Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung VEGF trong môi trường nuôi cấy phôi đến sự phát triển phôi heo in vitro

TÓM TẮTNghiên cứu nhằm đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung protein VEGF Yếu tổtăng trưởng nội mao mạch — Vascular Endothelial Growth Factor vào môi trường nuôicay phôi đến sự phát triển

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

ĐÁNH GIA ANH HUONG CUA VIỆC BO SUNG VEGF TRONG MOI TRUONG NUÔI CAY PHÔI DEN SỰ PHÁT

TRIEN PHOI HEO IN VITRO

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌCSinh viên thực hiện : ĐÀO THỊ MAI

Mã số sinh viên : 19126094

Niên khóa : 2019 — 2023

TP Thủ Đức, 03/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

ĐÁNH GIA ANH HUONG CUA VIỆC BO SUNG

VEGF TRONG MOI TRUONG NUOI CAY PHOI

DEN SU PHAT TRIEN PHOI HEO IN VITRO

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

PGS.TS Nguyễn Ngọc Tan Đào Thị Mai

TP Thủ Đức, 03/2024

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành

phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học Sinh học, cùng tất cả quý Thầy Cô

đã tận tình giảng dạy truyền đạt hết mình những kiến thức và kinh nghiệm bồ ích cũng

như tạo điều kiện hết sức cho em trong quá trình em theo học tại trường

Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Ngọc Tan đã tận tình hướng dẫn, cung cấp

kiến thức chuyên môn, bên cạnh đó Thầy còn tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em

hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này Em xin gửi đến Thầy mọi lời chúc tốt đẹp và lòngbiệt ơn vô cùng.

Em xin được gửi lời cảm ơn đến các anh chị, các thành viên tại phòng thí nghiệm Phôi

Động vật RIBE306 đã bên cạnh giúp đỡ, hỗ trợ em từ lúc em mới đặt chân vào phòngthí nghiệm đến khi em hoàn thành khóa luận này

Em xin cam ơn TS Pham Đức Toàn cing tập thé lớp DH19SHA đã luôn bên cạnh giúp

đỡ và cùng nhau học tập với tôi trong suốt 4 năm học theo học tại trường

Lời cảm ơn đặc biệt cuôi cùng con xin được dành cho Bô Mẹ, con xin cảm ơn vì đã sinh

ra con, cho con được đên trường, cho con có thêm dũng khí bước tiép trên mọi hành trình con đi Con xin cảm ơn tình yêu thương từ Bô Mẹ và Anh Chị đã cho con một cuộc sông âm áp và hạnh phúc Con xin chân thành cảm ơn!

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên: Đào Thị Mai, MSSV: 19126094, Lớp: DH19SHA thuộc ngành Công nghệ Sinh

học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là Khóa luận tốt

nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là

hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng

về những cam kết này

Tp Hô Chi Minh, ngày tháng 03 năm 2023

Người viet cam đoan

Hình ảnh hoạt động trong nghiên cứu

TÓM TẮT

Nghiên cứu nhằm đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung protein VEGF (Yếu tổtăng trưởng nội mao mạch — Vascular Endothelial Growth Factor) vào môi trường nuôicay phôi đến sự phát triển phôi đơn tính và biểu hiện gen liên quan đến chất lượng phôi.Phức hợp tế bào trứng — cumulus (COC) có từ 2 lớp cumulus trở lên sau khi thu nhận từnang noãn trung bình được nuôi cấy thành thục (IVM) trong 44 giờ (không bổ sungVEGF) Sau quá trình IVM, các tế bào trứng có thể cực thứ nhất được lựa chọn đưa vào

kích hoạt phôi đơn tinh bằng ethanol 7% kết hợp với 2,5 1M 6-DMAP, sau đó được nuôi

trong môi trường PZM3 có bổ sung VEGF ở các nồng động khác nhau (0; 62,5; 125 và

250 ng/ml) Tỷ lệ phân chia tế bào và hình thành phôi nang được ghi nhận ở thời điểm

24 giờ và 168 giờ sau khi kích hoạt phôi Kết quả cho thấy tỷ lệ phân chia tế bào và hìnhthành phôi nang có sự gia tăng đáng kể (P<0.05) khi nhóm tế bào trứng sau khi kích

hoạt được nuôi trong môi trường PZM3 có bồ sung 125 ng/ml VEGF (24,6 + 2,8%) so

với nhóm không bé sung (11,5 + 2,1) hay bổ sung ở nồng độ 250 ng/ml (11,7 + 1,1).Thêm vào đó, biểu hiện gen Oct-4 trong phôi nang cao ở nhóm phôi thu nhận từ môi

trường nuôi cấy có bổ sung 125 ng/ml VEGF so với không bổ sung (1,12 so với 0,87;

P<0,05), trong khi đó việc bố sung VEGF không ảnh hưởng đến biểu hiện gen Cđx2(1,02 so với 1,05; P>0,05) Vì vậy, việc bố sung protein VEGF ở nồng độ 125 ng/ml vàomôi trường nuôi cấy phôi không những giúp cải thiện tỷ lệ hình thành phôi nang mà còngia tang biéu hién gen Oct-4 ở mức độ mRNA ở giai đoạn phôi nang, lợi thế này cầnđược nghiên cứu đê ứng dụng vào thực tiên sản xuât phôi in vitro.

