DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 07 năm 2022 đến tháng 07 năm 2023 tại chi nhánh Công Ty Cô Phần Công Nghệ Sinh Học TPECO, số 178A đường Nguyễn Ái Quốc, Thành phố Biên Hoà, tỉnh Đồng Nai.
3.2. Vật liệu nghiên cứu
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là cây ngọc ngân và vật liệu nghiên cứu là đốt thân cây ngọc ngân. Cây ngọc ngân được mua tại vựa kiếng và đem về trồng tại vườn ươm của chỉ nhánh Công Ty Cổ Phần Công Nghệ Sinh Học TPECO. Sau quá trình thay giá thé mới và chăm sóc tại vườn ươm khoảng một tháng thì tiến hành
chọn những đoạn thân cây ngọc ngân không quá non cũng không quá già, khoẻ
mạnh, không bị sâu bệnh, cắt những đoạn thân cây trên bề mặt đất trồng, loại bỏ hết lá dé sử dụng làm nguyên liệu cho thí nghiệm khử trùng mẫu đốt thân.
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Đề tài sử dụng thiết bị và dụng cụ có san tại chi nhánh Công Ty Cổ Phan Công Nghệ Sinh Học TPECO gồm tủ cấy vô trùng, nồi hấp khử trùng, tủ lạnh, máy khuấy từ, cân kỹ thuật, máy đo pH, máy điều hoà nhiệt độ, đèn led nuôi cấy,
kệ nuôi cấy, bình thủy tinh, bình tam giác, bình nuôi cấy, bình xỊt cồn, đèn cồn,
dao cấy, đĩa cấy, giấy cấy, kéo, kẹp, bông gòn, găng tay.
3.2.3. Hóa chất và môi trường nuôi cấy
Sử dụng javel (chứa NaCIO 5%) cho quá trình khử trùng mẫu đốt thân cây ngọc ngân và hóa chất khác gồm dung dich sunlight, 0,5 ml Tween 80 và cồn 70°
để tạo được nguồn mẫu vô trùng thực hiện cho các thí nghiệm tiếp theo. Bồ sung chất điều hòa sinh trưởng Kinetin cho quá trình phát sinh chồi từ mẫu đốt thân đã vô trùng giúp mẫu đốt thân đạt được tỉ lệ mẫu phát sinh chéi cao, bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA cho quá trình nhân nhanh cụm chồi từ mẫu đốt thân đã phát sinh chồi. Môi trường dinh dưỡng MS (Muraskige và Skoog, 1962) có bổ sung 30 g/l đường và 5,0 g/l agar được sử dung làm môi trường nuôi cấy, giá trị pH của môi trường nuôi cấy trước khi hấp khử trùng khoảng 5,7 - 5,8. Thể tích
13
dung dich môi trường nuôi cấy trong bình nuôi cấy là 30 - 35 ml/bình. Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1,2 atm trong 18 phút.
Bảng 3.1. Thành phần hoá chất môi trường MS
Thành phần Hoá chất Nồng độ (mg/l) KNO3 1900
NH4NOs 1650 Khoáng đa lượng MgSO.7Ha0 370
CaCl2.2H20 440
KH:PO¿ 170
CoCl2.6H20 0,025 CuSO4.5H20 0,025 H3BO3 6,20
Khoáng vi lượng KI 0,83
MnSOx.4H2O 22,30 NazMoOx.2HzO 0,25
ZnSOu.7HaO 8,60 Na2EDTA.2H20 37,3 Fe -EDTA
FeSO,4.7H20 27,8 Glycine 2,0 Myo-Inositol 10,0
Vitamin Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Thiamine-HCI 0,1
3.2.4. Diéu kién nudi cay
Điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy, đầu tiên về thời gian chiếu sáng trung bình 16 giờ/ngày và cường độ chiếu sáng thích hợp là 15 W/m?/s, sử dung đèn led để cung cấp ánh sáng thiết yếu cho mẫu nuôi cấy. Tiếp theo, nhiệt độ đề mẫu nuôi cấy phát triển khoẻ mạnh trong môi trường nuôi cấy là từ 25°C đến 28°C, dé duy trì nhiệt độ 6n định trong phòng nuôi cấy cần có sự hỗ trợ của máy điều hòa nhiệt độ. Cuối cùng, độ ẩm trung bình giữ ở mức 60 - 80% sẽ phù hợp
14
nhất, tránh mẫu không bị mắt nước trong quá trình nuôi cấy, nếu độ âm vượt quá 80% can sự dụng quạt hút không khí dé điều chỉnh lại độ ẩm về lại ban đầu.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Khảo sát nồng độ khử trùng javel xử lý đốt thân cây ngọc ngân
Mục đích: xác định được nồng độ javel (%) thích hợp nhất đề tạo mẫu vô trùng từ đốt thân cây ngọc ngân với tỉ lệ mẫu song sach cao, tao nguon vat liéu cho thi nghiệm phát sinh chdi.
Các bước tiến hành: các đoạn than của cây ngọc ngân được tia dưới vòi nước, ngâm trong dung dich sunlight pha loãng trong 15 phút, sau đó mẫu được khử
trùng sơ bộ với cồn 70° trong vòng 5 phút và rửa lại với nước cất vô trùng 3 lần, mỗi lần 5 phút. Các thao tác tiếp theo được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Rửa mẫu thân bằng cồn 70° trong 30 giây và rửa lại nước cất vô trùng 3 lần, mỗi lần 5 phút. Đã có nhiều thí nghiệm khử trùng mẫu bằng javel như mẫu cây ngọc ngân được lắc trong dung dịch Javel 10% trong thời gian 10 phút (Knauss, 1976). Trên cơ sở đó ở thí nghiệm này, mẫu thân được lắc đều bằng dung dịch khử trùng javel với các nồng độ khác nhau (được bồ sung với 0,5 ml Tween 80) trong thời gian 10 phút rồi rửa lại với nước cất vô trùng 3 lần, mỗi lần 5 phút. Cuối cùng, cắt thành từng đốt có chiều cao 1 - 1,5 cm chứa mắt ngủ và cấy vào môi trường MS.
