Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát ảnh hưởng của một số nguồn cơ chất trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp Lovastatin của nấm Aspergillus terreus ATCC 1012

LỜI CẢM ƠNĐể hoàn thành khóa luận “Khảo sát ảnh hưởng của một số nguồn cơ chất trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp lovastatin của chủng nam Aspergillus terreus ATCC 1012

; BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG DAI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

KHAO SÁT ANH HUONG CUA MOT SO NGUON CƠ CHAT TRONG MOI TRUONG NUÔI CAY DEN KHẢ NANG

SINH TONG HỢP LOVASTATIN CUA NAM

Aspergillus terreus ATCC 1012

Nganh hoc : CONG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : NGUYEN THỊ BICH THỦY

Mã số sinh viên : 18126173

Niên khóa : 2018 - 2022

Tháng 08/2023

; BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG DAI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

KHAO SÁT ANH HUONG CUA MOT SO NGUON CƠ CHAT TRONG MOI TRUONG NUÔI CAY DEN KHẢ NANG

SINH TONG HỢP LOVASTATIN CUA NAM

Aspergillus terreus ATCC 1012

Hướng dan khoa học Sinh viên thực hiện

TS LÊ THỊ HUYNH TRAM NGUYEN THỊ BÍCH THỦYTH.S NGUYÊN THỊ THỦY TIÊN

Tháng 8/2023

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận “Khảo sát ảnh hưởng của một số nguồn cơ chất trong

môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp lovastatin của chủng nam Aspergillus

terreus ATCC 1012” bên cạnh những nỗ lực của bản thân, em xin gửi lời cảm ơn chân

thành đến quý thầy cô trong Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP

HCM đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức làm nền tảng vững chắc và tạo điều kiện

dé em thực hiện nghiên cứu nay.

Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trung Tâm Công nghệ Sinh học đã cho phép

và tạo điều kiện thuận lợi, hỗ trợ về cơ sở vật chất dé em có thé hoàn thành đề tài tốt nghiệpnày Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành va sâu sắc nhất đến TS Lê Thị HuỳnhTrâm — Khoa Môi trường và Tài nguyên, Đại học Bách Khoa - ĐH Quốc gia TPHCM

và Th.S Nguyễn Thị Thủy Tiên — Phòng Công nghệ Vi sinh, Trung tâm Công nghệ Sinh

học TP HCM đã tận tình hướng dan, giúp đỡ và truyền đạt rất nhiều kiến thức bé ich cũng

như đưa ra những lời khuyên kịp thời nhất cho em trong quá trình thực hiện khóa luận tốt

trình làm việc sau này của mình.

Em xin chân thành cảm on!

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan kết quả được trình bày trong khóa luận này do chính tôi thực

hiện với sự hướng dẫn khoa học của TS Lê Thị Huỳnh Tram và ThS Nguyễn Thị

Thủy Tiên Các kết quả trình bày trong khóa luận này không sao chép hoặc sử dụngkết quả của nghiên cứu khác, nguồn tham khảo sử dụng được trích dẫn rõ ràng, minh

bạch Tôi xin hoản toàn chịu trách nhiệm vệ sự cam đoan này.

Thành phố Thủ Đức, tháng 08 năm 2023

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Bích Thủy

TÓM TẮT

Lovastatin là một hợp chất thuộc nhóm statin, được ứng dụng chủ yếu trong việc

điều trị chứng thừa cholesterol Ngoài ra, hợp chất này còn có tiềm năng ứng dụng

trong điều trị một số bệnh khác như Alzheimer, loãng xương và có khả năng ngănngừa ung thư Lovastatin được sinh tổng hợp bởi nhiều loài nắm khác nhau, trong đóAspergillus terreus được xem là loài có khả sản xuất lovastatin tốt nhất Dé tài nàyđược thực hiện nhằm khảo sát ảnh hưởng của một số nguồn cơ chất trong môi trường

nuôi cây đến khả năng sinh tổng hợp lovastatin của chủng nam A terreus ATCC 1012.

Sau khi tiến hành quan sát hình thái và đối chiếu với các nghiên cứu trước đây, chúngtôi nhận thấy chủng A terreus ATCC 1012 có sự tương đồng về hình thái đại thé và vithé so với các chủng nam cùng loài Ứng dụng phương pháp Sắc ký lỏng ghép khốiphổ UPLC-MS/MS trong định lượng lovastatin, kết qua cho thấy chủng nấm này có

kha năng sinh lovastatin trong môi trường Potato Dextrose Broth (PDB) Thí nghiệm

khảo sát nhiệt độ nuôi cấy chủng A /errews trên môi trường PDB, ghi nhận được mứcnhiệt độ phù hợp nhất là 25°C, nồng độ lovastatin thu được là 313,35 ppb Tiến hànhkhảo sát ảnh hưởng của một số nguồn cacbon và nitơ trong môi trường nuôi cấy đếnkhả năng sinh tong hợp lovastatin của chủng nam A terreus ATCC 1012 Kết quả ghinhận được, trong 4 nguồn cacbon được khảo sát bao gồm lactose, D-glucose, sucrose

và galactose thì nồng độ lovastatin cao nhất là 366,59 ppb ở nghiệm thức lactose Bột