Từ khóa: nuôi cấy thành thục, tế bào trứng heo, nang noãn trung bình, VEGF, phôi đơn

tính.

The objectives of this study were to evaluate the effect of Vascular Endothelial

Growth Factor (VEGF) protein supplementation on parthenogenetic early embryo development of porcine oocytes derived from medium follicles Cumulus-oocyte

complexes (COCs) with more than 2 layers of cumulus cells were collected from

medium follicles (MF) for in vitro maturation (TVM) in 44 hrs After IVM, the matured oocytes were subjected to parthenogenetic activation by ethanol 7% combined with 2,5

mM 6-DMAP and then the activated oocytes were incubated in PZM-3 medium with

different concentrations of VEGF (0; 62.5; 125 and 250 ng/ml) The activated oocytes were assessed for cleavage at 24 hours and for blastocyst formation at 168 hours post activation and cultured Result showed that the cleavage and the blastocyst rate from treated group with 125 ng/ml VEGF (24.6 + 2,8%) was significantly higher than control (11.5 + 2.1%) or 250 ng/ml (11.7 + 1.1%) In addition, the expression of Oct-4 at mRNA level in blastocysts was high in the group of embryos obtained from culture medium

supplemented with 125 ng/ml VEGF compared to without supplementation (1.12 vs

0.87; P<0.05), in otherwise VEGF supplementation did not affect the expression of Cdx2

at mRNA level (1.02 vs 1.05; P>0.05) Therefore, supplemented VEGF at a

concentration of 125 ng/ml to the embryo culture medium improves the rate of

blastocyst formation and increases Oct-4 gene expression at the mRNA level at the

blastocyst stage, requiring further in-depth study for applying the positive effect of VEGF to promote the in vitro embryo production.

Key words: porcine oocytes, in vitro maturation, medium follicles, WEGF,

parthenogenetic embryos

MỤC LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TẮTT 2- 2222+2E22EE2EE+EE22EE+EE222E22E2222222222222xe2 iTRANH UE HE ` TY eccentric iiBANA SAGE GAC HÌN Hs uáeannaeeeosetdudbdritiinolidstibtgtoditidS05000133069000500180204 850206008 iiiCHƯƠNG 1 MO DAU o.oo coos sce ceseseessessesseseesesecssseseesessesstististisietssssesiessessessessesseseeees 11.1 Đặt vấn đề - 2+ 12212 1221221221221211221211111111111121211111212121212121 re 1L5, Xi tiêu gia à ỚI., « «occececebsthrecooghhetiovriedetorlgEodgo20.d7ogg30842002218080362.012810 37112000 1

1.3 NOi dung thure Win oo eee 2

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU 00.e csccscsecsscssesessessesessesstsessessesseesissessesiesneseseeeees 32.1 Cau tao cơ quan sinh sản của heo Cai cccececscessesseessesseessessesssessessesssessesstessessseeses 3

35 Pieigr te bão THĂNG eusaninnnetiittottioioootpugduoloitfSighigsbigdgtiV04G00120/48008009182.0-4000 1600 5245 HỘI:TATD6i1y500151600161101617551.0 S580 tea nUS 4S Siege ROASTERS PEASE SEE 5

24, Cac phương;pháp kích hoạt phổi::s eesecsssaxeceesaskeEsELkLA45 12.0154 61080 0u2000083006320048806830.3Ú 6DAA, Kiel hoại bằng tính HÙHG cesntcxsncesinnunersissvenveinsnoutinesnnsianiencietuenierstuvaverstase 62.4.2 Kich hoat phoi don tith 5 f

2.5 Yếu tố tăng trưởng VEGF (Vascular Endothelial Growth Faetor) - 8

2.6 Gen Oct-4, Cdx2 và GAPDH o sccscessscsssesssesssesssesssesssessesseessiessissseessessseessessseesseeets 9 26.1 GeMVOGEF Va COG? cũ eee oe ee ee ee ee ee ee 9 2.6.2 Gen GAPDH oeeessesscscsessesssessesssessessesssessesssessesseessessisssessestietitsassssesstessessesseessesseeses 9 || a ea 9 Д7-1, Giới thiểu ETCDPCT - -seseooiekrdovooodiriehoidigiegtornrotiegdoygrdrceinfrdrceoofrdringrdoruedetrtniở 9

2.7.2 Các bước của phản ứng RT-PCR - cee 25+ 2< 2212222 E2 HH HH ưet 10

CHUONG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22©22©5225222222z2zzzzzzez II

E200 800i on ẳắá'<4+‹+*34 11

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2- 2-2 52+2++2E+2E2EE2EEEEZEZEzxzxrrrrrei 113.3 Vật liệu và hĩa chat sử dụng trong thí nghiệm - 2-2 ©52222+2z+2zz+2xze2 ll

3.3.1 Vật GU occ eecccecceesseessesssesssesssesssesssesssesstesssesstessessstessensssssesssessiessseenseesseeasesaneeaees 11

ae 11

33.3) MỚI trường SỬ GUN ieee ssecennesraenerera rasan cents aroutanauepnanemeasnandthamatarenmetaumeas 11

