Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát sự phát sinh chồi và nhân nhanh cụm chồi từ mẫu đốt thân cây Ngọc Ngân (Dieffenbachia picta)

Nghiên cứu này được tiễn hành dé khảo sát nồng độ chất khử trùng javeltối ưu cho mẫu đốt thân sống sạch, khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất điều hoàsinh trưởng thực vật thích hợp cho sự phá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHẢO SÁT SỰ PHÁT SINH CHÒI VÀ NHÂN NHANH CỤM CHÒI TỪ MẪU ĐÓT THÂN CÂY NGỌC NGÂN

(Dieffenbachia picta)

Nganh hoc : CONG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : NGUYEN MINH THIEN

Mã số sinh viên : 18126159

Niên khóa : 2018 - 2022

Thành phố Thủ Đức, 08/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TOT NGHIỆP

KHAO SÁT SỰ PHÁT SINH CHOI VÀ NHÂN NHANH CUM CHOI TỪ MAU DOT THÂN CÂY NGỌC NGÂN

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu nhà trường Đại họcNông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, thầy Dinh Xuân Phát — Trưởng Khoa Khoahọc Sinh học, thay Nguyễn Vũ Phong - cố van học tập lớp DH18SHD và các thầy

cô giảng dạy trong Khoa Khoa học Sinh học đã nhiệt tình hướng dẫn, tận tâm dạybảo và cung cấp những kiến thức hữu ích cho em trong suốt quá trình học tập vàtrau dồi kinh nghiệm chuyên ngành

Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến chỉ nhánh Công Ty Cổ Phần CôngNghệ Sinh Học TPECO đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất trong suốt quá trình

em thực hiện đề tài Em xin cảm ơn anh Huỳnh Tan Phát - Giám đốc Công Ty

Cô Phần Công Nghệ Sinh Học TPECO đã giúp đỡ và hướng dẫn em rất nhiềutrong thời gian thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô Tô Thị Nhã Trầm đã tận tìnhhướng dẫn, truyền đạt những kiến thức vô cùng quý báu và luôn hỗ trợ hết sức

có thé dé giúp đỡ em hoàn thành đề tài một cách tốt nhất

Con xin gửi lời cảm ơn chân thành đên ba mẹ đã ủng hộ và động viên trongsuốt thời gian học tập tại trường Dai học Nông Lâm thành phó Hồ Chí Minh

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên Nguyễn Minh Thiện, MSSV: 18126159, Lớp: DH18SHD thuộcngành Công nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm thành phó Hồ Chí Minh,xin cam đoan: Đây là Khóa luận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện,các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan.Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng về những cam kết này

Thành phố Hồ Chi Minh,ngày tháng năm

Người viết cam đoan(Ký và ghi rõ họ tên)

il

TÓM TATCây ngọc ngân (Dieffenbachia picta) là một loài cây cảnh rất được ưa chuộng

ở Việt Nam hiện nay, người dân sử dụng cây ngọc ngân với mục đích trang trí

nội thất Nghiên cứu này được tiễn hành dé khảo sát nồng độ chất khử trùng javeltối ưu cho mẫu đốt thân sống sạch, khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất điều hoàsinh trưởng thực vật thích hợp cho sự phát sinh chéi và nhân nhanh cụm chdi từmẫu đốt thân cây ngọc ngân bằng phương pháp nuôi cây mô Các mẫu đốt thânđược lắc trong 10 phút với các nồng độ khử trùng khác nhau và được nuôi cấytrong môi trường MS Kết quả sau 2 tuần nuôi cấy, nồng độ javel 10% là tối ưuvới tỉ lệ sống sạch đạt 85,71% Mẫu đốt thân sống sạch được nuôi cay trên môitrường MS bổ sung 1,0 mg/l IBA kết hợp với Kinetin ở các nồng độ khác nhau.Kết quả sau 8 tuần nuôi cấy, môi trường MS có bồ sung 1,0 mg/l IBA kết hợpvới 0,4 mg/l Kinetin cho sự phát sinh chi tốt nhất với tỉ lệ phát sinh chồi đạt85,71% và chiều cao chéi trung bình là 1,43 em Mẫu chỗi có chiều cao đạt từ1,0 - 1,5 em được nuôi cấy trên môi trường MS bồ sung 0,4 mg/l Kinetin kết hợpvới BA ở các nồng độ khác nhau Kết quả sau 8 tuần nuôi cấy, môi trường MS

có bố sung 0,4 mg/1 Kinetin kết hợp với 2,0 mg/l BA cho sự nhân nhanh cụmchồi cao nhất với là 5,14 chồi/mẫu, chiều cao chéi trung bình là 3,57 cm và sốlá/mẫu là 3,95 lá Can mở rộng nghiên cứu dé hoàn thiện cây ngọc ngân in vitro,khả năng sinh trưởng và phát triển của cây ngọc ngân ngoài vườn ươm

Từ khoá: cây ngọc ngân, Dieffenbachia picta, đốt thân, phát sinh chỗồi, cụm chôi,

Javel, Kinetin, BA.

11

Dieffenbachia picfa is an ornamental plant in VietNam, people use it for interior decoration This study was conducted to investigate the optimal concentration of javel for node explant, to investigate the effect of suitable

concentrations of plant growth regulators on shoot of formation and rapid

multiplication of bud clusters from the stem segment of Dieffenbachia picta by tissue culture method Node explant is shaked in ten minutes with javel at different concentration Afrer two weeks of cultured, the concentration of javel 10% is optimal with the survival rate of 85.71% The stem segment explants are cultured on MS medium supplemented with 1.0 mg/l IBA in combination with Kinetin at different concentrations After eight weeks of cultured, MS medium supplemented with 1.0 mg/l IBA and 0.4 mg/l Kinetin gave the best shoot growth with shoot growth rate of 85.71% and the average height of shoots is 1.43 cm Shoot explants with a height of 1.0 - 1.5 cm are cultured on MS medium supplemented with 0.4 mg/l Kinetin in combination with BA at different concentrations After eight weeks of cultured, MS medium supplemented with 0.4 mg/l Kinetin and 2.0 mg/l BA gave the best rapid multiplication of bud clusters with 5.14 shoots, 3.95 leaves and the average height of shoots is 3.47 cm.

It is necessary to expand research in vitro of Dieffenbachia picta, growth and development ability of Dieffenbachia picta outside the nursery.

Keyword: Dieffenbachia picta, node, shoot of formation, bud clusters, javel,

Kinetin, BA.

iv

MỤC LỤC

Trang

ie es iXAC NHAN 00/06.) 6629/907577 iiTÓM AG 2-2 S2 SES82525 525 5 1 1 1 123 11101111211121011111111110112 1102126 iii

CSL | eo-neuauzbprdgerstrdidrsvsgf St0ATn/0/T80000000i00901902dn010): ĐxsP6trdtgiggig 1V

MỤC LỤC - 5252 2222222S225252121525212121212121121212121211111212121 2121 c2 Vv

DANH SÁCH CÁC CHU VIET TẮTT - 2 2+2+22E+E+2z+Ez222zzzzxe ViiTAIT SÁCH CẬU FAG aa cerrestnsnssnconconeataraneveeneeazinveespnumorexnceinwvnets ViliDANH SÁCH CÁC HÌNH 2-2 S2S222E252525221 2121212111211 xe ixCHƯƠNG 1 MO DAU o.oo eecccccecccscsesececscseseseeessesescecstsuceceeececensnsesiteveceeees |1.1 Đặt vấn đề - 5s s2 12212112111211112112111111111101211 01111 rea 11.1.1 Mục tiêu đề tài - 2 55s 22EEE12E2121211212112111 221121 rre 2