đậu nành là nguồn cung cấp nitơ thích hợp hơn amonium sulfate và cao nam men,

nồng độ lovastatin thu được là 1157,10 ppb

Từ khóa: Lovastatin, Aspergillus terreus ATCC 1012, nguồn cacbon, nguôn nitơ

Lovastatin is a statin, a class of agents used to treat hypercholesterolemia In

addition, this compound has potential applications in the treatment of a number of

other diseases such as Alzheimer's, osteoporosis and has the ability to prevent cancer Lovastatin is biosynthesized by many different species of fungi, Aspergillus terreus is considered the best producer of lovastatin This study was conducted to investigate the influence of some substrates in the culture medium on lovastatin biosynthesis in the fungus A terreus ATCC 1012 After conducting morphological observations and comparing with previous studies, we found that strain A terreus ATCC 1012 had similarity in macroscopic and microscopic morphology compared to other fungal strains of the same species Applying UPLC-MS/MS liquid chromatography-mass spectrometry method in quantification of lovastatin, the results show that this fungal strain is capable of producing lovastatin in Potato Dextrose Broth (PDB) medium The experiment to investigate the culture temperature of A terreus strain on PDB medium,

recorded the most suitable temperature as 25°C, the obtained lovastatin concentration

was 313,35 ppb The effect of some carbon and nitrogen sources in the culture medium

on the biosynthesis of lovastatin of A terreus ATCC 1012 was investigated The

results were found that, in the four investigated carbon sources, included lactose,

D-glucose, sucrose and galactose, the highest concentration of lovastatin was 366,59 ppb

in the lactose treatment Soybean meal was a more suitable nitrogen source than ammonium sulfate and yeast extract, the concentration of lovastatin obtained was 1157,10 ppb.

Keywords: Lovastatin, Aspergillus terreus ATCC 1012, carbon sources, nitrogen

sources.

MỤC LỤC

TrangLOI CAM 090 1

XÁC NHẬN VA CAM ĐOAN 52222-+c2rrtrrrrirrrrrrrrrrrrrrerrrrer i

UU csc ce i a ce masa ii

5.2.0 iii

MU OIG se bong on DU NGEEEDĐEHDGREEH@RISEESGIBGBEBRGEEISNEI-NBERIBRLGGEEDS./.SBEHBSIEGERSEồ-ESBEiEpitasgi 1V

DANH MỤC VIET TẮTT -2- 2+2 SE+EE+E£EE£EE£E2EEEE25121112112121212111111111111 2111 xe viiDÁNH SAONH CAD BANG ce ccnsnsomssasonsenemsanseanoseamnniosseinsonuniveanincesnunnussnsnnien viii

AT BC EE suseanuenuennnnnurisanioniuitstiotitdUIGU000,3000060.3808uï0:810820g0.16g8È ix

CHƯNG l1 MỦ BA sccscecsncesnscocononaseinszacessataaeernusrsnsantessnenasusasononssaenneedonanreesusanstnenss |1.1 Đặt vấn đề - s5 St 23221221211121111211111112111111111111111111 2 eereg |

1.2 Mục tiêu đề tài 5- 2-25 21 21221221221221221211111112111111121111111111 22c e |

1.3 NO1 dung there W161 oe < 2.

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIBU 020 ccccccsccsscsssessessessesesessesssesessesesessesesesseeseeeses 3

21, i hide A, 0N csecemeeremennememmamnmnnennn 3Dtsch MAD) TOYOT;xyssxnns Soni0inE0LBRIGIAN SRIESSGGEBSĐNLSERENGRSESTENSIUESERkiNChGGSGi0U0G2ENGIISSHSHINGG:SBE /QDRGD4RS00882B8u8 3

2.1.2 Đặc điểm của A /@fr1% 2-52S2S22222212221212122121211212111121211212111111 2120 xe 32.2 Giới thiệu về Ïovastatin 2-2-5221 2 219212212712712212111111111111111 11121 re 42.2.1 Cấu tạo và tính chất hóa học 2-2 + ©2+SE2E£EE£EE2E21511211212121E211121 21 xe 42.2.2 Lovastatin trong điều trị cholesterol máu cao -2 22-2z+2zz22++cs+2 52.2.3 Tình hình sản xuất lovastatin trong và ngoài nước -2-s-55z522-e: 3

2.2.4 Tiềm năng ứng dụng của lovastafin - 2-2 5222222S22E22E22E2EEEEcrErrxrrrrrei 6

2.3 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về ứng dụng chủng A /errews trong sản

ml m7 ố.ẽẻ 6

23.14 Các nghiện City Mong DUG Gia cssessioxesev284653826660939243000S040S864E00138SEPRS,4GAL800g831303608 6

2.3.2 Các nghiên cứu trên thế giới 2-22 2522EE2EE22E12EE22E222122122512212211221221222 e2 7

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22©22222+2ES+22+z22zz2zxzze 8