3:3, Phương pháp: Thi MONG Fe ssseesseniiseadstibiesaftetgE944380900143E49001AE54E008:500401340350483E% 12

3.3.1 Thu nhận buồng trứng tại lị mồ - 2 2¿+2222E+2E£2EE2EE22E122E222222122222222e2 12

3.3.2 Thu nhận và phân loại tế bào trứng thu từ nang nỗn trung bình (3 — 7mm) bằngJ001016i15389071989:109800101005 133.3.3 Phương pháp nuơi thành thục tế bào trứng heo in wi#70 . -5 - 15

3.3.4 Phương pháp kích hoạt và nuơi cấy phơi đơn tính -2-2z52z55+¿ 15

3.3.5 Phuong pháp thu nhận mẫu thí nghiệm dé ly trích RNA - 252 l63.3.6 Phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gen mục tiêu -22252 552552252552 l752T 6Í a er 17CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2©22©2222222222222222222z22.cxe2 19

"`" 2Ầ 19

4.1.1 Nội dung 1: Ảnh hưởng của việc b6 sung VEGF ở các nồng độ khác nhau vào

mơi trường nuơi phơi đến sự phát triển phơi heo đơn tính 2 2- 2-52: 19

4.1.2 Nội dung 2: Ảnh hưởng của VEGF đến sự biểu hiện của gen Oct-4, Cdx2 ở mức

đỗ mRNA Gop h Ot nang ái cecs6g tá n01014868010)00389 te HHGHỊSEgẸR.ESHESSERSE2ikEHRSSESEEINSHSGLIG/3-ĐE:14943Đ5380/ 20

I2 ¬0 0H đự,LUI2THtos.eeetssasseeeentoikesbaodiSa,s4.8glidnas:8i20G39105/E45iƠ8druEB:380imS30/3803o1gSEM1r4ti4g2ugSe4G115884kr1ue9:4.mGĐR014010300nng 0g 21CHƯƠNG 5 KET LUẬN VA DE NGHI ccccsscccsssssscsessssssessessscsssssscescssseenceneesecenees 235.1 Kết Wate cc ceccccecccccccceceecscsesececsesececsecececsececsececsesscecsuseceesececseseceeseseceesessvesevsesecevsecees 23

5.2 DG hai Ẽc 23

TÀI LIEU THAM KHẢO - +52 2+E+E+ESEESE2E2E£EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE1711211111111 E2 xe 24

PHU LUC 1 PHU LUC 2

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT6-DMAP_ : 6-dimethyl-aminopurine

COCs : Cumulus - Oocyte Complexes Phức hợp tế bao trứng — cumulus

ICM : Inner Cell Mass Nguyên bao phôi

IVC : In Vitro Cultured Nuôi cấy in vitro

IVF : In vitro Fertilization Thụ tinh trong ông nghiệm

IVM : In vitro Maturation Nuôi cấy thành thục in vitro

ME : Medium Follicles Nang noan trung binh

p-IVP : Porcine In vitro Production Sản xuất phôi lon in vitro

PLCC : Phospholipase C

PZM3 : Porcine Zygote Medium 3

RTKs : Receptor Tyrosine Kinases

TCM : Tissue Culture Medium Môi trường nuôi cay mô

TE : Trophectoderm Khối tế bao lá

VEGF : Vascular Endothelial Growth Yếu tố tăng trưởng nội mao mạch

FactorWHO : World Health Organ1zation Tổ chức Y tế thế giới

ZP : Zona Pellucida Mang zona

DANH SÁCH CÁC BANG

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của các nồng độ VEGF đến khả năng thành thục nhân tế bào trứngthu tir nang nOAn MhO 11 — 18

ii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cấu tạo cơ quan sinh sản của heo cái -2-2¿222222222222E22z22xczxrsrree 3Hình 2.2 Cau trúc của buồng trứng -:- 22 ©22+22+22++2E++2EE+2EE+22E22122x 22x zrrrrrer 4Hình 2.3 Phức hợp tế bào trứng — cumulus -2- 22©2++2++22++E++2E+2z++zzzzxzzzxez 5Hình 3.4, Ô tr ray thổi HN saang nhi hhnhiatiRiiidigidSiOGgiS0G.ANG002G10080A248N3188201000.065130049/8738050 6Hình 2.5 Cấu trúc protein của hai thụ thé VEGFR-1 và VEGFR-2 8Hình 3.1 Mỗi trường TOM = 199) wesccsscrvoeccnnersernuewen ansersveseiersnsrenvernetanewrentennnearuanvenetecs 12Hình 3.2 Phương pháp thu nhận buồng trứng heo tại lò mổ -. -:5- 13Hình 3.3 Choc hút trứng từ nang noãn trung bình -++-<+++<<+++eeexeeexee 14Hình 3.4 TẾ bào trứng có từ 2 đến 3 lớp cumulus - -22©2++2++2szzcs+z 14

Hình 3.5 Hình ảnh tế bao ở giai đoạn thành thục, hai tế bao và phôi nang 15

Hình 4.1 Hình anh đại diện phôi nang thu nhận từ môi trường nuôi cấy có bổ sungVEGF 6 néng d6 khac mhau NA < 19Hinh 4.2 (A) Hinh anh dai dién dién di va phan tich bang dién di gen GAPDH va Oct-

