ Tập tính điện di của DNA trong agarose gel không bị ảnh hưởng rõ rệt bởi thành phần base của DNA hoặc nhiệt độ mà ở đó gel được chạy. Trong agarose gel, tính linh động điện di tương đối. dễ dàng chúng ở trong gel. Thường EtBr (0,5 g/mL) được đưa vào trong agarose gel để phản ứng nhuộm xảy ra trong suốt quá trình điện di. Mặc dù tính linh động điện di của DNA sợi đôi mạch. trong suốt quá trình điện di hoặc ở giai đoạn cuối có ưu thế rõ rệt. Tuy nhiên, nếu cần có thể chạy điện di gel không có EtBr và chỉ nhuộm DNA hoặc RNA sau khi điện di xong. Gel được ngâm trong