1.1.2 Nội dung nghiên CỨU - 2552222222 *+2£+E£+E£zEezEerrrrrrrrreererree 2

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU o 0 cccccceceecececeseseeesesseseeeteeeees 32.1 Giới thiệu về cây ngọc MgAm eeescseccsnsessusesssccsueecsseesnessacesnseesnseene 3

2.1.1 Phân loại -©22+2s222222E2252221221121122122112111121121111211211 2122 xe 3

12.1 ca) ee 32.1.3 Đặc điểm hình thai eccse cee esesseseeeeeseseeeseesseeeseeseeseseeeeees 3

2.1.4 Cac nghiên cứu liên quan - 552 252 2+ S2 2x 212 2 re 4

2.2 Giới thiệu về nuôi cay mô tế bào thực vật -22©2252z55+2 52.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật -2- 2 25555552 72.2.2 Y nghĩa của nuôi cay mô tế bào thực Vat c.cccceccccsesessesesseseseeseeeeeeeees 82.2.3 Các giai đoạn nhân giống i Vitro -¿ 2222252+22zz2zzzzzzcse2 92.2.4 Các thành phan trong môi trường nuôi cấy -:z- 10CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2- 2 252552 133.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - 2: 2+-++2s+zz+zx+zx+zxzzxeex 13S82 MQEHE(IRBHIỂT CU, seisesarsanetsetoibsoaiBibiitidsadES.S20/038S800955950B0H80S3GĐ8N080383008đ 13

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu -2- 2 ©2++22++2+++EE++EE+2EE++Ex+zrxrrrrree 133.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm - 2-22 ©22222+22+22zzzz++zze2 13

3.2.3 Hóa chất và môi trường nuôi cấy -:-©+2c-++ccx++cxvcee 133.2.4 Điều kiện nuôi cấy - 2-2-2 ©22+22+22E22E22EEE2EEE22E221 221 2E cee 143.3 Phương pháp nghiên CỨU - 5-5 S* SE S+ESvErrererrrrerrrrrrrrrree 15

3.3.1 Khảo sát nồng độ khử trùng javel xử lý đốt thân cây ngọc ngân 153.3.2 Khảo sát nồng độ Kinetin lên sự phát sinh chồi từ mẫu đốt thân 163.3.3 Khảo sát nồng độ BA đến kha năng nhân nhanh cụm chii 173.4 Phương pháp xử lý số liệu - 2-22 2222222222E22E2EE22E22EzEEzrxzre 17CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 2 2-2+222+<z2cs2 184.1 Nồng độ khử trùng javel xử lý mẫu đốt thân cây ngọc ngân 184.2 Sự phát sinh chồi từ mẫu đốt thân 2-22 ©2222z+2z222zz2zz2zze2 354.3 Khả năng nhân nhanh cụm chồi -2- 2 22222222Ez2£E+zE+zz+zzzzx2 26CHƯƠNG 5 KET LUẬN VA DE NGHỊ, - 2 2222 =22z222Ezzzzzc+2 315.1 Kết luận - 2 2-22222122222212212211211211211211211211211211212121 1e xe 315,2, Đề nghỉ G1 2020 HH n0 Làn 1 An G3 Hán H11 0 0021000204601 31TÀI LIEU THAM KHẢO + 2 2+2+E2E+E£E2EE2E2E2E2E22222222222z2zcec 32

ae 37

Vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT2ip 6 (di - methyl - allyl - amino) purine

2,4-D 2,4 - dichlorphenolxyacetic acid

BA benzyl adenine

BAP benzyl amino purine

CO; carbon dioxide

CV coefficient of variation

DNA deoxyribonucleic acid

DPU diphenylurea

HgCl mercuric chloride

IAA indole - 3 - acetic acid

IBA indole - 3 - butyric acid

Kinetin 6 - furfurylaminopurine

led light emiting diode

MS Murashige va Skoog

NAA ơ - naphthalene acetic acid

NaClo sodium hypochloride

TDZ thidiaruzon

Zeatin 6 - (4 - hydroxyl - 3 - methylbut - 2 - enylamino) purine

Vii

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bang 3.1 Thanh phan hoá chất môi trường MS - 14Bang 3.2 Nong độ javel (%) đến quá trình khử trùng mẫu 15Bảng 3.3 Nồng độ Kinetin (mg/l) đến tạo chéi từ mẫu đốt thân l6Bang 3.4 Nồng độ BA (mg/l) đến quá trình nhân nhanh cụm chồi 17Bảng 4.1 Anh hưởng nồng độ khử trùng javel sau 2 tuần nuôi cay 18Bảng 4.2 Tình trạng mẫu đốt thân sau 2 tuần nuôi cấy 19Bang 4.3 Sự phát sinh ch6i sau 4 tuần nuôi cấy -5- 22Bảng 4.4 Tình trạng mẫu phát sinh chồi sau 4 tuần nuôi cấy 23Bang 4.5 Chiều cao chôi trung bình sau 8 tuần nuôi cấy 24Bang 4.6 Khả năng nhân nhanh cụm chồi sau 4 tuần nuôi cấy 27Bảng 4.7 Tình trạng mẫu nhân nhanh cụm chồi sau 4 tuần nuôi cấy 28Bang 4.8 Khả năng nhân nhanh cụm chồi sau 8 tuần nuôi cấy 28Bang 4.9 Tình trang mẫu nhân nhanh cụm chi sau 8 tuần nuôi cấy 30

vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang HÌNH 2:1: Cay MSOC HƠI, soossosccsiesicoblESeEssesitaabtasaosdbSbsauStiggecluftsSd0sãs 866 3 Hình 2.2 Lá cấy 28 Oe THÂN :.- c6 220 s60 n0 01510661115 1511 01350 có c4 H4552015530 88 4

Hình 4.1 Mẫu nuôi cấy bị nhiễm và chết sau 2 tuần 5- 20Hình 4.2 Mẫu đốt thân sau 2 tuần nuôi cấy - 2 225222222522 21Hình 4.3 Mẫu phát sinh chỗi sau 4 tuần nuôi cấy . -2 5-522 23Hình 4.4 Mẫu phát sinh chổi sau 8 tuần nuôi cấy - 2-55: 25Hình 4.5 Mẫu nhân nhanh cụm chồi sau 4 tuần nuôi cấy 27Hình 4.6 Mẫu nhân nhanh cum chéi sau 8 tuần nuôi cấy 29

1X

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây ngọc ngân (Dieffenbachia picta) là một loài cây thân thảo thuộc ho Ray

(Araceae), hiện nay cây ngọc ngân phân bố ở khu vực châu Á như Thái Lan,Philippines và nhiều nước khác trong đó có Việt Nam (Green và Oguzor, 2009).Cây ngọc ngân có lá rất dé nhận dang so với các cây kiểng lá khác là những đốmmàu trắng xen kẽ ở phần giữa lá, phần viền lá và cuống lá thì có màu xanh vàđược sử dụng dé làm cây cảnh trang trí nội thất cho nhà cửa, cho văn phòng công

sở, khuôn viên sân vườn cũng như tạo mảng xanh, không gian tươi mát cho các

trung tâm mua sắm, nhà hàng, khách sạn Ngoài ra, cây ngọc ngân đại diện cho

sự giàu sang, phú quý vì chữ “ngân” trong tên cây có nghĩa là tiền bạc, chữ “ngọc”được ví von như là một báu vật rất có giá tri, khi kết hợp lại “ngọc ngân” có ýnghĩa mang đến tài lộc cho gia chủ, cho người sở hữu cây này Ở Việt Nam, câyngọc còn được gọi bằng một cái tên khác lãng mạn hơn là cây Valentine vì màusắc của lá đan xen, hòa quyện lẫn nhau giống như sự gắn bó, không thể chia xacủa tình yêu đôi lứa (Lê Quỳnh Anh, 2022).