4 trên mẫu phôi nang bang phan mềm ImageJ trên phôi nang thu ở hai nghiệm thức đốichứng va 125 ng/ml VEGF (B) Mức độ biểu hiện của gen Oct-4 trên phôi nang thu từ

nghiệm thức không và có bổ sung 125 ng/ml VEGE -2- 2222+22++2z++zxz+2 20

Hình 4.3 (A) Hình anh đại diện điện di và phân tích bảng điện di gen GAPDH và Cdx2trên mẫu phôi nang bằng phần mềm Image] trên phôi nang thu ở hai nghiệm thức không

và có bổ sung 125 ng/ml VEGF (B) Mức độ biéu hiện của gen Cđx2 trên phôi nang thu

từ nghiệm thức không và có b6 sung 125 ng/ml VEGE -2+©2255+25++cxs>s+ 21

ili

in vitro (p — IVP) đang được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu về: (i) nuôi cấy thành

thục nhân tế bào, thực hiện các biện pháp thụ tinh trong ống nghiệm, kích hoạt phôi đơntính; (11) tạo động vật chuyền gen phục vụ mục đích y tế, hỗ trợ, bảo tồn các loài động

vật quý hiểm có nguy cơ tuyệt chủng và (iii) làm mô hình trong các công tác nghiên cứu

về hỗ trợ sinh sản, làm công cụ trong việc huấn luyện kỹ năng cho sinh viên hay kỹ thuậtviên chuyên về lĩnh vực phôi nhờ tính sẵn có và dễ thu nhận buồng trứng tại lò mồ vớichi phí thấp nhất có thé so với mô hình chuột và thỏ

Yếu tổ tăng trưởng nội mô mach máu (VEGF) là yếu tố điều hòa chính của sự hình

thành mạch sinh lý trong quá trình tạo phôi, phát triển xương và chức năng sinh sản

(Ferrara va ctv, 2003) Việc bổ sung VEGF vào môi trường nuôi cấy hỗ trợ cho quá trìnhhình thành phôi được xem là một hướng đi rất hữu ích cho sự nghiên cứu và phát triển

về kỹ thuật trên phôi heo (Biswas và ctv, 2010; Biswas và Hyun, 2011; Kere và ctv,2014; Nguyễn Thị Ngọc Hân và Nguyễn Ngọc Tắn, 2020; Nguyễn Thanh Ngân vàNguyễn Ngọc Tắn, 2022), phôi bò (Luo va ctv, 2002; Luo và ctv 2006; Anchordoquy

và ctv, 2015), cừu (Cao va ctv, 2009) và chuột (Shimizu và ctv, 2007) Cùng với đó, việcđánh giá được mức độ biéu hiện gen có anh hưởng đến chất lượng phôi (Oct-4 và Cdx2)

sẽ phần nào giúp nhận biết sâu hơn về sự vai trò của VEGF đến sự phát triển và chấtlượng phôi giai đoạn sớm.

1.2 Mục tiêu của đề tài

Đánh giá ảnh hưởng và xác định nồng độ tối ưu của VEGF đến ty lệ hình thành

phôi nang từ nguồn tế bao thu từ nang noãn trung bình; đánh giá sự biểu hiện gen liên

quan đến chat lượng phôi: Oct-4 và Cdx2 ở phôi nang trong điều kiện có và/hoặc không

có bổ sung VEGF trong quá trình nuôi phôi in vitro

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Ảnh hưởng của nồng độ VEGF khác nhau trong môi trường nuôi cấy

phôi đến sự phát triển phôi nang

Nội dung 2: Ảnh hưởng của VEGF đến sự biểu hiện gen liên quan đến chất lượng

phôi (Oct-4 và Cdx2).

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Cau tao cơ quan sinh sản của heo cái

Bộ phận sinh sản của heo cái gôm hai buông trứng nắm trong xoang chậu, đường

sinh dục bao gồm ống dẫn trứng và vòi trứng, tử cung, cô tử cung, âm đạo và âm môn(Hình 2.1), bộ phận này có hai chức năng chính:

1 Sản xuât trứng, tê bào sinh dục cái.

2 Sản xuât hormone progesterone va estrogen.

Uterine corpus

Mỗi buồng trứng được bao quanh bởi một màng mỏng gọi là phễu, hoạt động

như một cái phễu đề thu nhận tế bào trứng khi rụng trứng và chuyền chúng đến ống dẫntrứng Ong dẫn trứng dài khoảng 15 — 26 cm và đóng vai trò là nơi thụ tinh (Oxford

Sandy and Black Pig Foundation Charity) Các nang nguyên thủy là loại nang đầu tiênđược hình thành trong buồng trứng trên heo cái, nang trứng nguyên thủy xuất hiện vàolúc phôi thai được 56 đến 70 ngày, với kích thước nang trứng khoảng 34 ym (Silva vàctv, 2011) Khi các tế bào hạt tăng sinh và tế bào trứng phát triển lớn hơn, chúng bắt đầu

tiết ra một loạt glycoprotein được tập hợp thành một lớp vỏ gọi là zona pellucida, baoquanh tế bào trứng và tách nó ra khỏi các tế bào hạt (Jiang và ctv, 2023) Phôi heo ở

khoảng thời gian từ 75 — 90 ngày tuổi, nang nguyên thủy được kích hoạt và các tế bào

hat det phát triển thành các tế bào hình thoi bao quanh tế bao trứng (Ford và ctv, 2020)

