DANH SÁCH CÁC BANG
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 7 năm 2022 đến tháng 6 năm 2023 tại Phòng Công nghệ Vi sinh, Trung tâm Công nghệ sinh học TP. Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu
3.2.1. Chung vi sinh vật
Ching nam Aspergillus terreus ATCC 1012 (California, Mỹ).
3.2.2. Hóa chat
Chất chuẩn lovastatin (Merk); dung môi ethyl acetate (EthOAc) va methanol (MeOH) cấp HPLC (Merk); nước LCMS (Merk). Hóa chất khác: HCI, NaOH...
3.2.4. Thiết bị va dụng cụ
Hệ thống UPLC-MS/MS Water Triple Quad, cột sắc ký ACQUITY UPLC BEH C18 1,7 um, bộ lọc chân không, tủ cấy vô trùng, tủ hút hóa chất, tủ sấy, nồi hấp tiệt trùng, máy lắc, máy rửa siêu âm, tủ giữ giống, kính hiền vi, tủ ủ, cân điện tử, máy đo pH, máy cô mẫu nitrogen, buồng đến hồng cầu Neubauer cải tiến.
Các dụng cụ được sử dung: falcon 50 ml, pipette 10 ml, micropipette, dau tip, xilanh 10 ml, dau loc PTFE 0,22 ul, bình định mức.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp quan sát hình thái
3.3.1.1. Quan sát đại thể
Thu bao tử nấm A. terreus cho vào eppendorf chứa 200 pL tween 80. Vortex trong 5 giây dé tao thành dich huyền phù.
Sử dụng micropipette hút 10 wL địch huyền phù, nhỏ vào trung tâm của đĩa môi
trường PDA.
U tối ở nhiệt độ 25°C trong 7 ngay va tiến hành quan sát khuẩn lạc về các đặc điểm sau:
Mau sac mặt trước và mặt sau khuân lạc nâm Sự biên đôi màu sắc của khuân lạc nâm.
Hình dạng khuẩn lạc nam.
Sac tô tiêt vào môi trường.
3.3.1.2. Quan sát vi thé
Chuẩn bị đĩa petri có đặt miếng bông, làm âm bằng nước cất vô trùng. Đặt một miếng thạch PDA có kích thước khoảng 1x1 cm lên lame kính sạch rồi cho vào đĩa petri đã chuẩn bị. Sau đó cấy bao tử NS vào 4 cạnh của miếng thạch, đậy lamen. U
trong tủ u ở 25°C trong 3 ngày.
Sau khi ủ, dùng kẹp lấy lamen ra và đặt lên lame kính mới có nhỏ sẵn một giọt lactophenol blue. Soi tiêu bản dưới kính hiển vi dé quan sát các đặc điểm sau:
- Soi nam có phân nhánh hay không.
- Đặc điểm cơ quan sinh bào tử.
- Hình dáng bảo tử.
3.3.2. Phương pháp tách chiết lovastatin
Lovastatin được chứng minh là có tồn tại trong dịch nuôi cấy và hệ sợi của nắm (Srinivasan và ctv, 2022). Vì vậy, thí nghiệm sử dụng toàn bộ sản phẩm nuôi cay dé tach chiết nhằm thu được lovastatin nội bào va cả ngoại bào, đồng thời rút ngắn quy
trình. Quy trình thực hiện được tham khảo từ nghiên cứu của Li va ctv vào năm 2013.
Lên men A. terreus trong 20 ml môi trường nuôi cây.
Điều chỉnh pH đến 3,0 bằng HCI 0,12M.
|
Thêm ethyl acetate theo tỷ lệ 1:1
và lắc 180 rpm, 25°C, trong 24 giờ.
|
Lọc tách hệ sợi và rửa lại 3 lần bằng ethyl acetate.
|
Ly tâm 6000 rpm, 4°C trong 10 phút.
Ụ
Thu dịch nỗi và cô mẫu.
}
Thêm | ml methanol, đồng nhất mẫu bằng bể siêu âm
trong 5 phút.
|
Lọc mẫu qua màng loc PTFE 0,22 um.
Hình 3.1 So đồ quy trình tách chiết lovatatin.
