DANH SÁCH CÁC BANG
CHƯƠNG 4. KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả
4.1.1. Hình thái đại thé và vi thé của nấm A. terreus ATCC 1012
Đề định danh sơ bộ đồng thời xác định chất lượng của chủng nắm nghiên cứu, tiễn hành thí nghiệm quan sát hình thái đại thê và vi thể và đối chiếu với mô tả của các bài nghiên cứu trước đây về chủng A. ferreus.
4.1.1.1. Hình thái đại thể
Hình thái đại thé của chủng nam A. ferreus ATCC 1012 sau 7 ngày ủ ở 25°C
được trình bày ở Hình 4.1.
Hình 4.1 Hình thái đại thé nắm A. terreus ATCC 1012. (a), (c) Mặt trước KL; (b), (d)
; Mat sau KL.
Khuan lạc có mau nâu, ria mau trang, mép trơn, có núm tròn (umbonate) lôi lên ở
giữa. Mặt sau KL có màu nâu qué. Tốc độ phát triển nhanh hơn các chủng khác trong cùng chi. Ban đầu KL có màu trắng, sau chuyên thành vàng nâu, cuối cùng chuyên
thành màu nâu.
4.1.1.2. Hình thái vi thể
Từ hình anh vi thể ghi nhận được sợi nam (hypha) có dang phân nhánh, có vách ngăn. Bộ phận sinh bào tử có cấu trúc gồm đính bào đài mọc ra từ tế bào chân, ngọn đính bao đài phinh ra thành bong, tiểu bào dai, trên tiểu bào đài sinh ra các bao tử có hình cầu và có kích thước khoảng 2-5 um.
Hình 4.2 Hình thái vi thé nắm A. terreus ATCC 1012. (a) Chụp dưới vật kính 40X; (b)
Chụp dưới vật kính 1003.
4.1.1.3. So sánh hình thái giữa một số chủng nam thuộc loài A. terreus
Hình thái dai thé va vi thé của chủng nam A. terreus ATCC 1012 trên môi trường PDA ghi nhận được là tương đồng với mô tả của Gautam va ctv vào năm 2012 về chủng A. terreus ITCC 7406.09 và mô tả của Liu và ctv vào năm 2016 về chủng nam
A. terreus FZC3.
Hình 4.3 Hình thái đại thé va vi thé của một số chủng 41. ferreus. (a), (b) Ching A.
terreus FZC3, (Liu và ctv, 2016); (c), (d) Chung A. terreus ITCC 7406.09; (e), ƒ) Chung A. terreus ATCC 1012.
Về hình thái dai thể, chủng A. terreus ATCC 1012 được nuôi trên môi trường PDA có sự tương đồng về hình thái khuẩn lạc nắm, màu sắc và đặc điểm ria khuẩn lạc
so với chủng A. terreus ITCC 7406.09 nuôi trên môi trường MEA va chung 41. terreus
FZC nuôi trên môi trường CDA. Đối với hình thái vi thé, hình thái của đính bào đài phình ra thành bọng được mô tả ở cả 3 chủng, bào tử đính trên tiêu bào đài.
4.1.2. Định lượng lovastatin
4.1.2.1 Xây dựng phương trình đường chuẩn lovastatin
Việc xây dụng đường chuẩn là bước khởi đầu cho công tác phân tích chất đó trên các đối tượng mẫu thí nghiệm khác nhau. Kết quả diện tích peak chất cần phân tích khi thay vào phương trình đường chuẩn sẽ cho nồng độ tương ứng của chất phân tích có trong mẫu.
Đường chuẩn được xây dựng dựa trên 5 điểm chuẩn ở các nồng độ 1 ppb, 2 ppb, 10 ppb, 50 ppb, 100 ppb từ chuẩn gốc lovastatin 1000 ppm. Kết quả được trình bày
trong Hình 3.2 và Bảng 3.1.
s42 8588 25 24
|
T T T T T T T T T T T T T T
300 4.00 sò 8.00 7.00 8.00 9.00 1090 oe
Hình 4.4 Sắc ký đồ của chuẩn lovastatin ở nồng độ 50 ppb.
Sắc ký đồ cho thấy tín hiệu lovastatin xuất hiện dưới dạng peak vào thời điểm phút thứ 5, trong khoảng từ 5,440 đến 5,601. Thời gian này được gọi là thời gian lưu
(TR). Các peak lovastatin trong các sắc ký đồ đều giống nhau về hình dạng. Sự khác
nhau về chiêu cao và độ rộng của các peak lovastatin cho kêt quả khác nhau vê diện tích peak (Sm).
Bảng 4.1 Diện tích peak chuẩn lovastatin ở các nồng độ.