Trong sản xuất, cây ngọc ngân thường được nhân giống bằng phương phápthủ công như gieo hạt, giâm cành, tách chdi hoặc ngọn từ cây me Các phươngpháp này thường không mang lại hiệu cao, hệ số nhân cây thấp, cây có thể khôngđạt chất lượng tốt cũng như dễ bị thoái hoá, nhiễm khuẩn và nhiễm nam từ cây

mẹ, từ môi trường nuôi trồng hoặc thao tác trong quá trình nhân giống thủ công.Trong những năm gan day, cây ngọc ngân rất được ưa chuộng trong nhữnghội nhóm về cây cảnh, cây kiếng lá trở thành một trong những loài cây có giá trị

cao về thương mại dé dam bảo được nguồn giống tốt, ôn định, sạch bệnh Chính

vì những lí do đó, kỹ thuật nuôi cay mô — tế bào thực vật là một giải pháp hiệuquả, từ một nguồn mẫu ban đầu nhỏ được nhân nhanh với hệ số cao trong thời

gian ngắn, đảm bảo được chất lượng mẫu tốt, đồng nhất và di truyền được đặc

tính của nguồn mẫu ban đầu Ngoài ra, từ năm 2018 trở lại đây, đã có nhữngnghiên cứu về độc tố có trong Dieffenbachia như là các tinh thé oxalate canxi vàmagie gây độc cho mắt, cũng như tìm hiểu và khảo sát ứng dụng hoạt tính sinh

hoc cũng như tác dụng phụ của Dieffenbachia về tác động chống vi khuẩn vàhiệu quả chống ung thư (Syamiith va ctv, 2018) Bên cạnh đó, cũng có các nghiêncứu về sử dung Dieffenbachia dé lọc sạch những khí như benzene, toluene vàxylene gây ô nhiễm không khí trong nhà gây độc hại đến sức khoẻ con người(Bandehali va ctv, 2021) Trên cơ sở đó, dé tài “Khảo sát sự phát sinh chéi vànhân nhanh cụm chdi từ mẫu đốt thân cây ngọc ngân (Dieffenbachia picta)” đượcnghiên cứu dé tạo ra nguồn mẫu có tỉ lệ sống cao với hệ số nhân chồi nhiều gópphan hoàn thiện quá trình nhân giống tạo cây ngọc ngân hoàn chỉnh in vitro.1.1.1 Mục tiêu đề tài

Xác định được nồng độ chất khử trùng javel thích hợp dé xử lí mẫu đốt thâncây ngọc ngân, tạo được nguồn mẫu sống sạch để làm vật liệu tiến hành thínghiệm khảo sat chất điều hoà sinh trưởng, từ đó tìm ra được nồng độ Kinetin tối

ưu cho sự phát sinh chồi từ mẫu đốt thân và nồng độ BA tối ưu cho quá trìnhnhân nhanh cụm chi cây ngọc ngân

1.1.2 Nội dung nghiên cứu

Dé khảo sát sự phát sinh chồi của cây ngọc ngân, trước tiên cần có nguồnmẫu sạch bệnh Vì vậy, bước đầu tiên phải tiễn hành quá trình khử trùng mẫu đốtthân cây ngọc ngân tạo ra được nguồn vat liệu sống sạch cho các thí nghiệm tiếptheo Sử dụng nguồn mẫu đã khử trùng để tiến hành thí nghiệm khảo sát sự phátsinh chéi từ mẫu đốt thân khi thay đôi nồng độ chất điều hòa sinh trưởng Kinetin.Sau khi mẫu đốt thân đã phát sinh chdi thì thực hiện thí nghiệm khảo sát chấtđiều hòa sinh trưởng BA đến khả năng nhân nhanh cụm chi

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Giới thiệu về cây ngọc ngân

Loài: Dieffenbachia picta

2.1.2 Nguồn gốc Hình 2.1 Cây ngục ngân.

Chi Dieffenbachia gồm 30 loài với hơn 100 giống có đốm, sọc hoặc lốm đốmmàu trắng, màu kem, màu vàng, màu bạc hoặc là sự kết hợp của những màu này.Dieffenbachia có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ, thuộc họ Ray, các câythuộc chi này được các nhà trang trí nội thất đánh giá cao vì tán lá đa dạng, hapdan, dùng dé trang trí trong nhà và dé sản xuất Một số giống cây phố biến nhấtđược sử dụng dé trang trí nội that là Dieffenbachia picta, Dieffenbachia amoena,

Dieffenbachia seguine (Elsheikh và ctv, 2013).

Cây ngọc ngân (Dieffenbachia picta) có nguồn gốc từ Costa Rica vaColumbia, hiện nay chúng được trồng ở nhiều vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệtđới (Green và Oguzor, 2009) Ở châu Á, cây ngọc ngân cũng được trồng ở khánhiều quốc gia trong đó có Việt Nam, sử dụng đề làm cây cảnh trang trí nhà cửa,khuôn viên sân vườn hoặc các công trình cảnh quan tạo không gian xanh mát.2.1.3 Đặc điểm hình thái

Cây ngọc ngân có đặc điểm dễ nhận dạng, ở phần giữa lá có nhiều đốm màutrắng xen kẽ màu xanh, phần viền lá và cuống lá có màu xanh, lá khá dày có hìnhbầu dục giống như mũi giáo (Hình 2.2), tán lá tương đối vừa, lá mọc từ thân cây

và không đối xứng Thân cây có màu xanh đậm, có nhiều đốt than, mỗi đốt thân

sẽ có một lá và chứa một mắt ngủ, chiều cao của cây ngọc ngân trung bình khoảng

20 cm đến 60 cm, cây có rễ chùm, thường mọc thành bụi, một gốc cây thường có

5 - 6 nhánh cây Bên cạnh đó, cũng đã có nhiều nghiên cứu cho rằng chỉ

3

Dieffenbachia đều có độc tính đôi với con người và động vật, bởi vì tinh thể hìnhkim của canxi oxalate có trong Dieffenbachia sẽ gây tôn thương da và niêm mạc,

con người và thú nuôi sẽ thường bị ảnh hưởng do chi Dieffenbachia được nuôitrồng trong nhà hoặc ngoài vườn (Dantas và ctv, 2011)

2.1.4 Các nghiên cứu liên quan

2.1.4.1 Các nghiên cứu liên quan trong nước

Năm 2013, Nguyễn Thị Thu Hằng đã thực hiện “Nghiên cứu nhân giống hoacam chướng bang kỹ thuật nuôi cấy in vitro” Kết quả cho thấy, môi trường MS

có bố sung 0,05 mg/l BAP + 0,1 mg/l Kinetin + 0,1 mg/l NAA cho tỉ lệ mau taocụm chồi dat 100%, hệ số nhân nhanh chồi dat 3,4 lần, chiều cao trung bình của

chồi là 4,13 cm sau 4 tuần nuôi cấy.

Năm 2015, Lê Minh Ly và cộng tác viên đã thực hiện “Tái sinh chéi cây khổqua (Momordica charantia L.) in vitro từ tử điệp” Kết quả cho thấy, tử diép đạtđược tỉ lệ tái sinh chồi 93,8% sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bé sung2,5 mg/l BA, môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l BA kết hợp 0,2 mg/l Kinetincho hiệu quả nhân chdi từ cây khổ qua tái sinh tốt nhất

Năm 2017, Lê Thị Diễm và Võ Thị Bạch Mai đã thực hiện “Ảnh hưởng củachất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự nhân nhanh chổi in vitro lan Thạch hộcthiết bi (Dendrobium officinale Kimura et Migo)” Kết qua cho thấy, đoạn thânchứa mầm ngủ nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/1 BA là môi

4

trường cho tỉ lệ tạo chổi cao Sự hình thành cụm chỗi tốt nhất trên môi trườngnuôi cay MS có bồ sung 2,0 mg/l BA + 0,4 mg/l NAA.

