+ Đánh dấu đầu tận cùng của các phân tử DNA mang đầu lồi 3’, tương tự như ứng dụng của đoạn Klenow. + Đánh dấu các đoạn DNA để làm mẫu dò. + Biến đổi đầu sole của DNA sợi đôi thành đầu bằng. 1.4. Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus) Taq DNA polymerase (Taq pol) là một loại DNA polymerase chịu nhiệt (M = 65.000 Da) của vi khuẩn Thermus aquaticus. Enzyme này được dùng để kiểm tra sự có mặt hoặc không của một gen bằng cách xúc tác cho sự tổng hợp gen đó ở điều kiện in vitro nhờ phản ứng chuỗi polymerase (PCR) (xem chương 3). Taq pol thay thế cho DNA polymerase I của E. coli do có khả năng chịu nhiệt cao phù hợp với điều kiện phản ứng của PCR, và nó có thể tổng hợp một sợi DNA dài 1 kb trong vòng 30 giây ở 72 o C. - Một trong những hạn chế của Taq pol là sự chính xác không cao trong quá trình sao chép của nó do bị mất cơ chế đọc sửa (hoạt tính exonuclease 3’5’). Enzyme Taq pol thương mại có tỷ lệ sao chép lỗi 1/10.000 nucleotide, và có thể tạo ra 16% sản phẩm PCR dài 1 kb bị đột biến trong phản ứng khuếch đại. Mặc dù có nhược điểm trên, Taq pol vẫn có thể được dùng trong các thí nghiệm đòi hỏi một trình tự di truyền chính xác (như trong tạo dòng phân tử). Tuy nhiên, kết quả cho ra một vector mang đoạn chèn (sản phẩm PCR) cần phải được kiểm tra bằng sequencing. - Ưu điểm của Taq pol là sản xuất các đoạn gen mang hai đầu lồi A. Điều này đặc biệt hữu ích trong “TA cloning” là kỹ thuật mà vector (plasmid) được sử dụng đã có sẵn hai đầu lồi T bổ sung với hai đầu lồi A của sản phẩm PCR, nhờ đó đã làm tăng hiệu quả của phản ứng gắn. Ngoài Taq pol, nhiều DNA polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường với các chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn. Chẳng hạn: Pfu DNA polymerase (Pfu pol) được tách chiết từ Pyrococcus furiosus, thường được dùng thay cho, hoặc kết hợp, với Taq pol. Enzyme này ổn nhiệt hơn và có khả năng đọc sửa, vì thế cho tỷ lệ sao chép lỗi thấp. Hoặc Tth DNA polymerase (Tth pol), được tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn mẫu và ion Mn 2+ ; nhưng nếu có sự hiện diện của DNA khuôn mẫu và ion Mg 2+ , thì Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA. Enzyme này cho phép khuếch đại khuôn mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA. 2. RNA polymerase (DNA-dependent RNA polymerase) (Bacteriophage SP6-infected Salmonella typhimurium LT2, bacteriophage T7 hoặc T3-infected E. coli) Các bacteriophage SP6, T7 và T3 sản xuất enzyme RNA polymerase để khởi đầu tổng hợp RNA trên khuôn mẫu DNA sợi đôi có mang promoter đặc trưng bacteriophage. Quá trình tổng hợp này không cần mồi. - Ứng dụng chính + Sản xuất RNA để làm mẫu dò. + Xác định trình tự của một phân tử DNA được tạo dòng trong một vector có mang promoter đặc trưng cho bacteriophage SP6, T7 hoặc T3. + Sản xuất một lượng lớn RNA từ một phân tử DNA được tạo dòng để nghiên cứu về cấu trúc, điều hòa và các mối tương tác của phiên bản RNA. 3. Enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase, RNA-dependent DNA polymerase) Đây là enzyme tổng hợp DNA từ khuôn mẫu RNA. Enzyme