Các nang ở giai đoạn này được gọi là nang sơ cấp có đường kính khoảng 40 um(Westergaard và ctv, 2007) Sau đó, các tế bào hạt đơn lớp của một số tế bào nang sinhsôi nảy nở thành nhiều lớp và các nang này bắt đầu có hệ thống mạch máu riêng và hình

thành các nang thứ cấp xung quanh tế bào trứng (Jiang va ctv, 2023) Trong các giai

đoạn tiếp theo của quá trình hình thành nang trứng, các khoang nhỏ chứa đầy chất lỏngđược hình thành bên trong nang trứng, cuối cùng hợp nhất với nhau dé tạo thành một

khoang đơn lớn hơn (được gọi là hang vi), từ đó tạo thành nang trứng (Rimon-Dahari

và ctv, 2016) Sau khi đã hình thành nang trứng, các nang này sẽ tiếp tục phát triển và ởcác kích thước khác nhau như nang nhỏ (đường kính <3 mm), nang trung bình (đường

Hình 2.2 Cấu trúc của buồng trứng (Nguồn: Stringer và ctv, 2018)

Bộ phận sinh dục của heo cái có hai sừng tử cung, môi con có chiêu dài tử cung

60 — 90 cm ở heo nai không mang thai Chúng hoạt động như một lối đi dé tinh trùng có

thé đi đến ống dẫn trứng và đây cũng là nơi phát triển của thai heo Cô tử cung là điểm

nối cơ giữa âm đạo và tử cung, đây là nơi lắng đọng tỉnh dịch trong quá trình giao phối

tự nhiên và nhân tạo Tử cung giãn ra khi heo trong thời gian động dục nhưng co lạitrong khoảng còn lại của chu kỳ động dục và trong thời kỳ mang thai Âm đạo kéo dài

từ cô tử cung đến âm hộ và đóng vai trò là đường dẫn nước tiểu và heo con khi sinh(Theo Oxford Sandy and Black Pig Foundation Charity).

2.2 Phức hợp tế bao trứng

Các tế bào cumulus kết nối với tế bào trứng có các hình chiếu tế bào chất xuyên

qua lớp màng zona trong suốt, tạo thành phức hợp tế bao trứng — cumulus Các kết nốithông qua các khe hở cho phép vận chuyên các phân tử nhỏ giữa tế bao trứng và tế bào

cumulus, chang hạn như các ion, chất chuyển hóa và axit amin cần thiết cho sự phát

triển của tế bào trứng, cũng như các phân tử điều hòa nhỏ kiểm soát sự phát triển của tếbào trứng Sự giao tiếp hai chiều giữa tế bào trứng và tế bào cumulus rất quan trọng cho

sự phát triển và chức năng của cả hai loại tế bào (Hình 2.3) (Martinez và ctv, 2023)

Theca interna and externa Membrana granulosa cells Antrum (follicular fluid) Corona radiata (granulosa cells) Zona pellucida

Cumulus

oophorous

Hình 2.3 Phức hợp tế bào trứng — cumulus (Nguồn: Shutterstock)

2.3 Phôi nang

Phôi nang (blastocyst) được đặc trưng bởi sự hình thành một khoang chứa đầy

chất lỏng (blastocoel) nằm ở vị trí trung tâm của phôi, được bao quanh bởi một lớp tếbào được gọi là trophectoderm (TE) sẽ hình thành hầu hết các mô ngoài phôi như nhau

thai (Gardner và Harvey, 2015) Ngoài ra, cũng có thé nhìn thấy một khối u nhỏ của các

tế bào được gọi là nguyên bào phôi hoặc khối tế bào bên trong (Inner Cell Mass - ICM,

từ đó các mô của thai hình thành và phát triển) Khoảng 7 ngày sau khi thụ tinh, mang

trong suốt (zona pellucida) bao quanh phôi nang bị phá vỡ, cho phép nó làm tổ ở tử cung,đây chính là thời điểm đánh dấu sự kết thúc của giai đoạn mầm trong quá trình tạo phôi(Hình 2.4) (Isa và ctv, 2023).

Hình 2.4 Cau tạo phôi nang (Nguon: Isa và ctv, 2023)

2.4 Các phương pháp kích hoạt phôi

Dé có thé thụ tinh thành công, cần phải kích hoạt tế bào trứng, gồm một chuỗi

truyền tín hiệu tạo ra sự chuyên đổi tế bào trứng thành phôi lưỡng bội Trong quá trình

kích hoạt tế bào trứng, nồng độ canxi nội bào dao động liên tục gây ra hiện tượng xuấtbào của các hạt vỏ não, các enzyme chứa trong hạt này được giải phóng vào khoang

quanh hoàng thé, dẫn đến sự biến đổi của màng zona (ZP), ngăn can sự xâm nhập của

tinh trùng vào phía trong ZP Sự giải phóng canxi nội bao (Ca?) lưu trữ trong mạng lưới

nội chat (ER) được xem là một yếu tố cần thiết dé bat đầu cho việc kích hoạt tế bàotrứng (Anifandis va ctv, 2016).