Năm 2018, Nguyễn Ngoc Quynh Tho và cộng tác viên đã thực hiện “Nghiêncứu tạo chổi in vitro cây hoa hồng ty muội (Rosa chinensis Jacq Var minima

Redh.)” Kết quả cho thấy, các đoạn đốt thân được khử trùng bằng dung dịch

HgCh 0,2% trong thời gian 10 phút cho tỉ lệ mẫu không nhiễm và sống sót đạt71,67% Môi trường thích hợp dé tạo chồi in vitro từ đốt thân là môi trường MS

có bố sung 2 mg/l BA kết hợp 0,5 mg/l Kinetin, 0,5 g/l than hoạt tính, pH 5,8.Sau 21 ngày nuôi cấy, tỉ lệ bật chỗi đạt 100%, số chỗi dat 3,6 chồi/mẫu, với chiềucao trung bình của chồi là 2,2 cm

Năm 2019, Nguyễn Thanh Hải và cộng tác viên đã thực hiện “Nghiên cứunhân giống in vitro thảo quả (Amomum aromaticum Roxb.)” Kết quả cho thay,

xử lí HgCl› nồng độ 0,1% trong 8 phút là thích hợp nhất cho việc khử trùng đoạn

thân ngầm mang mắt ngủ thao quả với tỉ lệ mẫu sạch bệnh và bật chồi đạt 26,67%.

Môi trường MS bé sung 1,0 mg/l BAP là thích hợp nhất trong giai đoạn nhânnhanh, với hệ số nhân là 4,13 chồi/mẫu, chiều cao chéi trung bình 5,4 em và chấtlượng chồi tốt sau 6 tuần nuôi cấy Môi trường ra rễ thích hợp cho chồi thảo qua

là MS có bổ sung 0,5 mg/l IBA với tỉ lệ ra rễ dat 100%, sé rễ trung bình đạt 5,5rễ/chồi và chiều dài rễ trung bình dat 6,1 cm sau 8 tuần nuôi cấy

Năm 2020, Nguyễn Minh Ty và Nguyễn Vinh Hiền đã thực hiện “Ảnh hưởngcủa chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo chồi và cụm chồi lan kim tuyếnnuôi cấy in vitro” Kết quả cho thấy, cây lan kim tuyến sử dụng từ đốt thân chứachồi ngủ, được nuôi cấy trên môi trường tối ưu là 0,3 mg/l Kinetin + 1 mg/l BA+ 0,1 mg/l TDZ, b6 sung các chất dinh dưỡng khác dé cảm ứng tạo chồi Tỉ lệ

mau tạo chồi đạt 87% sau 45 ngày nuôi cấy Ti lệ tạo cụm chdi là 80,05%, số

chỗi trên cụm là 9,2 chồi trên môi trường 1/2 MS kết hợp với 0,4 mg/l Kinetin +

1 mg/l BA + 0,2 mg/l TDZ Chiều cao chéi đạt §em, số đốt là 6,5 d6t/than trênmôi trường 1/2 MS kết hợp với 1,0 mg/1 BA và 0,5 mg/1NÑAA

Nam 2021, Lê Hoàng Hiệp đã thực hiện “Nghiên cứu nhân nhanh in vitro

cây ngọc ngân (Dieffenbachia sp.)” Kết quả cho thay, môi trường MS có bồ sungthêm 4 mg/l BA là môi trường thích hợp cho quá trình phát sinh chồi in vitro

=)

ngọc ngân Môi trường MS có bổ sung thêm 4 mg/l BA và 1 mg/l TDZ là môitrường tối ưu cho sự nhân nhanh của chi in vitro cây ngọc ngân.

Năm 2022, Vì Thị Xuân Thủy và cộng tác viên đã thực hiện “Nghiên cứu

quy trình nhân giống in vitro lan phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) từmắt ngủ ở thân” Kết quả cho thấy, thân lan Phi điệp tím chứa mắt ngủ khỏe mạnhđược khử trùng bằng HgCh 0,1% trong 9 phút kép (7 phút và 2 phút) đạt tỉ lệ

mẫu sông, sạch cao nhất (47,86%) Môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l BAP là

thích hợp cho quá trình tai sinh chdi từ mau cấy với tỉ lệ tái sinh chồi đạt 72,58%.Môi trường MS bồ sung 1,5 mg/l BAP kết hợp với 0,5 mg/l NAA là thích hợpcho tạo đa chéi với tỉ lệ tạo cụm chồi đạt 86,74% và số chỗi là 8,33 chồi/mẫu

2.1.4.2 Các nghiên cứu liên quan về Dieffenbachia trên thế giới

Năm 1976, Knauss đã thực hiện “A tissue culture method for producing

Dieffenbachia picta 'Perfection' free of fungi and bacteria” Két qua cho thay,trong 82 cay được thí nghiệm, có 32 dòng bi nhiễm khuẩn va nắm, còn 50 dòngcây còn lại được kiêm tra không nhiễm khuẩn và nam được giữ lại dé nhân giống

Năm 1999, Abdelhamid El-sawy và Shawky Bakheet đã thực hiện

“Propagation of Dieffenbachia through tissue culture” cho thấy hiệu quả thúc daycủa Kinetin đối với chiều dai chồi được quan sát với Dieffenbachia compacta vàDieffenbachia picta ‘Tropical’.

Năm 2001, Yulicn Miguélez Sierra va cộng tác viên đã thực hiện

“Micropropagation of Dieffenbachia picta’’ Kết quả cho thay sự hình thành chồi

từ đốt thân cây ngọc ngân có hiệu quả trong 120 ngày với sự kết hợp của BAP

(0,5 mg/l và 1,0 mg/l) và IAA (0,1 mg/1 và 1,9 mg/l).

Năm 2007, Hasan El-Shamy đã thực hiện “Improving the efficiency of

Dieffenbachia picta tropica microropagation” Kết quả cho thay cách nhân nhanhchéi tốt nhất (10 chồi/mẫu) và số rễ là 4,0 ré/chéi với chiều dài rễ là 6,48 cm khi

bổ sung 4 g/l dich chiết mạch nha kết hợp (16 2ip + 2 mg/l IAA + 1 DPU mg/l),cây con thích nghỉ thành công (ti lệ sống 95%) trong rêu than bùn và cát (1:1)

Năm 2013, Mohamed Elsheikh và cộng tác viên đã thực hiện “Un vitro

micropropagation of the ornamental plant dieffenbachia — a review” là một bai

tong quan tóm tắt các tài liệu có giá trị về kĩ thuật in vitro bao gồm các loại mẫu

6

cay được sử dụng, môi trường được tối ưu hoá, cách nhân giống và cải tiến qua

45 năm nghiên cứu về Dieffenbachia spp

Năm 2015, Honsi Hassan và Sherief Abdallah đã thực hiện “Jn Vitro

Micro-propagation of Cordyline and Dieffenbachia Plants” Kết quả cho thấy, ở nồng

độ 2,0 mg/l BA kết hợp với 0,1 mg/l NAA, Diffenbachia picta "Tropica" có sựtăng đáng ké là 2,66 chồi bên, chiều cao chéi bên là 5,66 cm, số lá là 9,88 lá vàchiều cao chồi đỉnh là 8,66 cm Ở nồng độ 1,0 mg/l NAA ghi nhận cao nhất về

số rễ là 8,00 rễ và chiều dài rễ là 8,53 cm, cây con đã ra rễ được nuôi cấy trongrêu than bùn, đá perlite, đá vermiculite và cát (1:1:1:1) với tỉ lệ mẫu sống là 95%

Năm 2017, Ananya Banerjee và cộng tác viên đã thực hiện “Diseases of

Dieffenbachia spp Caused Fungi, Bacteria, Viruses and Nematodes: A Review”.