Sau thời gian ủ, toàn bộ sản phâm nuôi cây được thu và được điêu chỉnh đên pH
3.0 bang dung dịch HCI 1N. Thêm ethyl acetate (EtOAc) theo ty lệ 1:1. Lắc với tốc độ 180 rpm, trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sử dụng bộ lọc chân không để phân tách hệ sợi nam (HS) và dịch lên men (MT). Phan HS tiếp tục được lọc rửa 3 lần bang EtOAc.
Thu phần dịch lọc và đem ly tâm 6000 rpm, 4°C trong 10 phút. Thu phần dịch chiết phía trên (organic phase). Đuôi dung môi bang máy cô mau Nitrogen. Phan cặn khô được hòa tan trong 1 ml methanol. Đồng nhất mẫu bằng bê siêu âm trong 5 phút. Lọc lại bằng mang lọc PTFE 0,22 um và tiến hành phân tích sắc ký. Quy trình tách chiết được tóm tắt trong Hình 3.1.
3.3.3. Phương pháp định lượng
3.3.3.1. Kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phố (LC-MS/MS)
Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) là một kỹ thuật phân tích hiệu qua được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực bao gồm cả định tính và định lượng. Đây là một kỹ thuật phân tích hóa học dựa trên sự kết hợp giữa khả năng phân tách cấu tử của sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và khả năng định tính, định lượng của bằng đầu dò khối phô (MS). Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng phô biến để phân tích các hợp chất hữu cơ sinh hóa có trong nền mẫu phức tạp. Bằng việc đo đạc tỉ lệ khối lượng trên điện tích của ion (m/z), phương pháp khối phô cho phép xác định các hợp chất chưa biết bằng cách dựa vào khối lượng của phân tử hợp chất; xác định cấu trúc của một hợp chất dựa trên các thành phần phân mảnh...
Kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ cung cấp kết qua phân tích có độ đặc hiệu và độ nhạy cao, có khả năng phân tích các hợp chất ở hàm lượng vét. Thiết bị gồm hai phần ghép nói là phần sắc ký (cho phép tách chat) và phần khối phô (phát hiện chat).
Mass spectrometer Injection valve
Autosampler
Syringe Detector
Quadrupoles
Q3
Lenses
= = bởi
E===
Electrospray Sample tray
NAS
Collision cell
Hình 3.2 So đồ tổng quan của hệ thống LC-MS/MS với máy phan tích khối lượng ba
tứ cực (Almomani và ctv, 2022).
3.3.3.2. Điều kiện định lượng lovastatin bằng Hệ thống LC-MS/MS
Ở nghiên cứu này, phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phố (UPLC-MS/MS) với nguồn ion hóa ESI+, pha tinh sử dụng cột UPLC BEH C18, pha động là dung môi acetonitrile được sử dung dé định lượng nồng độ lovastatin có trong sản phẩm nuôi cấy chủng nắm A. terreus ATCC 1012.
Bảng 3.1 Điều kiện, thông số cho quá trình phân tích bằng hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phé UPLC-MS/MS.
Điều kiện sac ky Điều kiện khối pho Hệ thong sắc ký long: Water ACQUITY
Hệ thống khối phố: Xevo TQ-S micro
UPLC H- Class
Cột: ACQUITY UPLC BEH C18 (1,7 ơ
Nguôn ion hóa: ESI + um, 2,1x100 mm)
- Capillary voltage được cai đặt ở 3,00 kV, Nhiệt độ cột: 60 °C
cone 15,00 V
Tốc độ dòng: 0,40 mL/phút Tốc độ dòng: 0,40 mL/phút Pha động A: H20:0,01% acid formic Nhiệt độ nguồn ion hóa: 130 °C
Pha động B: Methanol Desolvation temperature: 350 °C Wash solvent: ACN : H20 (50:50 v/v) Desolvation gas flow: 600 L/hr
Chế độ MRM [MỊ]H' va [M]H,, có năng
lượng Cone (V) va Collision (V) như sau:
405,50 > 199,20 (10/15) va 405,50 >
285,40 (10/15) Purge solvent: ACN : H20 (10:90 v/v)
Trong đó mảnh ion con m/z có cường độ
, - lớn nhất dùng đề định lượng, mảnh con
Thê tích tiêm mâu: 5 pL , ,
thứ 2 có cường độ thâp hơn dùng đê định tính.
3.3.3.3. Phương pháp dựng đường chuẩn
Đường chuẩn được xây dựng dựa trên 5 điểm chuẩn ở các nồng độ 1 ppb, 2 ppb, 10 ppb, 50 ppb, 100 ppb từ chuẩn gốc lovastatin 1000 ppm.