3.1 Thời gian và địa diém nghiên COU oo cc ccccccccceeccessesseeseesessessessessessessessessessessessesseess §

I0 TY HT eo 8 3:21 ng vil Sina Walls ses 6xsisecissessk13136084 88a 35L21ã038E47390531308u.GE054S4.2815.05-1381015.40S505i0/S01-8580308 8

3.2.2 Hoa 5 8 4 8

3.2.4 Thiết bị và dụng cụ - 2-2: 52-2222222122122122122121211211212111212121212121 re 8

3 Se P AIOE PIA TTEHBIEH GỮN ceenneesoeebsstestelogiestdig3G0000032110502030088H10.001346-0E815G/050GĐ42D.SG/.201210040188 8

3.3.1 Phương pháp quan sát hình thái - - - cee 5+ +2 *++E+*E£+EEzzEeerErrkerrrrrrrrkre 8

3.3.1.1 Quan sát đại thỂ 2 5s+S2221S212212211121111111111111111112111112 22 ca 8

37117 EinngsiUrdi Ti beaeeeeeeonoeneeoohinotetie0ig6 G0G05000000000010000019ã0000090000u1n0gSuer 9

3.3.2 Phương pháp tách chiết lovastatin 22 25222222EE22EE2EE22EE22E22E22EeEEcrrrrrev 93.3.3 Phuong phap dinh long T21 103.3.3.1 Kỹ thuật sắc ký long ghép khối phô (LC-MS/MS) cccccsccecceceeeseseeeseeeeeees 10

3.3.3.2 Điều kiện định lượng lovastatin bằng Hệ thống LC-MS/M&S -.- 11

3.3.3.3 Phương pháp dựng đường Chuan cece ecceecsecceecseececseeseesesseesteseeesessess 11

3.3.4 Phương pháp nuôi CAY -22-©22¿222++22+2222E222E22231222122721222122221 222 tre 12

3.3.4.1 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy chủng nắm 41 ferreus sinh tổng hợp lovastatin 123.3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của một số nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợplovastatin của chủng nấm A /£Fr€i/3 -©22-52222222222222212222221221222122121122122112 Xe 12

3.3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của một số nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp

lovastatin của chủng nấm A /€f7Ci4§ 2- 52: 52222S222E2EE2EE2232212212232212121212122Xe2 13

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 2-22 22 22+2E+2E22E2EE2E2E2Ezrerree 14

ST, Tế KH na ccc doi cee ei isl gam 144.1.1 Hình thái đại thé và vi thé của nắm A /erreus ATCC 1012 14

Eel HT | nn 144.1.1.3 So sánh hình thái giữa một số chủng nam thuộc loài 4 /@rrews 154.1;2: Định lượn lovastatin ccccceonaneewunaee 164.1.2.1 Xây dựng phương trình đường chuẩn lovastatin -2- 2¿52z22z+2zz22zzz+2 164.1.2.2 Định lượng lovastatin trong môi trường nuôi cấy chủng nam A.ferreus 184.1.3 Khảo sát nhiệt độ nuôi cay chủng nắm 44 ferreus sinh tổng hợp lovastatin .184.1.4 Khảo sát ảnh hưởng của một số nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp

lovastatin của chủng nấm A /£Fr€1/3 -22-©22©22222222222222E222522322512212232221221222x 194.1.5 Khảo sát ảnh hưởng của một số nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp

lovastatin của chủng nắm A /@77Øi$ -2 22-©22222222222222122322212212211221221122122122.,2e 21

4.2 Thảo luận 2- 52 Ss 2SEESEE12E1E7127127122111711111111111111122212112111 1e 24

CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ, -2- 52 2S2E£2E£2E£2E2E2E2E2EzEerree 26

ìh‹ 1.1“ 265.2 {0n 26TÀI LIEU THAM KHẢO 2-2-2 SSSE£SE£EE£2E£EEEEEE2E2112312112112121121121271.21 22 Xe 57

CS | 31

DANH MỤC VIET TAT

ctv: Cộng tác viên

EthOAc: ethyl acetate

HPLC: High Performacnce Liquid Chromatography

HS: Hé soi

HCI: Axit clohydric

MT: Môi trường

MeOH: Methanol

NaOH: Natri hidroxit

LCMS: Liquid Chromatography - Mass Spectrometry

UPLC-MS/MS: Ultra Performacnce Liquid Chromatography - Mass Spectrometry PTFE: PolyTetraFluoroEthylene