Bảng 3.2. Nồng độ javel (%) đến quá trình khử trùng mẫu
Nghiệm thức Môi trường Javel (%) Mẫu/lân lặp lại
AI MS 5 7 A2 MS 10 7 A3 MS 15 7 A4 MS 20 7 A5 MS 25 7
Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn nhân tố với 5 nghiệm thức là A1, A2, A3, A4, A5 với 3 lần lặp lại, mỗi lần 7 mẫu. Tổng số mẫu thí nghiệm là 105 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi:
Thời gian ghi nhận sô liệu là 2 tuân sau khi nuôi cây.
15
số mẫu sống và không nhiễm
Tỉ lệ mẫu sống sạch (%) = °b 8 Š£ ( 0) 3; số mẫu nghiệm thức
Ð số mau sống va nhiễm
Tỉ lệ mẫu sống nhiễm (%) = x100
¥s6 mẫu nghiệm thức 3 số mẫu chết và không nhiễm
Ti lệ mẫu chết sạch (%) = x100
¥s6 mẫu nghiệm thức Py ee k “x số mẫu chết va nhiễm
Ti lệ mau chêt nhiễm (%) = 100
3 số mẫu nghiệm thức
Tình trạng mẫu: Theo dõi màu sắc và hình dáng.
3.3.2. Khảo sát nồng độ Kinetin lên sự phát sinh chồi từ mẫu đốt thân
Mục đích: xác định được nồng độ Kinetin thích hợp cho sự phát sinh chổi từ mẫu đốt thân của cây ngọc ngân với tỉ lệ phát sinh chồi cao nhất.
Cách tiến hành: sử dụng mẫu đốt thân sống sạch của cây ngọc ngân ở thí nghiệm 1 có hiện tượng cảm ứng phát sinh chdi, tiến hành cấy nào môi trường MS cơ bản có bồ sung 1,0 mg/l IBA kết hợp với chất điều hoà sinh trưởng Kinetin với các nồng độ khác nhau tuỳ theo từng nghiệm thức.
Bang 3.3. Nong độ Kinetin (mg/l) đến tạo chồi từ mẫu đốt thân
Nghiệm thức Môi trường Kinetin (mg) Mẫu/lân lặp lại
BI MS 0,0 7 B2 MS 0,2 7 B3 MS 0,4 7 B4 MS 0,6 7 B5 MS 0,8 y
Cách bố trí thi nghiệm: Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu đơn nhân tố với 5 nghiệm thức là B1, B2, B3, B4, B5 với 3 lần lặp lại, mỗi lần 7 mẫu. Tông số mẫu thí nghiệm là 105 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi:
Thời gian ghi nhận số liệu là 4 và 8 tuần sau khi nuôi cấy.
3 số mẫu phát sinh chồi
Tỉ lệ mẫu phát sinh chổi (%) = x100
3 số mẫu nghiệm thức 3; chiều cao chồi
Chiều cao trung bình của chdi (cm) = -8 ( ) 3 số mẫu nghiệm thức
Thời gian mẫu phát sinh chồi (ngày): thời gian ghi nhận khi mẫu bắt đầu có
hiện tượng cảm ứng tạo chôi.
16
Tình trạng mẫu: Theo dõi hình dáng và màu sắc.
3.3.3. Khảo sát nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh cụm chồi
Mục đích: xác định được nồng độ BA thích hợp cho sự nhân nhanh cụm choi từ mau đã phát sinh chỗồi của cây ngọc ngân với số chồi cao nhất.
Cách tiến hành: Sử dụng những mẫu phát sinh chdi ở thí nghiệm 2 có chiều cao chồi trung bình từ 1,0 — 1,5 em, có thân màu xanh lá, chắc khoẻ, cấy nào môi trường MS cơ bản có bồ sung 0,4mg/1 Kinetin và chất điều hoà sinh trưởng BA với các nồng độ khác nhau tuỳ theo từng nghiệm thức.
Bảng 3.4. Nong độ BA (mg/I) đến quá trình nhân nhanh cụm chồi
Nghiệm thức Môi trường BA (mg/l) Mẫu/lần lặp lại
C1 MS 0,5 7
~ MS 1,0 7 C3 MS 1,5 7 C4 MS 2,0 7 C5 MS 35 7
Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu đơn nhân tố với 5 nghiệm thức là C1, C2, C3, C4, C5 với 3 lần lặp lại, mỗi lần 7 mẫu. Tổng số mẫu thí nghiệm là 105 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi:
Thời gian ghi nhận số liệu là 2, 4, 6, § tuần sau khi nuôi cấy.
x & 3 Res 3; chiều cao choi
Chiêu cao trung bình của choi (em) =c——————
3; số mẫu thí nghiệm 3 số lá
Số lá trung bình của chéi (14) = ——=————8 ( ) 3 số chồi thí nghiệm
Số chéi trung bình mỗi nghiệm thức (chdi) = a
Tinh trạng mau: Theo dõi hình dang và màu sắc.
3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập được sẽ được xử lý thống kê trên máy tính bằng phần mềm Minitab 16. Đọc kết quả dựa vào bảng ANOVA, bảng trung bình và bảng
so sánh sự khác biệt giữ các nghiệm thức.
17