3.3.4. Phương pháp nuôi cấy
Ching nam A. ferreus được cay truyền trên môi trường PDA, ủ ở 25°C trong 7 ngày. Sau đó tiến hành thu bảo tử bang tween 80 và điều chỉnh mật độ đến 107 bao tu/ml. Sử dụng huyền phù bào tử làm dich cấy và bảo quan ở 4°C.
Tiến hành cấy 1 ml huyền phù bao tử vào chai thủy tinh chứa 20 ml môi trường nuôi cấy. U tối trong 10 ngày. Kết thúc quá trình nuôi cấy, toàn bộ sản phẩm nuôi cấy được tách chiết bằng quy trình như Hình 3.1 và phân tích bằng hệ thống Sắc ký lỏng ghép khối phô UPLC-MS/MS.
3.3.4.1. Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy chủng nắm A. terreus sinh tổng hợp
lovastatin.
Tiến hành cấy 1 ml dịch cay vào 20 ml môi trường PDB. Sau đó dem ủ tối ở các mức nhiệt độ 25°C, 30°C và 35°C trong 10 ngày. Kết thúc quá trình nuôi cấy, thực hiện tách chiết và định lượng lovastatin.
Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, phân tích kết quả bằng phần mềm Minitab.
3.3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của một số nguồn cacbon đến khả năng sinh tông hợp lovastatin của chủng nắm A. ferreus.
Thực hiện khảo sát trên 4 nguồn cacbon là Galactose, D-glucose, Sucrose và Lactose. Chuẩn bị 20 ml môi trường nuôi cấy với nồng độ và thành phần môi trường được thé hiện trong Bang 3.1. Nguồn nito ban đầu và thành phần khoáng được lựa
chọn dựa trên nghiên cứu của Rahim và cộng sự vào năm 2019.
Bảng 3.2 Thành phần môi trường của các nghiệm thức khảo sát nguồn cacbon.
STT Ký hiệu Thành phần pH
6 20 g/l Lactose,4 g/l yeast extract, 0.4 g/l KH2PO4, 0.2 g/l 8 MgSO4-7H2O, 0.4 g/L NaCl, và 0.001 g/L ZnSO4-7H20.
20 g/l D-glucose, 4 g/l yeast extract, 0.4 g/l KH2PO4, 0.2 g/l MgSO4-7H2O, 0.4 g/l NaCl, và 0.001 g/l ZnSO4-7H20.
20 g/l Sucrose, 4 g/l yeast extract, 0.4 g/l KH2PO4, 0.2 g/l MgSO4-7H2O, 0.4 g/l NaCl, và 0.001 g/l ZnSO4-7H2O.
20 g/l D-galactose, 4 g/l yeast extract, 0.4 g/l KH2PO4, 0.2 g/1 MgSO4-7H2O, 0.4 g/l NaCl, và 0.001 g/l ZnSO4-7H2O.
Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.
3.3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của một số nguồn nitơ đến khả năng sinh tong
hop lovastatin của chủng nam A. terreus.
Sau khi chon được nguồn cacbon phù hợp (X) từ thí nghiệm trên, tiến hành thí nghiệm khảo sát 3 nguồn nitơ bao gồm: amonium sulfate (AS), cao nam men (YE) va bot dau nanh (SB). Thanh phan khoáng được lựa chọn dựa trên nghiên cứu cua Rahim và cộng sự vào năm 2019. Nong độ va thành phần môi trường được thể hiện trong
Bảng 3.2.
Bảng 3.3 Thành phần môi trường của các nghiệm thức khảo sát nguồn nitơ.
MgSO4-7H2O, 0.4 g/l NaCl, và 0.001 g/l ZnSO4-7H2O.
STT Ký hiệu Thành phần pH
1 ans 4 g/l amonium sulfate, 20 g/l X, 0.4 g/l KH2PO4, 0.2 g/l ‘
MgSO4-7H2O, 0.4 g/L NaCl, và 0.001 g/L ZnSO4-7H2O.
: ep 4 g/l cao nam men, 20 g/l X, 0.4 g/l KH2PO4, 0.2 g/l .
MgSO4-7H2O, 0.4 g/l NaCl, va 0.001 g/l ZnSO4-7H20.
g ss 4 g/l bột đậu nành, 20 g/l X, 0.4 g/l KH2PO4, 0.2 g/l :
Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.