DANH SÁCH CÁC BANG

Bảng 3.1 Điều kiện, thông số cho quá trình phân tích bằng hệ thống sắc ký lỏng ghépkhối phô UPLC-MS/MS - 2-22 2S22S222122E22E12212211221221121121122112112211211 11212 xe 11Bang 3.2 Thành phan môi trường của các nghiệm thức khảo sát nguồn cacbon 12Bảng 3.3 Thanh phần môi trường của các nghiệm thức khảo sát nguồn nitơ 13Bang 4.1 Diện tích peak chuẩn lovastatin ở các nồng độ - : -22¿525z5522 17Bang 4.2 Nồng độ lovastatin thu được ở các mức nhiệt độ -2- 2-52 18Bang 4.3 Nồng độ lovastatin thu được ở các mức nhiệt độ 2-5255z55+2 19

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Một số hợp chat được sinh tổng hợp bới chủng nam Aspergillus terreus 4Hình 2.2 Cau trúc hóa học của Lovastatin (a) Vong lactone đóng, (b) Vòng lactone mở

(Subnav cu: 2020) seescnstarearsrenee tire ecint cil ts te at hacen ng cae narra ansaid 5

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình tách chiết lovatatin .0 0 0 ccccccccececseesseesseessessseesseeesessseesseesees 9Hình 3.2 Sơ đồ tổng quan của hệ thống LC-MS/MS với máy phân tích khối lượng ba

tir cuc (Almomani va 5012027220007 10

Hình 4.1 Hình thái đại thé nam A terreus ATCC 1012 (a), (c) Mặt trước KL; (b), (d)

vi Cý HÀ AST oe wes sess sete ent etre cl a a Sa BC eel bret cRimeeest 14Hình 4.2 Hình thái vi thé nam A terreus ATCC 1012 (a) Chup dưới vật kính 40X; (b)

60 /7.8.7.28 /1805//.801///0.0nn8.^ 15

Hình 4.3 Hình thái dai thé và vi thé của một số chủng A terreus (a), (b) Chung A

terreus FZC3, (Liu va ctv, 2016); (c), (d) Chung A terreus ITCC 7406.09, (e), (f)

Ching A LrFeUs ATCC 101 2 sssasessesessecesssnsenneoseunvasvexevanssws epansseeaseusenseswsvsnnveayerexauacuesee ss loHình 4.4 Sắc ký đồ của chuẩn lovastatin ở nồng độ 50 ppb . -5- 16Hình 4.5 Đường chuẩn lovafatin 2-52 2¿ 222222E22E£EE£EE£EEEEEEEEEEEEEEErrErrrrrrrrree 17

Hình 4.6 Nồng độ lovastatin trong môi trường với các nguồn cacbon khác nhau 19Hình 4.7 Sắc ký đồ của nghiệm thức D-glucose (GL) và nghiệm thức Sucrose (S) 20Hình 4.8 Sắc ký đồ của nghiệm thức Galactose (G) và nghiệm thức Lactose (L) 20Hình 4.9 Các nghiệm thức môi trường nuôi cấy sử dụng các nguồn cacbon khác nhau

(a) Lactose; (b) Galactose; (c) D-glucose; (A) ®ŠMCFOS€ c 525 <<S<s<++sksseeeses 21

Hình 4.10 Nong độ lovastatin trong môi trường với các nguồn cacbon khác nhau 22Hình 4.11 Sắc ký đồ của nghiệm thức Aminium sulfate (AS) -2525¿+: 2Hình 4.12 Sắc ký đồ của nghiệm thức Yeast extract (YE) -2-2¿55z5sz52z55+2 23Hình 4.13 Sắc ký đồ của nghiệm thức Bột đậu nành (SB) 22 225525525522 23Hình 4.14 Các nghiệm thức môi trường nuôi cay sử dụng các nguồn nito khác nhau 24

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Lovastatin là một loại thuốc thuộc nhóm statin, có tác dụng làm giảm lượngcholesterol trong máu (Alberts, 1988), được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩmHoa Kỳ phê duyệt lần đầu tiên vào năm 1987 (Radha và Lakshmanan, 2013) Bêncạnh ứng dụng trong sản xuất thuốc điều trị chứng thừa cholesterol, lovastatin còn cótiềm năng ứng dụng trong điều trị Alzheimer, loãng xương và có khả năng ngăn ngừaung thư (Wang và ctv, 2019) Lovastatin là một hợp chất thứ cấp được sinh ra bởinhiều loài nấm khác nhau như là Penicillium, Monascus (Endo và ctv, 1976),Hypomyces hay Trichoderma (Endo và ctv, 1986) Khả năng sản xuất lovastatin củacác ching nam khác nhau đã được báo cáo trong nhiều nghiên cứu, trong đóAspergillus terreus được xem là chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp lovastatin tốt

nhất (Javel và ctv, 2010) Trên thé giới đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu về kha năngsinh lovastatin của các chủng A ferreus, tuy nhiên vẫn còn khá ít nghiên cứu trong

lĩnh vực này được thực hiện ở Việt Nam.