này có ở trong các virus: AMV (avian myeloblastosis virus), Mo-MLV (moloney murine leukemia virus) thuộc nhóm virus ngược (retrovirus: virus mang RNA) và có các hoạt tính sau: - Hoạt tính polymerase 5’3’. Tổng hợp DNA theo chiều 5’ 3’. Cơ chất của nó là RNA hay DNA (sợi đơn hoặc sợi đôi): - Hoạt tính RNase H. Bao gồm hai hoạt tính exoribonuclease 5’ 3’ và 3’5’ phân hủy các DNA hoặc RNA trong tổ hợp lai. Enzyme này được dùng trong kỹ thuật di truyền là nhờ vào khả năng tổng hợp được cDNA của chúng (xem chương 6). Người ta có thể tách chiết mRNA ở những tế bào tổng hợp protein mạnh, sau đó dùng enzyme reverse transcriptase để tổng hợp cDNA. Có thể tổng hợp nên oligonucleotide rồi dùng nó để xác định trình tự của DNA. 4. Terminal transferase (Tuyến ức của bê) Hoạt tính của enzyme này là xúc tác gắn các nucleotide vào đầu 3’-OH tự do của DNA sợi đôi làm lồi ra một đầu ở cuối sợi DNA. Phản ứng gắn này là ngẫu nhiên, do đó thành phần nucleotide của đầu lồi phụ thuộc vào nồng độ của bốn loại nucleotide có trong phản ứng. - Ứng dụng chính + Thêm đuôi đồng trùng hợp (homopolymer) để tạo ra đầu so le cho phân tử DNA dùng trong tạo dòng (xem chương 6). + Đánh dấu đầu 3’-OH của DNA trong kỹ thuật xác định trình tự gen theo Maxam và Gilbert. III. Các enzyme gắn Enzyme ligase thường dùng là của phage T4 xâm nhiễm trong E. coli. Chức năng của enzyme này là nối các đoạn hở bằng liên kết cộng hóa trị, sử dụng năng lượng ATP. 1. Bacteriophage T4 DNA ligase (Bacteriophage T4-infected E. coli) Enzyme này là một chuỗi polypeptide (M = 68.000 Da) xúc tác cho sự tạo thành liên kết phosphodiester giữa đầu 3’-OH tự do của một phân tử DNA này với đầu cuối 5’-PO 4 của một phân tử DNA khác. DNA ligase có tác dụng cho cả trường hợp đầu so le lẫn đầu bằng, tuy nhiên đối với đầu bằng enzyme đòi hỏi nồng độ cao hơn và điều kiện phản ứng cũng khác. 2. Bacteriophage T4 RNA ligase (Bacteriophage T4-infected E. coli) Enzyme này xúc tác cho mối liên kết cộng hóa trị giữa nhóm 5’-PO 4 của DNA sợi đơn hoặc RNA với nhóm 3’-OH của DNA sợi đơn hoặc RNA. Do cơ chất thích hợp cho enzyme này là các phân tử nhỏ nên nó thường được dùng để đánh dấu đầu 3’ của các phân tử RNA sử dụng làm mẫu dò. 3. Bacteriophage T4 polynucleotide kinase (Bacteriophage T4-infected E. coli) Enzyme bacteriophage T4 polynucleotide kinase xúc tác chuyển nhóm γ-phosphate của ATP tới đầu 5’ của DNA hoặc RNA. Hai loại phản ứng thường có thể xảy ra là phản ứng thuận và phản ứng trao đổi. Trong phản . các phân tử DNA mang đầu lồi 3’, tương tự như ứng dụng của đoạn Klenow. + Đánh dấu các đoạn DNA để làm mẫu dò. + Biến đổi đầu sole của DNA sợi đôi thành đầu bằng. 1.4. Taq DNA polymerase. thế cho DNA polymerase I của E. coli do có khả năng chịu nhiệt cao phù hợp với điều kiện phản ứng của PCR, và nó có thể tổng hợp một sợi DNA dài 1 kb trong vòng 30 giây ở 72 o C. - Một trong. của DNA khuôn mẫu và ion Mg 2+ , thì Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA. Enzyme này cho phép khuếch đại khuôn mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA. 2. RNA polymerase (DNA- dependent