Nồng độ Sm
1 1500,000 2 3749,299 10 10365,863 50 45568,250 100 83472,539
Bang 4.1 đã cho thay có sự gia tăng tuyến tinh của điện tích peak chuẩn lovastatin theo nồng độ. Từ kết quá trên, chúng tôi đã xây dựng được đường chuẩn lovastatin
như Hình 4.4.
90000
80000 y= 826x
70000 60000 50000 40000 30000 20000
10000 | &”
m
...nn Linear Sn
Dién tich peak ®
20 40 60 80 100 120
Nong độ (ppb)
Hình 4.5 Đường chuẩn lovatatin.
Phương trình đường chuẩn y = 826x + 2003,6 được áp dụng cho việc xác định hàm lượng lovastatin có trong các mẫu thí nghiệm. Kết quả thu được từ sắc ký đồ phân tích về điện tích peak lovastatin (Sm), được thế vào phương trình (tương ứng với y), từ đó suy ra được x là nồng độ lovastatin (Cm) có trong mẫu. Hệ số tương quan R? cho
thấy quan hệ giữa thé tích chuẩn và diện tích chuẩn, mức độ tuyến tính. Hệ số tương quan càng gần giá trị về 1, ý nghĩa của phương trình càng lớn, việc tính toán càng chính xác hơn. Ở phương trình đường chuẩn lovastatin, giá trị R7 ghi nhận được là 0,9984 cho thấy phương trình đường chuẩn trên là phù hợp để tính toán hàm lượng lovastatin có trong mẫu.
4.1.2.2 Dinh lượng lovastatin trong môi trường nuôi cấy chủng nam A.ferreus Nhằm khảo sát khả năng sinh tổng hợp lovastatin của chủng nấm 4. ferreus.
Thực hiện cấy bao tử nắm vào 20 ml môi trường PDA, ủ tối ở nhiệt độ phòng trong 10 ngày. Sau đó tiến hành tách chiết và định lượng lovastatin bằng hệ thống UPLC- MS/MS. Kết quả định lượng được thé hiện ở Bảng 4.2.
Bảng 4.2 Nồng độ lovastatin thu được ở các mức nhiệt độ.
. . . Nong độ
Mau Dién tich peak Nong d6 lovastatin (ppb)
trung binh (ppb) Pl 106924,88 127,02
P2 214767,61 257,58 199,03 P3 177501,33 212,47
Từ kết khảo sát cho thay, chủng nam nay có kha năng sinh tổng hợp lovastatin khi được nuôi cấy trong môi trường PDA, nồng độ lovastatin trung bình là 199,03 ppb.
Bên cạnh đó, kết quả còn cho thấy phương pháp định lượng có khả năng xác định nồng độ lovastatin trong sản phẩm nuôi cay chủng A. ferreus.
4.1.3. Khao sát nhiệt độ nuôi cấy chủng nấm A. terreus sinh tổng hợp
lovastatin.
Dé xác định được nhiệt độ nuôi cấy phù hợp, tiến hành khảo sát khả năng sinh lovastatin của nam A. ferreus trên môi trường PDA ở 3 mức nhiệt độ là 25°C, 30°C và 35°C. Kết quả được trình bày ở Bảng 4.3.
Kết quả phân tích phương sai ANOVA và trắc nghiệm phân hạng cho thấy, ở mức nhiệt độ là 25°C thì chủng nam J. terreus cho hiệu qua sinh tổng hợp lovastatin tốt nhất, khác biệt có ý nghĩa so với 2 mức nhiệt độ còn lại. Nồng độ lovastatin ghi
nhận được khi nuôi ching A. ferreus trong môi trường PDB, 25°C trong 10 ngày là 313,35 ppb.
Bang 4.3 Nong độ lovastatin thu được ở các mức nhiệt độ.
Nhiệt độ nuôi cấy (°C)
P
25 30 35
Nồng độ
313,352 +
lovastatin 67,05? + 5,88 3,88°+253 0,000
67,73
(ppb)
Trong cùng một hang, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau
không có sự khác biệt về mặt thông kê (a < 0,05).
4.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của một số nguồn cacbon đến khả năng sinh tong hợp lovastatin của chủng nam A. /erreus.
Các nghiệm thức được ủ tối ở 25°C trong 10 ngày, sau đó tiến hành tách chiết và định lượng lovastatin bằng hệ thống Sắc ký lỏng ghép khối phô LC-MS/MS. Kết quả phân tích được thé hiện ở Hình 4.5 và Hình 4.6.
1 Galactose [J D-glucose [f] Lactose [Jj Sucrose
400-
~_-~
2.
&300-
E
|
gs
œ tị
à 200-
pe)
oOo
= Ð E
2 100-
0-
G $ GL L Nghiệm thức
Hình 4.6 Nồng độ lovastatin trong môi trường với các nguồn cacbon khác nhau.
