3.2. Đặt mẫu DNA vào giếng Tùy thuộc vào từng mục đích điện di khác nhau có thể sử dụng nồng độ DNA cao hoặc thấp. Chẳng hạn theo tỷ lệ sau: DNA (1 g/1 L) 1 L Đệm màu bromophenol (×10 loading dye) 1 L Nư ớ c cất 2 lần 9 L T ổ ng s ố 11 L Dùng micropipette hút 11 L dung dịch trên cho vào giếng. Lưu ý mẫu chạy điện di phải có dung tích thể tích của giếng. Thường đặt mẫu sau khi đã đổ dịch đệm 0,5× TAE vào buồng điện di cho ngập gel, ít khi đặt mẫu trước rồi đổ đệm sau (nạp khô). Để dễ làm việc nên dùng micropipette loại 20-200 L và đặt buồng điện di trên bàn có nền đen. Khi tăng điện áp của quá trình điện di, các đoạn DNA lớn thường dịch chuyển nhanh hơn so với các đoạn nhỏ. Tuy nhiên, để có độ phân giải (resolution) tốt nhất đối với các đoạn DNA có kích thước lớn hơn 2 kb thì điện áp được sử dụng phải nhỏ hơn 5 V/cm (giá trị cm được tính theo khoảng cách giữa hai điện cực chứ không phải là chiều dài của gel). DNA dịch chuyển từ cực âm đến cực dương. Quan sát sự dịch chuyển bằng màu bromophenol để biết lúc nào cần ngừng điện di (Hình 2.5). 3.3. Nhuộm DNA bằng EtBr Sau khi chạy điện di xong lấy nhẹ bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5 g/mL, trong thời gian 30-45 phút, tốt nhất trên một máy lắc nhẹ (độ 10 vòng/phút ). Đổ dịch nhuộm EtBr vào một bình riêng để xử lý và rửa bản gel bằng cách ngâm trong nước cất hai lần, mỗi lần 15-20 phút. EtBr thường pha sẵn ở dạng đậm đặc 5 mg/mL và giữ ở 4 o C trong tối. Hình 2.5. Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel 3.4. Quan sát và chụp ảnh Bản gel sau khi nhuộm EtBr được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ( = 302 nm) (Hình 2.6). Dùng thiết bị chuyên dụng để phân tích và lưu trữ hình ảnh DNA (Gel Documentation System). Chú ý Không nhìn vào ánh sáng tử ngoại nếu không có kính lọc thích hợp. Hình 2.6. Hình ảnh điện di DNA chạy trên agarose gel 1%, 3 Volts/cm và nhuộm bằng EtBr. Các băng DNA có màu sáng. SM: Chuẩn kích thước của DNA (1 kb ladder). Các đường 1, 2 và 3: mẫu plasmid DNA được cắt bằng 3 enzyme hạn chế khác nhau. III. Điện di polyacrylamide gel Acrylamide là một monomer có cấu trúc như sau: Khi có mặt các gốc tự do, được cung cấp bởi ammonium persulphate và ổn định bởi TEMED (N,N,N’,N’-tetramethylethylene-diamine), phản ứng chuỗi được bắt đầu trong đó các acrylamide monomer được polymer hóa (trùng hợp) thành một chuỗi dài. Khi bisacrylamide (N,N’-methylenebisacrylamide) được bổ sung trong phản ứng polymer hóa, các chuỗi sẽ liên kết chéo (cross-linking) để tạo thành dạng gel. Độ xốp của gel được xác định bởi chiều dài của chuỗi và mức độ liên kết chéo. Chiều dài của chuỗi polyacrylamide được xác định bằng nồng độ acrylamide trong phản ứng polymer hóa (giữa 3,5% và 20%). Ngoài protein, polyacrylamide gel cũng được dùng để điện di DNA (kể cả RNA và DNA/RNA). Gel phải được rót vào giữa hai tấm kính (gel plates) được ngăn cách bởi các miếng đệm (gel spacers) (Hình 2.7). Hầu hết các dung dịch acrylamide được ngăn không tiếp xúc với không khí để hạn chế sự ức chế trùng hợp gây ra bởi oxygen. Gel có