Két qua cho thay các loài thuộc chi Dieffenbachia bi bệnh bởi 5 loại nam, 3 loại

vi khuẩn, 6 loại virus và 2 loại tuyến trùng

Năm 2018, Syamjith và cộng tác viên đã thực hiện “Dieffenbachia: benefits

vs risks of a household ornamental plant — a review” Kết quả nghiên cứu chothay Dieffenbachia có độc với động vật và con người, nhưng cũng phát hiệnDieffenbachia có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau như tác dụng chống vi khuẩn

và tác dụng chống ung thư cần được đánh giá về rủi ro cũng như tìm hiểu rõ hơn

để ứng dụng các hoạt chất sinh học một cách chủ động

Năm 2021, Samaneh Bandehali và cộng tác viên đã thực hiện “Current state

of indoor air phytoremediation using potted plants and green walls” Kết qua chothay sử dụng các loài thực vat trong đó có các loài thuộc chi Dieffenbachia rất cóhiệu quả loại bỏ không khí ô nhiễm, cải thiện chất lượng không khí trong nhà.2.2 Giới thiệu về nuôi cay mô tế bao thực vật

2.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bảo thực vật là phương pháp nuôi cấy vô trùng các tế bào,

mô, cơ quan hoặc những bộ phận khác của cây dưới điều kiện vật lý và hoá họcđược xác định trong ống nghiệm (Thorpe, 2007) Các báo cáo đầu tiên về nuôicay mô tế bao thực vật từ những năm đầu thé ki 20 khi Gottlieb Haberlandt thựchiện các thí nghiệm dé duy trì các tế bào trung mô trong môi trường nuôi cay dựatrên các ý tưởng được đề xuất thiết lập “tính toàn năng của tế bào thực vật”

(García-Gonzáles và ctv, 2010) Tính toàn năng là khả năng của tế bào soma tồn

tại độc lập, phân chia và cuối cùng tạo thành một cây hoàn chỉnh - một tính năng

quan trọng của tế bào thực vật góp phần cho nghiên cứu phát triển công nghệsinh học thực vat (Georgiev va ctv, 2009).

Phuong pháp nuôi cay mô thực vat sử dung đỉnh sinh trưởng, chéi, các mô,

cơ quan khác như rễ, thân, lá hoặc hoa đã tách rời ra khỏi cơ thể thực vật đưa vàomôi trường có bổ sung các chất dinh dưỡng thích hợp như là muối khoáng,vitamin, đường và các chất điều hoà sinh rưởng thực vật trong điều kiện vô trùng(Dương Công Kiên, 2002) dé chúng trở lại trang thái chưa phân hoá có khả năngphân chi tế bào và biệt hoá thành mô, co quan phát triển thành cây con mới Tat

cả mọi tế bào của một cơ thê thực vật đều có chứa bộ gen giống hệt nhau nên khi

tế bào được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng thích hợp thì tế bào có thê tựtông hợp những loại protein và enzyme dé nuôi sống tế bào và phát triển thànhcây hoàn chỉnh Vào năm 2020, Hà Thị Mỹ Ngân và cộng tác viên cho biết, khitính toàn năng của tế bào thực vật được thiết lập và một sé lượng lớn thực vat đãđược tái tạo bắt đầu từ những mảnh nhỏ của các mô sinh dưỡng ở điều kiện vôtrùng thì nuôi cấy mô được đã dự đoán là một phương pháp thay thế tiềm năng

dé nhân giống thực vật một cách nhanh chóng Nhân giống vô tính thực vật invitro hay còn được gọi là vi nhân giống đã tạo nên một cuộc cách mạng trongkhoa học công nghệ và đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới dé nhân giống

các loại cây cảnh, cây ăn quả và cây rừng.

Nuôi cây mô, tế bào và cơ quan thực vật hiện nay đã trở thành một phươngpháp nhân giống chuẩn và phô biến Trong sản xuất số lượng cây giống sạch bệnhvới tốc độ nhanh, chất lượng đồng đều và đồng nhất về mặt di truyền bởi cónhững lợi thế vượt trội so với các phương pháp nhân giống vô tính thông thường(Hà Thị Mỹ Ngân và ctv, 2020) Ngoài ra, nuôi cấy mô tế bào thực vật còn giúpbảo tồn và tái sinh những giống cây quý hiểm bị nhiễm bệnh hoặc thoái hoá, tạo

ra được cái giống cây khoẻ mạnh, có phâm chất tốt như mong muốn

2.2.2 Ý nghĩa của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật có khả năng cung cấp nguồn cây giống với sốlượng lớn trong khoảng thời gian ngắn cho thị trường Các cây giống được tạo ra

đồng nhất về mặt di truyền nên có thé giữ được nhiều phẩm chat quý và giá trị.Hon thế nữa, bằng phương pháp này, trong một thời gian ngắn có thé tạo ra đượcmột lượng sinh khối lớn có khả năng tông hợp các hợp chất thứ cấp phục vụ cho

y học hoặc công nghiệp thực phẩm

2.2.3 Các giai đoạn nhân giống in vitro

Khử trùng mẫu cấy: đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quá trìnhnhân giống in vitro Mau cay có thé là đỉnh sinh trưởng, chỗi, hoa, hạt, lá, thân,

rễ, củ hoặc các mô, cơ quan khác, quá trình khử trùng mẫu cay la mot ky thuatkhó, không thé đạt 100% mẫu vô trùng, vi vậy can phải tìm hiểu và ứng dụng cácchất khử trùng và điều chỉnh thời gian khử trùng thích hợp cho từng loại mẫu, từ

đó mới nâng cao được tỉ lệ song sạch của mẫu cấy Việc lựa chọn vật liệu ban

đầu rất quan trọng, không nên chọn mẫu quá non hoặc quá già, cây trồng đượcchọn làm vật liệu khử trùng cần được cách ly 2 - 3 ngày đề hạn chế tối đa các tácnhân gây nhiễm nam và nhiễm khuẩn Quá trình này sử dụng các chất hoá học cótính diệt nắm, diệt khuẩn, các chất này phải dễ tìm kiếm trên thị trường, có giáthành rẻ, không gây độc với mẫu cấy cũng như người thao tác Sau khi xử lý mẫucay với chat diệt nấm diét khuẩn thi phải rửa sạch mẫu với nước cất nhiều lần vàloại bỏ những phân bị tôn thương bởi chất khử trùng rồi mới đưa vào môi trườngnuôi cấy (Trần Thị Dung, 2003)

Tái sinh mẫu nuôi cấy: ở gian đoạn này, mẫu cấy có sự tái sinh một cách cóđịnh hướng, bằng việc điều chỉnh các chất điều hoà sinh trưởng thực vật ngoạisinh đưa vào môi trường nuôi cay Ngoài ra, khi khử trùng thì cần quan tâm đếntuôi sinh lý của mẫu cấy, nếu mau quá non thì khi khử trùng mau cấy rat dé bitốn thương, gây ngộ độc dẫn đến chết mẫu cấy, nếu mẫu cấy quá già thì khó cókhả năng tái sinh vì mẫu đã phân hoá thành một mô hoặc một cơ quan của cây(Trần Thị Dung, 2003)