Kết quả phân tích ANOVA, trắc nghiệm phân hạng cho thấy nồng độ lovastatin cao nhất ghi nhận được là 366,59 ppb, ở nghiệm thức sử dụng nguồn cacbon là lactose.
Với nguồn cacbon là galactose, nồng độ lovastatin là thấp nhất và nồng độ ghi nhận được có giá trị âm. Nguyên nhân có thể do nồng độ lovastatin ở nghiệm thức này thấp
hơn giới hạn định lượng (LOQ) tuy nhiên lại lớn hơn giới hạn phát hiện (LOD) của
máy. Do đó, hệ thống ghi nhận được diện tích peak lovastatin tuy nhiên không thê tính toán chính xác nồng độ lovastatin có trong mẫu. Như vậy, lactose là nguồn cacbon phù hợp nhất và được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
‘Sample Nome: $2_22052023
‘Sample Name: GL1_Z2052023 32 22082023 SmooeMn2:2) Nea 14 chàng, Gut 22060029 SmocevNh 2) MA of 4 chưnnet 5+
6 5400e:002
s.. 78e-GE 120)
100
ca
| tose
||
Ih. lÌ| k
300 + sò se Tho to ob 1000 = abe abo sho ‘abo Tảo D3 sào t3
Hình 4.7 Sắc ký đồ của nghiệm thức D-glucose (GL) và nghiệm thức Sucrose (S).
‘Sample Name: L1, 22052023
Phợxerlerepsekzg grxpcdocl Li 23062003 Sone 2a NER s4 chars
Ot 2208323 2macet 2) MER of . 5+ mar
pe ec — -.. ri sad | secs
326
ie we H3 so The ri) s woo
Hình 4.8 Sắc ký đồ của nghiệm thức Galactose (G) và nghiệm thức Lactose (L).
Nguồn cacbon chủ yếu tác động đến quá trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp trong khi nito là thành phan tác động đến quá trình sinh trưởng của nấm sợi. Sau 10 ngày ủ, trên bề mặt môi trường nuôi cấy hình thành 1 lớp hệ sợi dày khoảng 0,7 cm, mầu trắng và chưa quan sát được sự hình thanh bao tử. Hệ sợi của 4 nghiệm thức cacbon không có sự khác biệt lớn về hình thái và độ dày đặc. Tuy nhiên, có sự khác biệt về màu sắc môi trường nuôi cấy sau thời gian ủ. Cụ thể, ở các nghiệm thức sử dụng nguồn cacbon là lactose và galactose, môi trường sau nuôi cấy có màu vàng. Ở các nghiệm thức sử dụng D-glucose và sucrose làm nguồn cacbon, môi trường sau
nuôi cây chuyên sang mau nâu.
4.1.5. Khảo sat ảnh hướng của một số nguồn nitơ đến kha năng sinh tống hop lovastatin của chủng nắm A. terreus.
Tiến hành nuôi cấy nam A. ferreus trên môi trường chứa đường lactose 20 g/l đóng vai trò là nguồn cacbon. Các thành phần nitơ khảo sát bao gồm amonium sulfate (AS), cao nắm men (YE) và bột đậu nành (SB).
Kết quả phân tích nồng độ lovastatin ở các ngiệm thức AS, YE và SB được thể hiện ở Hình 4.9 cho thấy nguồn cung cấp nito phù hợp nhất có sản xuất lovastatin là bột đậu nành (SB) với nồng độ ghi nhận được là 1157,10 ppb, cao gấp 6,19 lần so với nghiệm thức nitơ hữu cơ còn lại là Yeast extract (YE). Ở nghiệm thức sử dụng nguồn nitơ vô cơ là Amonium sulfate (AS) cho kết quả nồng độ lovastatin là thấp nhất, gần bằng 0.
[l Amonium sulfate J Bột đậu nành [fj Cao nấm men
1250-
;. 3 8
Nồng độ Lovastatin (ppb) 3
AS YE SB
Nghiệm thức
Hình 4.10 Nong độ lovastatin trong môi trường với các nguồn cacbon khác nhau.
EAM of 14 channels. £54
100 bế 7.687es004
OMe ts
Sample Name: YE1_ 08062023
'YE1 08082023 Smooth(Mn.22) MRM of 14 channels,ES+
mau BPI
lovastatin, 1.883e+006
boa 540 “|
7237641 7.2404
la
s43
6.04
T T T + L + T T T T T T T mn
3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
Hình 4.12 Sắc ký đồ của nghiệm thức Yeast extract (YE).
Sample Name: SB1_08062023
S81 08082023 Smeoth(Min,2:2) MRM of 14 channels,ES+
mau BPI
lovastatin 1.787e+0O7
tee 640]
916670 69 9.2005
5.43)
cs
420 L
k T T T t T T T min
"300 40 50 680 70 80 90 (tC
Hình 4.13 Sắc ký đồ của nghiệm thức Bột đậu nành (SB).
