Trên vector phage λ người ta cũng đã chọn được các vị trí nhận biết cho các enzyme cắt hạn chế, và xây dựng phương pháp đóng gói in vitro (in vitro packing) để đưa đoạn DNA đã được gắn vào đầu của phage. 2. Tạo dòng trong bacteriophage λ Bacteriophage λ với genome phức tạp và lớn được dùng như một vector, DNA của nó chứa một số vị trí thích hợp cho các RE cần thiết để tạo dòng. Các bước tạo dòng trong phage λ được tóm tắt như sau (Hình 4.9 và 4.10): - Tinh sạch DNA vector bằng ly tâm theo gradient tốc độ hoặc điện di gel sau khi đã được cắt bằng RE. - Các nhánh phải và trái sau đó được liên kết với DNA ngoại lai kích thước khoảng 20 kb có đầu kết thúc tương đồng với đầu của các nhánh. - Kết quả các DNA tái tổ hợp được đóng gói in vitro trong các phage λ . - Các phage tái tổ hợp mang các đoạn DNA ngoại lai mong muốn được xác định bằng phương pháp lai nucleic acid. - Tinh sạch và chọn tế bào vật chủ (E. coli) cho nó sinh sản để duy trì và phân tích các đoạn DNA ngoại lai. 2.1. Chọn vector λ thích hợp Có hai yếu tố ảnh hưởng đến sự chọn lọc, đó là enzyme cắt hạn chế được sử dụng và kích thước DNA ngoại lai. Chỉ khoảng 60% genome (nhánh trái và nhánh phải) là cần thiết cho sự sinh tan của phage. Khả năng sống sót của phage giảm khi DNA dài hơn 105% hoặc ngắn hơn 78% so với genome tự nhiên đã được đóng gói. Điều quan trọng là chọn vector và DNA ngoại lai như thế nào để kích thước của phage tái tổ hợp nằm trong giới hạn cho phép. Hình 4.9. Các bước tạo dòng trong bacteriophage λ . DNA nguồn được cắt bằng BamHI và được phân đoạn theo kích thước (khoảng 20 kb). Bacteriophage l cũng được phân cắt bằng BamHI. Hai mẫu này được trộn vào nhau và xử lý bằng T4 DNA ligase. Phản ứng gắn xảy ra tạo một bacteriophage λ mới (tái tổ hợp): đoạn stuffer được thay bằng đoạn DNA ngoại lai. Những phân tử này đóng gói in vitro trong đầu của phage λ , và chúng có thể gây nhiễm sau khi được thêm phần đuôi Hình 4. 10 . Phân tử DNA của phage λ . A: Tự tái bản DNA từ dạng vòng của λ làm cho nó trở thành dạng dây thẳng, hình thành các đoạn chồng lấp lên nhau, với độ dài khoảng 50 kb. B: Mỗi đầu đều chứa đầy 50 kb đơn vị của l DNA , trước khi đuôi được tổng hợp gắn vào sau. Một số vector λ đã được thiết kế thuận lợi cho sinh trưởng của chúng trong E. coli mang prophage P2, phenotype này được gọi là Spi + . Các chủng λ thiếu hai gen cần thiết trong tái tổ hợp (red và gam) biểu hiện phenotype Spi - sẽ sinh trưởng tốt trong các thể tiềm tan P2 chừng nào mà chúng còn mang chuỗi chi (chi là cơ chất cho sự tái tổ hợp được xúc tác bởi hệ thống recA). Tạo dòng ở các vector λ L47.1, λ 1059 hoặc λ BF101 đã được tiến hành bằng cách loại bỏ đoạn stuffer chứa red và gam. Kết quả thu được phage tái tổ hợp là Spi - và chúng có thể được nhận biết hoặc chọn lọc bằng khả năng sinh trưởng của chúng trên các thể tiềm tan P2 recA + của E. coli . Hầu hết các vector thay thế mất gen gam khi đoạn stuffer bị loại bỏ. Các thể tái tổ hợp được tạo thành với các vector như thế phải được sinh sản trong vi khuẩn recA + . Phage l sep6-lac5 mang các gen red và gam trong nhánh phải của nó và các thể tái tổ hợp được tạo thành với vector này có phenotype Spi + có thể được nhân lên trong vi khuẩn mang đột biến recA - . 