Nhân nhanh mẫu nuôi cấy: quá trình này này được xem là giai đoạn then chốtquyết định số lượng cây có thé tạo ra, dé tăng hệ số nhân thì cần bổ sung thêmvào môi trường nuôi cấy các chất điều hoà sinh trưởng như là auxin, cytokiningiúp kích thích chồi bất định hoặc phát triển chồi bên từ mẫu cấy, ngoài ra tùythuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, số lượng cây tạo thành cũng phụ thuộc vào

số lần cay chuyén, cac yếu tố độ âm, nhiệt độ và ánh sáng cũng cần được chú ý

(Trần Thị Dung, 2003)

Tạo cây hoàn chỉnh: khi các chỗồi đạt được chiều cao nhất định, các mẫu cumchỗi sẽ được tach ra thành những chdi riêng lẻ và cấy vào môi trường tạo rễ, ởgiai đoạn này môi trường nuôi cấy thường được bồ sung chất điều hoà sinh trưởng

là Auxin giúp kích thích tạo rễ phụ từ chồi nuôi cấy, tuỳ thuộc vào từng loại cây

mà thời gian ra rễ phụ của chồi sẽ khác nhau Thường 2 - 3 tuần thì các chồi riêng

lẻ sẽ xuất hiện rễ và tạo thành cây con hoàn chỉnh (Trần Thị Dung, 2003)

Dua cây in vitro ra dat: đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình vi nhângiống, cây hoàn chỉnh được nuôi cấy in vitro sẽ được đưa ra trong ngoài vườnươm, cũng là giai đoạn khó khăn nhất trong vi nhân giống vi cây in vitro đượcnuôi cấy trong điều kiện 6n định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ âm thíchhợp Khi chuyên ra ngoài vườn ươm, có điều kiện tự nhiên khác hoàn toàn vihàm lượng dinh dưỡng trong đất thấp và có nhiều vi khuân và nắm gây bệnh,nhiệt độ và cường độ ánh sáng cao, độ 4m thấp những điều này sẽ làm cây bị sốcmôi trường và gây chết cây Vì vậy, ở giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh thường sẽgiảm bớt hàm lượng dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để tạo điều kiện thiếudinh dưỡng giúp cây kích thích tạo rễ nhanh hơn để tìm kiếm dinh dưỡng và thíchnghỉ, tránh bị sốc khi chuyên ra vườn ươm, đồng thời phải thiết kế vườn ươm gầngiống với điều kiện nuôi cấy in vitro dé cây quen dan và phát triển khoẻ mạnh.(Tran Thị Dung, 2003)

2.2.4 Các thành phan trong môi trường nuôi cấy

Một trong những yếu tố quan trọng trong sự tăng trưởng và phát triển hình

thái của tế bào, mô, cơ quan thực vật đó là môi trường nuôi cấy Môi trườngMurashige và Skoog (Murashige và Skoog, 1962) hoặc môi trường MS là một

trong những loại môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy tế bàothực vật Đây là môi trường khởi đầu cho mọi quá trình nuôi cấy vì nó thích hợpcho nhiều loại cây Thành phần và nồng độ các chất trong môi trường nuôi cây

có thể thay đổi theo từng loại thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan nhưng môitrường nuôi cấy thường bao gồm các thành phần như khoáng đa lượng, khoáng

vi lượng, vitamin, đườn làm nguôn carbon, chât điêu hoà sinh trưởng, agar.

10

Khoáng đa lượng rất cần cho cây và có ảnh hưởng rất tốt cho sự hấp thu từcác mẫu cấy Nhu cầu khoáng đa lượng của mô, tế bào thật vật không khác nhiều

SO VỚI cay trong tự nhiên như nito (N), kali (K), magie (Mg) va canxi (Ca)(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thi Thủy Tiên, 2002)

Khoáng vi lượng là khoáng mà cây trồng chỉ cần ít nhưng không thé thiếucho sự sinh trưởng và phát triển Tuy nhiên có một số trường hợp, một số khoáng

vi lượng là không cần thiết Các khoáng vi lượng thường dùng trong nuôi cấy mônhư mangan (Mn), boron (B), kẽm (Zn), đồng (Cu), cobalt (Co), molybden (Mo)

và idodine (I) (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thi Thủy Tiên, 2002).

Thực vật cần vitamin cho sự tăng trưởng và phát triển, xúc tác các quá trìnhbiến dưỡng khác nhau các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôicấy mô là thiamine (B1), pyridoxine (B6), glycine, nicotinic acid và myo-inositol(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Các mẫu tế bào, mô nuôi cấy không thể quan hợp hoặc quang hợp rất thấp

do thiếu clorophin, nong độ CO» va nhiều điều kiện khác Vi vậy, hợp chấtcarbohydrate được đưa vào thành phần nuôi cấy Đường được sử dụng phô biến

vì vừa là nguồn carbohydrate cung cấp cho mẫu cấy vừa điều chỉnh khả năngthấm thấu của môi trường (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).Chất điều hoà sinh trưởng thực vật là hợp chất hữu cơ có vai trò quan trọngtrong quá trình phát sinh hình thái thực vật, có hai loại chất điều hoà sinh trưởngthực vật là tự nhiên (do thực vật tự tổng hợp) và nhân tạo Hiệu quả của chất điềuhoà sinh trưởng thực vật phụ thuộc vào nồng độ sử dụng, mẫu nuôi cay va hoattính vốn có của chúng Ở mỗi giai đoạn nuôi cấy thì điều chỉnh chất điều hoà sinhtrưởng dé kích thích quá trình sinh trưởng, phát triển và phân hoá các cơ quan làmột điều cần thiết Auxin và cytokinin là hai nhóm chất điều hoa sinh trưởngthường được sử dụng trong nuôi cay mô thực vật

Auxin là nhóm chất điều hoa sinh trưởng thực vật thúc day sự sinh trưởng vàgiãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất Auxin

tự nhiên được tìm thấy ở thực vật la indole - 3 - acetic acid (IAA), auxin tổng hợp

là 2,4 - dichlorphenolxyacetic acid (2,4-D), a - napthanlene acetic acid (NAA) và

indole - 3 - butyric acid (IBA) Auxin thường được bổ sung vào môi trường nuôi

11

cấy dé cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu cấy, 2,4-D là loại chất điều hòa sinh trưởngauxm được sử dụng cho mục đích này, sự tạo chéi và rễ từ mô seo đòi hỏi cầnphải có sự điều chỉnh lại nồng độ auxin và cytokinin cảm ứng ban đầu Khi nồng

độ chất điều hòa sinh trưởng cytokinin cao hơn chất điều hòa sinh trưởng auxin

thì sẽ có sự tạo chéi từ mẫu cấy Ngược lại, khi nồng độ chất điều hòa sinh trưởng

auxin cao hơn chất điều hòa sinh trưởng cytokinin thì rễ được hình thành

Cytokinin là nhóm chất điều hoà sinh trưởng thực vật kích thích sự phân chia

tế bào mạnh mẽ nên cytokinin được xem là các chất hoạt hóa phân chia tế bào,

có được hiệu quả này là do cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ sự tổng hợp axit nucleic

và protein Zeatin là cytokinin tự nhiên được được trích từ hạt bắp nảy mầm,cytokinin tổng hợp là BA (benzyl adenin), Kinetin (6-furfuryaminopurine), TDZ(thidiazuron) Hình thành và sinh trưởng của chồi, ức chế sự tạo rễ khi được bổsung vào môi trường nuôi cấy chồi thì những hợp chất này phá vỡ trạng thái ngủcủa chỗi ngọn và kích thích sự hoạt động của các chỗi bên va cytokinin giúp quá

trình tạo sẹo hình thành nhanh hơn.