Thanh phan nito được xem là có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng của sợi nam. Ở nghiệm thức sử dụng nguồn nitơ vô cơ là amonium sulfate, hệ sợi của chủng nam A. ferreus phát triển rất yêu, chưa bao phủ toàn bộ bề mặt môi trường.
Đối với nghiệm thức sử dụng cao nắm men, hệ sợi kết mạch bao phủ toàn bộ bề mặt môi trường, tuy nhiên vẫn chưa quan sát được sự hình thành bào tử. Ở nghiệm thức sử dụng bột đậu nành làm nguồn cung cấp nitơ, nấm sợi có sự phát triển mạnh mẽ nhất, hệ sợi dày đặc và xuất hiện bảo tử hình thành trên bề mặt.
Hình 4.14 Các nghiệm thức môi trường nuôi cay sử dung các nguồn nito khác nhau.
(a) Amonium sulfate; (b) Cao nam men; (c) Bột đậu nành.
4.2. Thảo luận
Nguồn cacbon và nito có ảnh hưởng quan trọng đến quá trình sinh tông hợp lovastatin của nam A. /erreus. Nghiên cứu trước đây của Rahim va ctv vào năm 2019 thực hiện trên chủng nam A. /erreus ATCC 20542 đã cho thấy thành phần cacbon là lactose cho giá trị nồng độ lovastatin cao hơn so với các nguồn cacbon khác. Đồng thời ở nghiên cứu trên, thành phần nitơ hữu cơ cũng cho giá trị nồng độ lovastatin cao hơn so với nghiệm thức sử dụng nguồn nitơ vô cơ. Kết quả trên là hoàn toàn phù hợp
với kết quả nghiên cứu của đề tài này. Ở nghiên cứu của Casas Lopez và cộng sự vào năm 2003, nguồn cacbon chuyên hóa chậm (disaccharide) được cho là tốt hơn cho quá trình sinh tổng hop lovastatin ở chủng nam A. ferreus. Nguồn cacbon chuyển hóa nhanh (monosaccharide) làm giảm khả năng sinh lovastatin của chủng nam này thông qua cơ chế ức chế dị hóa (Lai và ctv, 2007).
Hiện nay, phan lớn các nghiên cứu về khả năng sinh tong hợp lovastatin được thực hiện trên chủng nam thương mại A. terreus ATCC 20542. Khi thực hiện nuôi cấy qua 2 giai đoạn, tiền nuôi cấy (pre-culture) và nuôi cấy (culture) có khuấy đảo trong môi trường có thành phần cacbon là lactose 20 g/l và nitơ là cao nam men 4 g/l. Ching nắm A. terreus ATCC 20542 có thể sinh tổng hop 25,52 mg/1 lovastatin (Rahim va ctv, 2019). Ở nghiên cứu cua Srinivasan và cộng sự vào năm 2022, san xuất lovastatin từ nước thải chế biến cao lương (sago processing wastewater) bằng phương pháp lên men chìm chủng nam A. /erreus KPR12. Nhóm nghiên cứu đã ghi nhận được có 142,23
mg/l lovastatin nội bào và 429,98 mg/l lovastatin ngoại bào được sinh ra sau 9 ngày
nuôi cay chủng nam nay. Các kết quả trên cho nồng độ lovastatin cao hơn so với nồng
độ lovastatin ghi nhận được trong nghiên cứu này, tuy nhiên quy trình thực hiện cũng
phức tạp hơn, chi phí thực hiện cao hon và khó dé áp dụng ở quy mô lớn.
Đối với kết quả phân tích sắc ký, tín hiệu peak sắc ký của lovastatin xuất hiện kết quả peak đôi (có 2 đỉnh hấp thụ) nguyên nhân do lovastatin tồn tại ở cả 2 trạng thái là
vòng lactone đóng và vòng lactone mở (Hình 2.2). Trong đó, lovastatin ở trạng thái vòng lactone đóng có thời gian lưu lớn hơn (Friedrich và ctv, 1995) và được sử dụng
dé làm thuốc điều trị chứng thừa cholesterol.
Sau khi tiến hành khảo sát nguồn cacbon và nitơ, môi trường với thành phần gồm
20g/1 lactose, 4 g/l bột đậu nành, 0.4 g/l KH2PO4, 0.2 g/l MgSO4-7H20, 0.4 g/L NaCl,
và 0.001 g/L ZnSO4-7H20, pH 7.0 kết quả nồng độ lovastatin là 1,6328 mg/l. Giá trị nồng độ này cao hơn mức ghi nhận được ở môi trường PDB là 0,3134 mg/l cho thay tiềm năng dé tiến hành tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng A. /erreus ATCC 1012 sinh tổng hợp lovastatin.