Cacbon và nito được cho là những chất dinh dưỡng quan trọng nhất đối với sự

phát triển của nấm men và sản xuất các chất chuyên hóa của chúng Nguồn cabonthường liên quan đến sản xuất các hợp chất thứ cấp, trong khi nitơ chủ yếu tác độnglên sự phát triển của nắm Môi trường bình thường thường bao gồm nguồn carbon,nguồn nitơ, nước, muối và vi chất dinh dưỡng Trong quá trình lên men công nghiệp,

việc sử dụng các nguồn nitơ hữu cơ còn nhiều hạn chế do chi phí cao Tuy nhiên, một

số lượng nghiên cứu cho rằng các nguồn nitơ hữu cơ hiệu quả trong việc hỗ trợ sự phát

triển của A terreus (Bizukojc và Ledakowicz, 2007; Rahim và ctv, 2019)

Vì vậy, đề tài này hướng tới mục tiêu khảo sát ảnh hưởng của một số nguồn cơchat trong môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp lovastatin của chủng nam

A terreus ATCC 1012 Từ đó, góp phan tạo nền tảng cho các nghiên cứu thực hiện ở

quy mô pilot.

1.2 Mục tiêu đề tài

Khảo sát ảnh hưởng của một số nguồn cacbon và nguồn nitơ trong môi trường

nuôi cây đến khả năng sinh tổng hop lovastatin của chủng nam A ferreus ATCC 1012

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Đánh giá đặc điểm hình thái đại thé và vi thé của chủng A ferreusATCC 1012.

Nội dung 2: Định lượng lovastatin trong san phẩm nuôi cấy chủng nam A terreus.Nội dung 3: Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy chủng nấm _ A ferreus sinh tổng hợp

lovastatin.

Nội dung 4: Khao sát anh hưởng của các nguồn cacbon khác nhau đến kha năng

sinh tong hop lovastatin của A ferrews

Nội dung 5: Khao sát ảnh hưởng của các nguồn nito khác nhau đến khả năng sinhtong hop lovastatin của A ferreus

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Giới thiệu về nam A terreus

Loài: Aspergillus terreus

2.1.2 Đặc điểm của A terreus

Về cau tao, theo mô tả của Gunde-Cimerman va ctv vào năm 1993, A ferreus là

nam sợi, sợi nam có dang hình ống phân nhánh bên trong chứa chat nguyên sinh có thélưu động Chúng có sự sinh trưởng vô hạn về chiều dài, nhưng đường kính sợi chỉkhoảng 1-30 um Phần đầu của sợi nắm được gọi là vùng kéo dai (extension zone), cóhình viên trụ Trong giai đoạn sinh trưởng mạnh mẽ của nắm, vùng kéo đài là vùng màthành tế bao phát triển nhanh chóng, có thé đạt chiều dài đến 30 um Trong các tế bàothường có 1-2 nhân, phần ngọn của sợi nắm thường tập trung nhiều nhân hơn

Về hình thái vi thể, nắm A ferreus được mô tả như sau: có hệ sợi phân nhánh, có

vách ngăn, không màu, màu nhạt hoặc trong sam mau; Giá bào tử trần không có nhánh,không có hoặc ít có vách ngăn ngang, có phần đỉnh to ra thành bọng hình trùy, hìnhelip hoặc hình nửa cầu; Khối bào tử trần đính bọng có thể có dạng hình cột hoặc hìnhtia tỏa tròn Bảo tử có dạng hình cầu, đường kính từ 2-3 um (Gautam va ctv, 2012)

Về hình thái dai thể, khuẩn lạc nam A ferreus có màu vàng nhạt đến nâu quế, cónúm (umbonate) lồi lên ở giữa Rìa khuẩn lạc trơn Tốc độ phát triển tương đối nhanh

(Gautam và ctv, 2012).

2.1.3 Một số hợp chất được phân lập từ A terreus

A terreus là chủng nam được sử dụng phô biến trong công nghiệp sản xuất acid

hữu cơ, vi dụ như acid itaconic và acid cis-aconitic Day là những vật liệu chịu nhiệt

(refractory), ứng dụng trong sản xuất polymer Ngoài ra, người ta còn tách chiết đượcnhiều hợp chất khác có hoạt tính sinh học như terreulactones A, territrem A Bên cạnh

đó, A terreus cũng sinh ra các sinh ra một sô độc tô nâm moc như citreovividin,

Tuy nhiên, A ferreus cũng gây ra nhiễm trùng cơ hội ở những người có hệ thống

miễn dịch bị suy giảm.

2.2 Giới thiệu về lovastatin

2.2.1 Cau tạo và tính chất hóa học

Công thức phân tử: C24H36Os.

Khối lượng phân tử: 404,5 g/mol

Lovastatin có cấu trúc tinh thé, màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 174,5°C, nhiệt độsôi 559,198°C tại 760 mmHg, khối lượng riêng: 1,122 g/cm3, nhiệt hóa hơi(1H=96,691 kJ/mol), LD50 trên chuột >1000 mg/kg.