2.4.1 Kich hoat bang tinh tring

Theo nghiên cứu của Anifandis va ctv (2016), tinh trùng có sự xuất hiện củaphospholipase C (PLC@), khi PLCC khuếch tán vào tế bào chất sẽ làm cho canxi nội baodao động theo các chu kỳ khác nhau dẫn đến sự giải phóng Ca? vào noãn bào sau quá

trình hợp nhất giao tử Cũng đã có nhiều nghiên cứu sử dụng tinh trùng dé thụ tinh cho

tế bào trứng đã thành thục về nhân trên mô hình tế bao trứng heo (Biswas và ctv, 2011;

Sakurai và ctv, 2013; Biswas và ctv, 2018; Linh và Hiep, 2020) hay trên mô hình tế bàotrứng bò (Luo va ctv, 2002; Luo va ctv 2006; Anchordoquy và ctv, 2015).

2.4.2 Kích hoạt phôi đơn tính

Kích hoạt tế bào trứng bằng tinh trùng là một quy trình phức tạp, cả về các bước

và thời gian thực hiện, vì vậy, các phương pháp thay thế khác như phương pháp bằng

xung điện hay bằng hóa học được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong các nghiên cứutrên thế giới (Hosseini và ctv, 2008)

Kích hoạt bằng xung điện: xung điện với thời gian nano giây ở một điện trường vừa

phải đã được nhận thấy rằng có ảnh hưởng đến nồng độ Ca?' trong tế bào Việc kíchthích bằng xung điện khiến cho lượng canxi nội bào tăng đột ngột nhờ sự giải phóngCa?" được lưu trữ trong mạng lưới nội chất (ER) (Buescher và ctv, 2004) vào tế bào chất

và tạo ra sự dao động Ca?* nội bào, từ đó hỗ trợ cho sự phát triển phôi đơn tính (Koo vàctv, 2008; Liu và ctv, 2015).

Kich hoat bang calcium ionophore: khi kich hoat bang calcium ionophore sé tao ra sutác động đến tế bao trứng nhờ lượng Ca?” ngoại bao (Wang va ctv, 1999), hóa chat nàyđược sử dụng khá phố biến trong các nghiên cứu trên heo (Wang va ctv, 1998; Wang vàctv, 1999; Wang va ctv, 2000; Asano va Niwa, 2004), trên bò (Hosseini va ctv, 2008; Milazzotto va ctv, 2008) va chuột (Nikiforaki va ctv, 2016).

Kích hoạt bang ionomycin: ionomycin được báo cáo là có tác dụng tăng cường Ca?"trong tế bào, nhưng thay vì trực tiếp tạo điều kiện thuận lợi cho việc vận chuyên Ca”

qua màng sinh chất, nó huy động Ca?* nội bào từ màng sinh chất, từ đó kích hoạt tế bào

trứng thành thục thành phôi đơn tính Các nghiên cứu sử dụng ionomycin nhằm kích

hoạt phôi đơn tính trên heo như Alfonso và ctv, 2008; Cheng và ctv, 2007; Cervera và

ctv, 2010, trên bò (Ferreira va ctv, 2007, Shen va ctv, 2008).

Kích hoạt bang ethanol: với thời gian thích hợp, ethanol có thé kích hoạt tế bào trứng

bằng cách thúc day tăng cường InsP3 nhanh chóng làm cho Ca?* được giải phóng thông

qua kích thích InsP3 hình thành ở màng sinh chat Các nghiên cứu trên thé giới cũng đãchứng minh rằng, tế bào trứng được kích hoạt bằng ethanol có sự hình thành phôi đơntính vô cùng khả quan, kết quả được ghi nhận từ mô hình thực nghiệm thực tế trên mô

hình tế bào trứng heo (Yi và Park, 2005; Cheng va ctv, 2007), dê (Kharche và ctv, 2013),

hay bò (Méo va ctv, 2004; Hou va ctv, 2009).

2.5 Yếu tố tăng trưởng VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)

Yếu tố tăng trưởng nội mao mach (VEGF) là yếu tố điều hòa chính của sự hình

thành mạch sinh lý trong quá trình tạo phôi, phát triển xương và chức năng sinh sản.VEGF cũng có liên quan đến sự hình thành mạch máu bệnh lý liên quan đến khối u, rốiloạn thần kinh nội nhãn và các tình trạng khác Theo Ferrara và ctv (2003), tác dụngsinh học của VEGF được điều hòa trung gian bởi hai thụ thé tyrosine kinases (RTKs),VEGFR-1 và VEGFR-2 và cấu trúc hai thụ thé được minh họa ở Hình 2.5

Hình 2.5 Cau trúc protein của hai thụ thể VEGFR-1 (A) và VEGFR-2 (B) (Nguồn:

và Hyun, 2011), sự ảnh hưởng tích cực này còn thé hiện trên các nghiên cứu về phôi bò

(Luo và ctv, 2002; Luo và ctv 2006; Anchordoquy và ctv, 2015), cừu (Cao và ctv, 2009)

và chuột (Shimizu và ctv, 2007).