Agar: Việc làm đông môi trường nuôi cấy dựa vào hợp chất polysaccharidecao phân tử vì giữ được nước và môi trường khoáng cung cấp cho cây, hợp chấtthường được dùng là phytagel hoặc agar Trong nuôi cấy mô thực vật, agarthường được sử dụng nhiều hơn vì agar trơ không chịu tác dụng nhiều bởi cácphan ứng hoá học, tính 6n định cao và giá thành cũng rẻ

12

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 07 năm 2022 đến tháng 07 năm 2023 tại chinhánh Công Ty Cô Phần Công Nghệ Sinh Học TPECO, số 178A đường Nguyễn

Ái Quốc, Thành phố Biên Hoà, tỉnh Đồng Nai

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cây ngọc ngân và vật liệu nghiên cứu là đốt thâncây ngọc ngân Cây ngọc ngân được mua tại vựa kiếng và đem về trồng tại vườnươm của chỉ nhánh Công Ty Cổ Phần Công Nghệ Sinh Học TPECO Sau quátrình thay giá thé mới và chăm sóc tại vườn ươm khoảng một tháng thì tiến hành

chọn những đoạn thân cây ngọc ngân không quá non cũng không quá già, khoẻ

mạnh, không bị sâu bệnh, cắt những đoạn thân cây trên bề mặt đất trồng, loại bỏ

hết lá dé sử dụng làm nguyên liệu cho thí nghiệm khử trùng mẫu đốt thân

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

Đề tài sử dụng thiết bị và dụng cụ có san tại chi nhánh Công Ty Cổ Phan

Công Nghệ Sinh Học TPECO gồm tủ cấy vô trùng, nồi hấp khử trùng, tủ lạnh,

máy khuấy từ, cân kỹ thuật, máy đo pH, máy điều hoà nhiệt độ, đèn led nuôi cấy,

kệ nuôi cấy, bình thủy tinh, bình tam giác, bình nuôi cấy, bình xỊt cồn, đèn cồn,

dao cấy, đĩa cấy, giấy cấy, kéo, kẹp, bông gòn, găng tay

3.2.3 Hóa chất và môi trường nuôi cấy

Sử dụng javel (chứa NaCIO 5%) cho quá trình khử trùng mẫu đốt thân câyngọc ngân và hóa chất khác gồm dung dich sunlight, 0,5 ml Tween 80 và cồn 70°

để tạo được nguồn mẫu vô trùng thực hiện cho các thí nghiệm tiếp theo Bồ sungchất điều hòa sinh trưởng Kinetin cho quá trình phát sinh chồi từ mẫu đốt thân

đã vô trùng giúp mẫu đốt thân đạt được tỉ lệ mẫu phát sinh chéi cao, bổ sung chấtđiều hòa sinh trưởng BA cho quá trình nhân nhanh cụm chồi từ mẫu đốt thân đãphát sinh chồi Môi trường dinh dưỡng MS (Muraskige và Skoog, 1962) có bổsung 30 g/l đường và 5,0 g/l agar được sử dung làm môi trường nuôi cấy, giá trị

pH của môi trường nuôi cấy trước khi hấp khử trùng khoảng 5,7 - 5,8 Thể tích

13

dung dich môi trường nuôi cấy trong bình nuôi cấy là 30 - 35 ml/bình Môi trườngnuôi cấy được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1,2 atm trong 18 phút.Bảng 3.1 Thành phần hoá chất môi trường MS

Thành phần Hoá chất Nồng độ (mg/l)

KNO3 1900

NH4NOs 1650 Khoáng đa lượng MgSO.7Ha0 370

CaCl2.2H20 440

KH:PO¿ 170

CoCl2.6H20 0,025 CuSO4.5H20 0,025 H3BO3 6,20

Khoáng vi lượng KI 0,83

MnSOx.4H2O 22,30 NazMoOx.2HzO 0,25 ZnSOu.7HaO 8,60

3.2.4 Diéu kién nudi cay

Điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy, đầu tiên về thời gian chiếu sángtrung bình 16 giờ/ngày và cường độ chiếu sáng thích hợp là 15 W/m?/s, sử dungđèn led để cung cấp ánh sáng thiết yếu cho mẫu nuôi cấy Tiếp theo, nhiệt độ đềmẫu nuôi cấy phát triển khoẻ mạnh trong môi trường nuôi cấy là từ 25°C đến28°C, dé duy trì nhiệt độ 6n định trong phòng nuôi cấy cần có sự hỗ trợ của máyđiều hòa nhiệt độ Cuối cùng, độ ẩm trung bình giữ ở mức 60 - 80% sẽ phù hợp

14

nhất, tránh mẫu không bị mắt nước trong quá trình nuôi cấy, nếu độ âm vượt quá80% can sự dụng quạt hút không khí dé điều chỉnh lại độ ẩm về lại ban đầu.

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Khảo sát nồng độ khử trùng javel xử lý đốt thân cây ngọc ngân

Mục đích: xác định được nồng độ javel (%) thích hợp nhất đề tạo mẫu vôtrùng từ đốt thân cây ngọc ngân với tỉ lệ mẫu song sach cao, tao nguon vat liéucho thi nghiệm phát sinh chdi

Các bước tiến hành: các đoạn than của cây ngọc ngân được tia dưới vòi nước,

ngâm trong dung dich sunlight pha loãng trong 15 phút, sau đó mẫu được khử

trùng sơ bộ với cồn 70° trong vòng 5 phút và rửa lại với nước cất vô trùng 3 lần,mỗi lần 5 phút Các thao tác tiếp theo được thực hiện trong tủ cấy vô trùng Rửamẫu thân bằng cồn 70° trong 30 giây và rửa lại nước cất vô trùng 3 lần, mỗi lần

5 phút Đã có nhiều thí nghiệm khử trùng mẫu bằng javel như mẫu cây ngọc ngânđược lắc trong dung dịch Javel 10% trong thời gian 10 phút (Knauss, 1976) Trên

cơ sở đó ở thí nghiệm này, mẫu thân được lắc đều bằng dung dịch khử trùng javelvới các nồng độ khác nhau (được bồ sung với 0,5 ml Tween 80) trong thời gian

10 phút rồi rửa lại với nước cất vô trùng 3 lần, mỗi lần 5 phút Cuối cùng, cắtthành từng đốt có chiều cao 1 - 1,5 cm chứa mắt ngủ và cấy vào môi trường MS.Bảng 3.2 Nồng độ javel (%) đến quá trình khử trùng mẫu

Nghiệm thức Môi trường Javel (%) Mẫu/lân lặp lại

Chỉ tiêu theo dõi:

Thời gian ghi nhận sô liệu là 2 tuân sau khi nuôi cây.

15

số mẫu sống và không nhiễm

Tỉ lệ mẫu sống sạch (%) = °b 8 Š£ ( 0) 3; số mẫu nghiệm thức

Tình trạng mẫu: Theo dõi màu sắc và hình dáng

3.3.2 Khảo sát nồng độ Kinetin lên sự phát sinh chồi từ mẫu đốt thân

Mục đích: xác định được nồng độ Kinetin thích hợp cho sự phát sinh chổi từmẫu đốt thân của cây ngọc ngân với tỉ lệ phát sinh chồi cao nhất

Cách tiến hành: sử dụng mẫu đốt thân sống sạch của cây ngọc ngân ở thínghiệm 1 có hiện tượng cảm ứng phát sinh chdi, tiến hành cấy nào môi trường

MS cơ bản có bồ sung 1,0 mg/l IBA kết hợp với chất điều hoà sinh trưởng Kinetinvới các nồng độ khác nhau tuỳ theo từng nghiệm thức

Bang 3.3 Nong độ Kinetin (mg/l) đến tạo chồi từ mẫu đốt thân

Nghiệm thức Môi trường Kinetin (mg) Mẫu/lân lặp lại

Chỉ tiêu theo dõi:

Thời gian ghi nhận số liệu là 4 và 8 tuần sau khi nuôi cấy

3 số mẫu phát sinh chồi

Tỉ lệ mẫu phát sinh chổi (%) = x100

3 số mẫu nghiệm thức

3; chiều cao chồi

Chiều cao trung bình của chdi (cm) = -8 ( ) 3 số mẫu nghiệm thức

Thời gian mẫu phát sinh chồi (ngày): thời gian ghi nhận khi mẫu bắt đầu có

hiện tượng cảm ứng tạo chôi.