Lovastatin tan tốt trong các dung môi it phân cực như chloroform, kém tan trong

nước.

với thời gian lưu của lovastatin dang lactone (Friedrich va ctv, 1995).

2.2.2 Lovastatin trong diéu tri cholesterol mau cao

Lovastatin là một polyketide từ nắm được sử dụng làm thuốc hạ cholesterol, hoạtđộng nhờ cơ chế ức chế (3S)-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA)reductase (Money, 2016) Ngăn cản quá trình chuyển HMG-CoA thành mevalonate,tiền chất của cholesterol, từ đó làm giảm lượng cholesterol trong tế bảo gan

Lovastatin được kê đơn dưới tên Mevacor và được dùng bằng đường uống Liềulovastatin được sử dụng dé điều trị tăng cholesterol máu là 10, 20 và 40 mg, với liều

tối đa là 80 mg/ngày (Valentovic, 2007) Theo nghiên cứu của Hoeg và Brewer (1978),

Lovastatin có thé làm giảm 33% cholesterol toàn phan

2.2.3 Tình hình sản xuất lovastatin trong và ngoài nước

Trên thế giới, ngành công nghiệp sản xuất thuốc điều trị chứng thừa cholesterol

có giá trị kinh tế rất lớn Theo Valentovic (2007), những loại thuốc như lovastatin,simvastatin va lipitor đã tạo ra doanh thu hang tỷ đô la cho Pfizer, AstraZeneca, Merck

và Novartis Tại Việt Nam, các loại thuốc thuộc nhóm statin trong đó có lovastatin đã

được sử dụng rộng rãi trong các phác đồ điều trị cholesterol máu cao hay các bệnh về

tim mạch Tuy nhiên, các loại thuốc này đều phải nhập khẩu từ nước ngoài hoặc đượcbào chế và đóng gói từ nguồn statin ngoại nhập Chưa có đơn vị trong nước nào thamgia sản xuất lovastatin, mặc dù công nghệ sản xuất lovastatin đã đăng ký tại Bắc Mỹ

và Châu Âu từ năm 1979 và đã hết hạn bảo hộ độc quyền từ năm 2009 (Nguyễn Văn

Bích, 2013).

2.2.4 Tiềm năng ứng dụng của lovastatin

Bên cạnh khả năng làm giảm cholesterol trong mau, lovastatin cũng có tác dụngchống viêm, chống ung thư và bảo vệ thần kinh Các nghiên cứu trên tế bào và động

vật đã phát hiện ra rằng statin có tác dụng chống tăng sinh, chống xâm lấn và chống

tạo mạch đáng ké (Mei và ctv, 2017; Farooqi, 2018) Ở một số nghiên cứu khác, người

ta đã chỉ ra lovastatin có thể ức chế sự tăng sinh và thúc đây quá trình chết theo

chương trình ở nhiều loại té bao ung thư khác nhau, chăng hạn như vú, ruột kết(Sassano và Platanias, 2008), gan (Vallianou và ctv, 2014) và cô tử cung (Ma và cộng

sự, 2016) Ngoài ra, việc sử dụng kết hợp lovastatin và các loại thuốc hóa trị liệu khác

có thé làm giảm khả năng kháng thuốc của tế bào ung thu, do đó cai thiện đáng kể hiệuquả điều trị của các loại thuốc này (Khandelwal Gilman và ctv, 2021)

2.3 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về ứng dụng chủng A terreus trongsản xuất lovastatin

2.3.1 Các nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về ứng dụng chủng nam A ferreus trong sản xuấtlovastatin còn rất ít Năm 2011, Quyền Đình Thi và cộng sự đã nghiên cứu thăm dòkhả năng tông hop lovastatin từ các chủng nấm A ferreus và đã lựa chọn được chủngsinh tông hợp lovastatin cao bằng kỹ thuật đột biến Kết quác cho thấy nhóm nghiêncứu đã tuyên chon được 22 dòng siêu sản xuất lovastatin trong tổng số 43 dòng độtbiến của chủng A terreus ATCC 20542 và A terreus VTCC-F916

Gần đây, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Phạm Tuấn và cộng sự (2021) đã thựchiện đánh giá ảnh hưởng của các yêu tố đến quá trình sản xuất lovastatin từ chủng namAspergillus terreus EV8 bằng phương pháp lên men bán rắn Kết quả đã chi ra được

cơ chất (gạo trang), nguồn cacbon (glucose 5 g/L), nguồn nitơ (pepton 5 g/L) và thờigian lên men (8 ngày) cho hàm lượng lovastatin cao nhất đạt 4,66 mg/g

Nhìn chung, các nghiên cứu đã thu được kết quả bước đầu và tạo tiền đề cho việcsản xuất lovastatin bằng chủng nam A ferreus Song vẫn còn nhiều khía cạnh nghiêncứu vẫn chưa được khai thác Có thé nói, cơ sở dữ liệu về ứng dụng các chủng namthuộc loài A ferreus trong sản xuất lovastatin tại Việt Nam vẫn chưa được hoàn thiện