2.6 Gen Oct-4, Cdx2 va GAPDH

2.6.1 Gen Oct-4 va Cdx2

Trong quá trình phát triển ở giai đoạn sớm của động vật có vú, su phân chia dòng

tế bào đầu tiên xảy ra trong quá trình chuyền từ phôi dâu sang giai đoạn phôi nang khi

phôi bào biệt hóa thành khối tế bào bên trong (ICM) và lá nuôi dưỡng (TE) ICM là một

nhóm các tế bào đa năng được gắn vào bên trong TE tạo ra mô phôi bao gồm ngoại bì,

trung bì và nội bì (Pedersen và ctv, 1986) Ngược lại, TE là một lớp tế bào phân cực bao

quanh phôi, tạo thành nhau thai (Kunath và ctv, 2004; Cross, 2005) Sự phân chia dòngICM và TE được quy định bởi sự tương tác của nhiều gen khác nhau Trong phôi chuột,các yếu tố phiên mã của miền POUSF1 (Oct-4) và caudal-related homeobox 2 (Cdx2)đóng vai trò then chốt trong sự phân chia ICM và TE Trong phôi chuột, các yếu tố phiên

mã 4 và Cdx2 là cần thiết cho sự phân chia và chức năng của dong ICM va TE

Oct-4 biểu hiện chuyên biệt trong ICM sau khi hình thành blastocoel, điều này cần thiết choviệc duy trì tính đa năng của tế bào và sự biệt hóa thành epiblast của tế bào (Palmieri vàctv, 1994; Nichols va ctv, 1998) Ngược lại, Cdx2 là yếu tố phiên mã đặc hiệu cho TE(Strumpf và ctv, 2005) Mức độ biểu hiện mRNA của Oct-4 trong ICM trong phôi nang

bò và lợn cao hơn so với TE Ngược lại, mức độ của biểu hiện mRNA của Cdx2 trong

tế bao TE ở bò và lợn cao hơn so với dong ICM Từ nghiên cứu này cho thay Oct-4 và

Cdx2 có thé kiểm soát sự khác biệt của ICM va TE trong phôi bò và lợn (Sawai, 2021).2.6.2 Gen GAPDH

Gen GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) được thé hiện trênmoi té bao, không phụ thuộc vào thể loại, trạng thái hoạt động hay nguồn gốc nên được

dùng như một gen nội chuẩn dé đánh giá sự hiện diện và chất lượng của sản phẩm RNA

(Đặng Thị Tuyết Minh và Lê Thị Phượng, 2014)

2.7 RT-PCR

2.7.1 Giới thiệu RT-PCR

RT-PCR kết hợp phản ứng sao chép ngược với khuếch đại dựa trên PCR dé tạo

ra cDNA từ mRNA Trình tự RNA đóng vai trò là khuôn mẫu cho enzyme phiên mã

ngược DNA chuỗi đơn thu được sau đó đóng vai trò là khuôn mẫu cho PCR RT-PCR

thường được ứng dụng trong các nghiên cứu về bệnh di truyền và sự biéu hiện gen ở cácloại mô, loại tế bào khác nhau và theo thời gian phát triển khác nhau (Bachman, 2013).2.7.2 Các bước của phản ứng RT-PCR

Một phản ứng RT-PCR bao gồm hai giai đoạn chính:

Giai đoạn 1: Phan ứng phiên mã ngược tông hợp đoạn cDNA

Đây là bước chuyền đôi RNA thành mẫu cDNA, một yếu tố quan trọng trong việc thực

hiện phản ứng RT-PCR (Bustin và ctv, 2005).

Giai đoạn 2: Phản ứng PCR, tổng hợp DNA từ đoạn cDNA trên, mỗi phan ứng PCRgồm ba phan, ba phan này sẽ được lặp lại theo một chuỗi các chu kỳ từ 25 — 35 chu kỳ.Giai đoạn biến tính: ở giai đoạn này, DNA mạch đôi tách thành mạch đơn nhờ nhiệt độcao (94 — 96 °C) giúp phá vỡ các liên kết hydro ở hai mạch

Giai đoạn bắt cap: các primer sẽ bắt cặp vào hai mạch của DNA mục tiêu, lúc này nhiệt

độ sẽ được giảm xuống phù hợp với nhiệt độ bắt cặp của primer được sử dụng trongtùng phan ứng.

Giai đoạn kéo dài: dưới sự tác động của enzyme Taq polymerase đoạn DNA sẽ tổng hợpsợi DNA mới bổ sung với DNA khuôn bang cách thêm dNTP theo nguyên tắc bé sungtheo chiều 5' đến 3', phản ứng trùng ngưng xảy ra giữa nhóm 5’ — phosphate của dNTPvới nhóm 3' — hydroxyl phía cuối của sợi ADN vừa mới được hình thành Thời gian củagiai đoạn kéo dài phụ thuộc vào ADN polymerase và độ dài của đoạn DNA cần khuếch

đại.

Kết thúc quá trình RT-PCR sẽ thu được sản phẩm DNA mạch đôi mục tiêu từ mẫu RNAban đâu.

10

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Tế bao trứng heo thu từ nang noãn có kích thước trung bình (medium follicle -ME,

đường kính 3 — 7 mm), buồng trứng heo được thu nhận tại lò mô địa phương (Dĩ An,

Bình Dương).