16

Tình trạng mẫu: Theo dõi hình dáng và màu sắc.

3.3.3 Khảo sát nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh cụm chồi

Mục đích: xác định được nồng độ BA thích hợp cho sự nhân nhanh cụm choi

từ mau đã phát sinh chỗồi của cây ngọc ngân với số chồi cao nhất

Cách tiến hành: Sử dụng những mẫu phát sinh chdi ở thí nghiệm 2 có chiềucao chồi trung bình từ 1,0 — 1,5 em, có thân màu xanh lá, chắc khoẻ, cấy nào môitrường MS cơ bản có bồ sung 0,4mg/1 Kinetin và chất điều hoà sinh trưởng BAvới các nồng độ khác nhau tuỳ theo từng nghiệm thức

Bảng 3.4 Nong độ BA (mg/I) đến quá trình nhân nhanh cụm chồi

Nghiệm thức Môi trường BA (mg/l) Mẫu/lần lặp lại

Chỉ tiêu theo dõi:

Thời gian ghi nhận số liệu là 2, 4, 6, § tuần sau khi nuôi cấy

x & 3 Res 3; chiều cao choi

Chiêu cao trung bình của choi (em) =c——————

3; số mẫu thí nghiệm

3 số lá

Số lá trung bình của chéi (14) = ——=————8 ( ) 3 số chồi thí nghiệm

Số chéi trung bình mỗi nghiệm thức (chdi) = a

Tinh trạng mau: Theo dõi hình dang và màu sắc

CHƯƠNG 4 KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Nồng độ khử trùng javel xử lý mẫu đốt thân cây ngọc ngân

Bat kỳ cây trồng nào khi nuôi cấy in vitro đều cần có quá trình vô trùng mẫu

và javel là chất được sử dụng phô biến trong việc khử trùng mẫu thực vật vì giáthành rẻ, mang lại hiệu qua cao, ít ảnh hưởng đến sức khoẻ của con người và détìm thấy trên thị trường Tuy nhiên do thành phan chính của javel là NaClO, mộtchất oxi hoá mạnh, khi sử dụng ở nồng độ cao sẽ gây phá huỷ tế bào dẫn đến hiệntượng chết mẫu cần được nuôi cây (Nguyễn Thị Kiều Linh và ctv, 2021)

Bảng 4.1 Ảnh hưởng nồng độ khử trùng javel sau 2 tuần nuôi cấy

Nghiêm Javel Tỉ lệ mẫu Tỉ lệ mẫu Tỉ lệ mẫu Tỉ lệ mẫu

LẠ oe (%) song sach sốngnhiễm chét sach chét nhiém

“ ‘ (%) (%) (%) (%)

AI 5% 66,67%¢ 33,332 0,00° 0,00° A2 10% 85,718 14,29% 0,00° 0,00° A3 15% 71,422 14,29%¢ 14,292 0,00°

A4 20% 57,14° 0,00° 19,05 23,813 A5 25% 47,62° 0,00° 19,058 33,332

% CV 6,96 24,57 15,87 16,83

Trong cùng một cột và cùng yêu tô ảnh hưởng, các giá trị trung bình có ki tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về mặt thông kê (P < 0,01) Các so liệu tỉ lệ được chuyên doi theo công thức aresin(x)!2 trước khi xử lý thong kê.

Sau 2 tuần nuôi cay, sự khác nhau về nồng độ khử trùng Javel đã cho ra tỉ lệ

mẫu sống sạch khác nhau Ở nghiệm thức A2 (javel 10%) cho thấy tỉ lệ mẫu sốngsạch cao nhất là 85,71% không có khác biệt về mặt thống kê so với nghiệm thức

Al và A3 nhưng có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với nghiệmthức còn lại, kết quả này giống với kết quả của La Việt Hồng và ctv (2017), khửtrùng bề mặt chồi non thu từ củ hoàng tinh hoa đỏ (Polygonatum kingianum Coll

ex Hemsl.) là cồn 70% trong thời gian 15 phút, dung dich javel 10% trong thờigian 15 phút, cho tỉ lệ mẫu sạch cao nhất là 50% Hơn thế nữa, kết quả này còngiống với quá trình vô mẫu hạt của cây chùm ngây (Moringa spp.), mẫu hat đạt

tỉ lệ sống cao nhất khi được khử trùng bằng HgCh 0,1% trong 2 phút và dungdịch NaClO 10% trong vòng 10 phút (Trương Thị Hồng Hải và ctv, 2016) va hạtcây thanh long ruột đỏ (Hylocereus polyrhizus) được khử trùng bằng javel 10%

18

trong 10 phút cho tỉ lệ sống cao nhất (Đặng Văn Tùng và Nguyễn Trần Đông

Phương, 2014) Khi quan sát tại thời điểm 2 tuần nuôi cấy, tỉ lệ mẫu sống sạch

có xu hướng giảm dan từ nghiệm thức A3 đến nghiệm thức A5 (Bang 4.1) đồngnghĩa với việc mẫu chết tỉ lệ thuận với nồng độ javel

Bảng 4.2 Tình trạng mẫu đốt thân sau 2 tuần nuôi cấy

Nghiệm thức Javel (%) Đặc điểm hình thái

Mau dot thân có màu xanh lá đậm, mặt ở trên của

Al 5 mẫu cay mat màu xanh lá dần chuyền sang mau nâu,

có nhiều mẫu nhiễm nắm và khuẩn

Mẫu đốt thân có màu xanh lá đậm, có hiện tượngA2 10 cảm ứng tạo chỗồi, mặt ở trên của mẫu cây mat mau

xanh lá dần chuyển sang màu nâu

Mẫu đốt thân có màu xanh lá đậm, có hiện tượngA3 15 cảm ứng tạo chỗồi, mặt ở trên của mẫu cây mat màu

xanh lá dần chuyển sang màu nâu

Mẫu đốt thân có màu xanh lá đậm, có một vài mẫu

A4 20 , x Ề

đốt thân bi nhiễm khuân và chết.

Mẫu đốt thân có màu xanh lá đậm, có một vài mẫu

A5 25 , : : j

dot than bi nhiém khuan va chét.

Đối với nghiệm thức Al (javel 5%) có số mẫu nhiễm tương đối cao bằng 1/3

số mẫu nghiệm thức là 33,33% (Bảng 4.1) Kết quả này thấp hơn với kết quả của

La Việt Hồng và cộng tác viên (2021), mẫu cành chứa mắt ngủ và đốt thân bánh

tẻ của cây lùng (Bambusa spp.) ở nồng độ javel thấp (5%) tỉ lệ mẫu nhiễm cao,dao động từ 83,34 đến 94,45 (%), tỉ lệ mẫu sạch sống cũng rất thấp Bên cạnh đó,khi khử trùng củ hoa tuyết điểm (Galanthus elwesii Hook) ở nồng độ javel 3%thì mẫu bị nhiễm 100% (Caglar Kaya và ctv, 2022) Do nồng độ khử trùng củajavel thấp, tính sát khuẩn bi pha loãng nên chỉ sát khuẩn được bề mặt của mẫu

19