2.3.2 Các nghiên cứu trên thế giới

Các nghiên cứu về quá trình sản xuất lovastatin của A ferreus bắt đầu từ rất sớm

Từ những năm 1980, các công trình nghiên cứu về cơ chế di truyền và hóa học quyếtđịnh sự hình thành của lovastatin đã được thực hiện (Albers-Schoenberg và ctv, 1981;

Albert và ctv, 1980; Monaghan va ctv, 1980) Các nghiên cứu đa khía cạnh trong lĩnhvực này đã được thực ở nhiều trường đại học trên thế giới, trong đó có Đại

học Almeria (Andalusia, Tây Ban Nha), Đại học Công nghệ Lodz (Ba Lan), Đại học

Công nghệ Chaoyang (Đài Loan), Đại học Milan (Ý), Đại học Ky thuật Budapest (An

D6), (Bizukojc, 2015) Qua đó, các khía cạnh liên quan đến ảnh hưởng của các thành

phan môi trường, nồng độ oxy hòa tan, hình thái viên nam (pellets) đối với sự hìnhthành lovastatin đã được xác định Nồng độ lovastatin thu được bằng phương phápnuôi cấy chìm được ghi nhận là khoảng 10-1000 mg/l, tùy theo chủng nấm và điềukiện nuôi cấy

Phần lớn các nghiên cứu đã được thực hiện trên chủng nam thương mai A terreus

ATCC 20542 Trong đó có nghiên cứu của Muhamad va ctv vào năm 2019, theo kết

quả mà nhóm nghiên cứu của ông thu được, nồng độ lovastatin cao nhất được sinh

tổng hợp bởi chủng nam nay là 25,52 mg/l, với nguồn nito là cao nấm men

Ngoài ra, trong một nghiên cứu được công bé gần day, Srinivasan và cộng sự(2022) đã sản xuất lovastatin từ nước thải chế biến cao lương (sago processingwastewater) bằng phương pháp lên men chìm chủng nam A terreus KPR12 Nhómnghiên cứu đã ghi nhận được có 142,23 mg/l lovastatin nội bào và 429,98 mg/l

lovastatin ngoại bao được sinh ra sau 9 ngày nuôi cấy chủng nam nay

Trên thế giới, tình hình nghiên cứu về quá trình sản xuất lovastatin từ chủng nắm

A terreus đã đạt được rất nhiều thành tựu Không dừng lại ở việc tối ưu hóa các điềukiện nuôi cấy, đã có nhiều nghiên cứu mới đây tìm ra nguồn cơ mới chất thân thiện vớimôi trường, tận dụng được nguồn phế phẩm nông nghiệp dé sử dụng trong quá trìnhlên men nhằm giảm chi phí sản xuất Hay việc ứng dụng chủng nắm nay trong sản xuấtlovastatin từ nước thải chế biến cao lương, vừa mang lại lợi ích kinh tế vừa góp phần

xử lý ô nhiễm môi trường Đây là động lực thúc đây các nghiên cứu trong lĩnh vực này

ở nước ta.

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 7 năm 2022 đến tháng 6 năm 2023 tại Phòng Côngnghệ Vi sinh, Trung tâm Công nghệ sinh học TP Hồ Chí Minh

Hệ thống UPLC-MS/MS Water Triple Quad, cột sắc ký ACQUITY UPLC BEH

C18 1,7 um, bộ lọc chân không, tủ cấy vô trùng, tủ hút hóa chất, tủ sấy, nồi hấp tiệt

trùng, máy lắc, máy rửa siêu âm, tủ giữ giống, kính hiền vi, tủ ủ, cân điện tử, máy đo

pH, máy cô mẫu nitrogen, buồng đến hồng cầu Neubauer cải tiến

Các dụng cụ được sử dung: falcon 50 ml, pipette 10 ml, micropipette, dau tip,xilanh 10 ml, dau loc PTFE 0,22 ul, bình định mức

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp quan sát hình thái

Mau sac mặt trước và mặt sau khuân lạc nâm

Sự biên đôi màu sắc của khuân lạc nâm.

Hình dạng khuẩn lạc nam

Sac tô tiêt vào môi trường.

3.3.1.2 Quan sát vi thé

Chuẩn bị đĩa petri có đặt miếng bông, làm âm bằng nước cất vô trùng Đặt mộtmiếng thạch PDA có kích thước khoảng 1x1 cm lên lame kính sạch rồi cho vào đĩapetri đã chuẩn bị Sau đó cấy bao tử NS vào 4 cạnh của miếng thạch, đậy lamen U

trong tủ u ở 25°C trong 3 ngày.

Sau khi ủ, dùng kẹp lấy lamen ra và đặt lên lame kính mới có nhỏ sẵn một giọtlactophenol blue Soi tiêu bản dưới kính hiển vi dé quan sát các đặc điểm sau:

- Soi nam có phân nhánh hay không

- Đặc điểm cơ quan sinh bào tử

- Hình dáng bảo tử.