thể dài từ 10-100 cm tùy thuộc vào yêu cầu phân tích và chúng thường được chạy trong phương thẳng đứng. Hình 2.7. Sơ đồ và hình ảnh của buồng điện di polyacrylamide gel Phạm vi kích thước phân tử và độ phân giải của quá trình phân tách tùy thuộc vào nồng độ của acrylamide và bis-acrylamide (và tỷ lệ của chúng) do chúng tạo ra khuôn gel với các phần trăm khác nhau của acrylamide và bậc của liên kết chéo. Nồng độ thấp tạo ra các lỗ có kích thước lớn hơn và vì thế có thể phân tách các phân tử lớn hơn. Liên kết chéo của các monomer và các tác nhân liên kết có thể được điều chỉnh để kiểm soát mức độ xốp của khuôn gel. Điều này cho phép tối ưu hóa một khuôn gel để phân tách một phạm vi kích thước đặc biệt của các phân tử protein. 1. Điện di nucleic acid Điện di polyacrylamide gel được dùng để phân tách và thu hồi các đoạn DNA có chiều dài từ 5-2.000 bp. Nồng độ polyacrylamide gel được sử dụng trong khoảng từ 3,5-20% tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA quan tâm. Hai loại polyacrylamide gel thường được sử dụng là: - Polyacrylamide gel không biến tính dùng để phân tách và tinh sạch các đoạn DNA sợi đôi. - Polyacrylamide gel biến tính bằng urea và formamide (sequencing gel) dùng để phân tách và tinh sạch các đoạn DNA sợi đơn. Phần này chỉ giới thiệu polyacrylamide gel không biến tính là loại gel hay được sử dụng nhất. Hiệu quả của sự phân tách DNA trong loại gel này phụ thuộc vào nồng độ của acrylamide (Bảng 2.3), kích thước và điện tích của DNA. Bảng 2.3. Hiệu quả của sự phân tách DNA trong polyacrylamide gel không biến tính 1.1. Chuẩn bị polyacrylamide gel không biến tính Kích thước phổ biến của tấm kính đổ gel thường là 20 cm 40 cm. Miếng đệm dày khoảng 0,5 mm-2,0 mm. Các gel dày hơn thường nóng lên trong quá trình điện di nên sẽ làm nhòe các băng DNA, vì thế người ta thường sử dụng các gel mỏng. Tuy nhiên, khi khi chạy một lượng lớn DNA (>1 g/băng) thì cần chuẩn bị gel dày. Dưới đây mô tả các bước chuẩn bị và sử dụng polyacrylamide gel không biến tính: 1.1.1. Chuẩn bị các dung dịch sau: - 30% acrylamide (bao gồm bis-acrylamide) - 1× TBE - 10% ammonium persulphate 1.1.2. Lau sạch hai tấm kính dùng làm khuôn gel và miếng đệm bằng KOH/methanol hoặc ethanol. Xử lý bề mặt của hai tấm kính bằng dung dịch silicon để ngăn gel dính chặt vào hai tấm kính gây rách gel lúc lấy nó ra khỏi khuôn sau khi điện di xong. 1.1.3. Tính toán thể tích của các dung dịch dùng để tạo polyacrylamide gel trên cơ sở kích thước tấm kính, độ dày của miếng đệm (xem bảng 2.4). . 3.2. Đặt mẫu DNA vào giếng Tùy thuộc vào từng mục đích điện di khác nhau có thể sử dụng nồng độ DNA cao hoặc thấp. Chẳng hạn theo tỷ lệ sau: DNA (1 g/1 L) 1 L. việc nên dùng micropipette loại 20-200 L và đặt buồng điện di trên bàn có nền đen. Khi tăng điện áp của quá trình điện di, các đoạn DNA lớn thường dịch chuyển nhanh hơn so với các đoạn nhỏ các đoạn DNA có kích thước lớn hơn 2 kb thì điện áp được sử dụng phải nhỏ hơn 5 V/cm (giá trị cm được tính theo khoảng cách giữa hai điện cực chứ không phải là chiều dài của gel). DNA dịch