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 03 năm 2023 đến tháng 12 năm 2023

Địa điểm thực hiện: Phòng Công nghệ Phôi Động vật — Phòng RIBE306, Viện Nghiêncứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

3.3 Vật liệu và hóa chất sử dụng trong thí nghiệm

3.3.1 Vật liệu

Buông trứng heo được lấy từ heo tơ khoảng từ 5 đến 7 tháng tuổi, có trọng lượng

trung bình từ 80 — 100 kg được thu nhận tại lò mồ Út Hảo (thị xã Di An, tinh BìnhDương) ngay sau khi giết mô

3.3.2 Hóa chất

Tất cả các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này được nhập từ công ty Sigma —

Alrich (Hoa Kỳ) và một số công ty khác được ghi cụ thé ở phần Phụ lục 1

3.3.3 Môi trường sử dụng

Môi trường bảo quản buồng trứng: Nước muối sinh lý (Vinh Phúc — Việt Nam) 0.9%

NaCl được bé sung thêm 0.2% (v/v) kháng sinh Penstrep — 400 (Interchemie, Hà Lan)

Môi trường rửa va bảo quản tế bào trứng (dung dịch D — PBS): Dulbecco’s Phosphate

Buffered Saline solution (D - PBS) không chứa Mg?' và Ca?*, được dùng dé rửa và bảoquản phức hợp tế bào trứng — cumulus Thành phan và cách pha chế được ghi ở Bảng 3,Phụ lục 1.

Môi trường nuôi cấy tế bao trứng cơ bản là môi trường TCM — 199 chứa Earl’s salt, L —glutamine va Sodium bicarbonate (Sigma M4530, Hoa Kỳ), bổ sung thêm 10% dichnang noãn, 0.8% BSA (Bovine Serum Albumin), 100 IU/mL khang sinh ABAM Bồ

II

sung 10 [U/mL hCG (human Chorionic Gonadotropin) cho môi trường nuôi cấy trong

22 giờ dau [TCM (+)] và không bổ sung hormone cho môi trường nuôi cấy trong 22 giờ

sau [TCM (-)].

Hình 3.1 Môi trường TCM — 199.

3.3 Phương pháp thí nghiệm

3.3.1 Thu nhận buồng trứng tại lò mỗ

Thu nhận buồng trứng heo từ hai bên tử cung của heo sau khi mồ, sử dung kéocắt sát vào cudng buồng trứng Chọn lọc và thu lay nhưng buồng trứng có chứa nang

noãn trung bình, các buồng trứng có hoàng thể sẽ được loại bỏ Sau khi thu nhận, buồngtrứng sẽ được trữ trong bình Duran 100 mL có chứa sẵn dung dịch bảo quản buồng trứng(nước muối sinh lý bé sung kháng sinh) Khi đủ số buồng trứng, tiến hành rửa sạch qua

2 lần dung dịch trên rồi bảo quản trong bình giữ nhiệt và duy trì ở nhiệt độ 37 — 38°C

Quá trình thu mẫu và vận chuyên về phòng thí nghiệm trong vòng 2 giờ Sau khi vềphòng thí nghiệm, buông trứng được rửa lại 3 lần và ngâm trong dung dich bảo quan

12

buồng trứng Giữ buông trứng trong bồn ủ nhiệt ở nhiệt độ 37°C trong suốt quá trìnhchọc hút nang noãn.

Hình 3.2 Phương pháp thu nhận buồng trứng heo tại lò mồ

3.3.2 Thu nhận và phân loại tế bào trứng thu từ nang noãn trung bình (3 - 7mm)

bằng phương pháp chọc hút

Sử dụng syringe 10 mL và đầu kim 18G đề tiến hành chọc hút và thu nhận phứchợp tế bào trứng — cumulus đối với những nang trung bình (3 — 7 mm) Trước khi chọchút, dùng khăn giấy sạch thắm bớt máu trên bề mặt buồng trứng Khi chọc hút, mặt vatcủa kim tiêm cần được úp xuống phía dưới bề mặt buồng trứng dé tránh bỏ sót tế bàotrứng vì phức hợp tế bào trứng — cumulus bám ở dưới đáy nang Ngoài ra, dé tránh tìnhtrang áp suất lớn lam mất trứng nên đặt mũi kim ở vị trí cách nang noãn muốn chọc hútkhoảng 3 — 5 rồi từ đó đưa vào nang noãn và hút tế bao trứng Dịch nang noãn sau khichọc hút được bơm vào ống falcon 15 mL đã chuẩn bị sẵn trong bề ổn nhiệt, duy trì nhiệt

độ trong bé ở 37°C suốt quá trình chọc hút

13

Hình 3.3 Chọc hút trứng từ nang noãn trung bình.

Sau 15 phút dé lắng, dùng pipette nhựa hút phan dịch lắng chuyên sang dia petri

® 90, sử dụng ống gân y tế và pipette thủy tinh kéo sẵn dé tìm kiếm phức hợp tế baotrứng — cumulus bằng kính hiển vi soi nôi Phức hợp tế bao trứng — cumulus được chuyềnsang đĩa ® 35 chứa 2 mL dung dịch rửa D — PBS Dựa trên hình thái của phức hợp tếbào trứng — cumulus dé phân loại tế bào trứng thành loại A, B, C và D Những tế bàotrứng loại A và B được rửa lại 3 lần với TCM (+) rồi chuyền vào vi giọt nuôi cấy

14