3.3.2 Phương pháp tách chiết lovastatin

Lovastatin được chứng minh là có tồn tại trong dịch nuôi cấy và hệ sợi của nắm

(Srinivasan và ctv, 2022) Vì vậy, thí nghiệm sử dụng toàn bộ sản phẩm nuôi cay dé

tach chiết nhằm thu được lovastatin nội bào va cả ngoại bào, đồng thời rút ngắn quy

trình Quy trình thực hiện được tham khảo từ nghiên cứu của Li va ctv vào năm 2013.

Lên men A terreus trong 20 ml môi trường nuôi cây.

trong 5 phút.

|

Lọc mẫu qua màng loc PTFE 0,22 um.

Hình 3.1 So đồ quy trình tách chiết lovatatin

Sau thời gian ủ, toàn bộ sản phâm nuôi cây được thu và được điêu chỉnh đên pH

3.0 bang dung dịch HCI 1N Thêm ethyl acetate (EtOAc) theo ty lệ 1:1 Lắc với tốc độ

180 rpm, trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng Sử dụng bộ lọc chân không để phân tách hệsợi nam (HS) và dịch lên men (MT) Phan HS tiếp tục được lọc rửa 3 lần bang EtOAc

Thu phần dịch lọc và đem ly tâm 6000 rpm, 4°C trong 10 phút Thu phần dịch chiếtphía trên (organic phase) Đuôi dung môi bang máy cô mau Nitrogen Phan cặn khôđược hòa tan trong 1 ml methanol Đồng nhất mẫu bằng bê siêu âm trong 5 phút Lọclại bằng mang lọc PTFE 0,22 um và tiến hành phân tích sắc ký Quy trình tách chiếtđược tóm tắt trong Hình 3.1.

3.3.3 Phương pháp định lượng

3.3.3.1 Kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phố (LC-MS/MS)

Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) là một kỹ thuật phân tích hiệu qua đượcứng dụng trong nhiều lĩnh vực bao gồm cả định tính và định lượng Đây là một kỹthuật phân tích hóa học dựa trên sự kết hợp giữa khả năng phân tách cấu tử của sắc kýlỏng hiệu năng cao (HPLC) và khả năng định tính, định lượng của bằng đầu dò khốiphô (MS) Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng phô biến để phân tích các hợp chấthữu cơ sinh hóa có trong nền mẫu phức tạp Bằng việc đo đạc tỉ lệ khối lượng trên

điện tích của ion (m/z), phương pháp khối phô cho phép xác định các hợp chất chưa

biết bằng cách dựa vào khối lượng của phân tử hợp chất; xác định cấu trúc của mộthợp chất dựa trên các thành phần phân mảnh

Kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ cung cấp kết qua phân tích có độ đặc hiệu và

độ nhạy cao, có khả năng phân tích các hợp chất ở hàm lượng vét Thiết bị gồm hai

phần ghép nói là phần sắc ký (cho phép tách chat) và phần khối phô (phát hiện chat)

3.3.3.2 Điều kiện định lượng lovastatin bằng Hệ thống LC-MS/MS

Ở nghiên cứu này, phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phố (UPLC-MS/MS) với

nguồn ion hóa ESI+, pha tinh sử dụng cột UPLC BEH C18, pha động là dung môiacetonitrile được sử dung dé định lượng nồng độ lovastatin có trong sản phẩm nuôicấy chủng nắm A terreus ATCC 1012

Bảng 3.1 Điều kiện, thông số cho quá trình phân tích bằng hệ thống sắc ký lỏng ghép

khối phé UPLC-MS/MS

Điều kiện sac ky Điều kiện khối pho

Hệ thong sắc ký long: Water ACQUITY

Hệ thống khối phố: Xevo TQ-S micro

UPLC H- Class

Cột: ACQUITY UPLC BEH C18 (1,7 ¬

Nguôn ion hóa: ESI +

Pha động A: H20:0,01% acid formic Nhiệt độ nguồn ion hóa: 130 °C

Pha động B: Methanol Desolvation temperature: 350 °C

Wash solvent: ACN : H20 (50:50 v/v) Desolvation gas flow: 600 L/hr

Chế độ MRM [MỊ]H' va [M]H,, có nănglượng Cone (V) va Collision (V) như sau:

405,50 > 199,20 (10/15) va 405,50 >

285,40 (10/15)

Purge solvent: ACN : H20 (10:90 v/v)

Trong đó mảnh ion con m/z có cường độ

, - lớn nhất dùng đề định lượng, mảnh con

Thê tích tiêm mâu: 5 pL , ,

thứ 2 có cường độ thâp hơn dùng đê định tính.

3.3.3.3 Phương pháp dựng đường chuẩn

Đường chuẩn được xây dựng dựa trên 5 điểm chuẩn ở các nồng độ 1 ppb, 2 ppb,

10 ppb, 50 ppb, 100 ppb từ chuẩn gốc lovastatin 1000 ppm