2.2. Những vector λ được cải tiến Những vector λ thường được cải tiến nhằm mục đích: - Tăng khả năng thích ứng của các đoạn DNA ngoại lai khác nhau với các RE. - Cho phép chọn lựa phương thức tái tổ hợp mong muốn. - Cho phép có được các RNA probe sẵn sàng cho việc chuyển mã của DNA ngoại lai gắn vào vector. Điều này giúp chúng ta dễ dàng sàng lọc các thư viện trong quá trình chromosome walking, ví dụ như λ ZAP. - Phát triển các vector trong quá trình gắn vào cDNA của sinh vật bậc cao, dưới hình thức một polypeptide dung hợp với β-galactosidase. Hình thức này rất hữu ích trong việc chọn lọc kháng thể, ví dụ như vector λgt11. Hình 4.11. Vector EMBL3 và EMBL4 được thiết kế từ phage l mang các vị trí nhận biết cho các enzyme SalI, BamHI và EcoRI Thế hệ gần đây nhất của vector l là EMBL3 và EMBL4 (Hình 4.11), chúng mang các trình tự có tính chất polylinker nằm gần đoạn có thể thay thế được. Các phage với những thể insert đính bên trong nó có thể được chọn lọc bằng kiểu hình Spi - , chính là chi + . Thể cải tiến từ EMBL3 có những đột biến EMBL3 Sam, EMBL3 Aam Sam. Những đột biến trong vector không chỉ làm gia tăng khả năng chứa của nó, mà còn được sử dụng trong hệ thống chọn lọc những trình tự DNA được phân lập, liên kết với các gen ức chế (suppressor). III . Cosmid vector 1. Đặc điểm của cosmid Cosmid là các vector đặc biệt được xây dựng bởi plasmid + đầu cos dùng để tạo dòng các đoạn DNA kích thước lớn của eukaryote (Hình 4.12). Các thành phần không thể thay thế của các cosmid vector bao gồm: - Các marker kháng kháng sinh và một trình tự ori của plasmid. - Đoạn DNA mang đầu dính cos của phage l . - Kích thước nhỏ sao cho các đoạn DNA eukaryote dài khoảng 45 kb có thể thích ứng. Hình 4.12. Bản đồ và vùng tạo dòng của vector cosmid pWEB-TNC. Vị trí tạo dòng SmaI nằm bên cạnh các cặp BamHI, NotI và EcoRI. Chl r : gen kháng chloramphenicol. 2. Tạo dòng trong cosmid Các nguyên tắc cơ bản của phương pháp tạo dòng trong cosmid được trình bày ở hình 4.13. Trước hết cosmid được cắt với RE thứ nhất (ScaI) để tạo thành mạch thẳng, sau đó phân tử mạch thẳng được cắt tiếp với RE thứ hai (BamHI) để làm thành hai nhánh (nhánh lớn và nhánh nhỏ). Một nhánh chứa đầu cos, gen kháng kháng sinh và vùng ori; nhánh còn lại chỉ chứa đầu cos thứ hai. Hai nhánh này kết hợp với genomic DNA đã được cắt với RE (cùng loại với RE thứ hai cắt cosmid thành hai nhánh) nhờ DNA ligase, cuối cùng tất cả chúng được đóng gói in vitro trong đầu của các tiểu thể phage l trưởng thành. Sự đóng gói các phân tử tái tổ hợp trong các tiểu thể phage chỉ . trọng là chọn vector và DNA ngoại lai như thế nào để kích thước của phage tái tổ hợp nằm trong giới hạn cho phép. Hình 4.9. Các bước tạo dòng trong bacteriophage λ . DNA nguồn được cắt bằng. thiết để tạo dòng. Các bước tạo dòng trong phage λ được tóm tắt như sau (Hình 4.9 và 4.10): - Tinh sạch DNA vector bằng ly tâm theo gradient tốc độ hoặc điện di gel sau khi đã được cắt bằng. sau đó được liên kết với DNA ngoại lai kích thước khoảng 20 kb có đầu kết thúc tương đồng với đầu của các nhánh. - Kết quả các DNA tái tổ hợp được đóng gói in vitro trong các phage λ . - Các