Khóa luận tốt nghiệp Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm của chủng xạ khuẩn THsd sinh kháng sinh chống bệnh hại cây trồng

Việc sử dụng các loại hóa chất trong sản xuất nông nghiệp đã làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ con người, vật nuôi, gây ô nhiễm môi trường và mất cân bằng sinh thái.. Xạ khuẩn là m

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TAOTRƯỜNG ĐẠI HOC SU PHAM TP.HO CHÍ MINH

KHOA: SINH VAT

Me % %

LÊ THỊ THANH NGA

ĐỀ TÀI

“NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA CHỦNG XẠ

KHUAN THsp SINH KHÁNG SINH CHÔNG

BỆNH HAI CÂY TRÔNG ”

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

CHUYÊN NGÀNH VI SINH

GVHD: TS TRẦN THỊ THANH

T.P Hồ Chí Minh 05-2001.

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHOA 1997- 2001 GVHD:TS Trần Thị Thanh

Em xin bày tô lòng biết on sâu sắc đến TS TRAN THỊ THANH, người đã

tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện để tài này.

Luận văn hoàn thành được sự giúp đỡ của: TS PHÙNG TUẤN CẨM,

GS DOAN CẢNH Viện trưởng viện sinh thái, thay LÊ DUY THẮNG cán bộ

giảng dạy trường DH Khoa Hoc Tự Nhiên, cùng toàn thể quý thầy, cô, anh chị

công tác tại phòng thí nghiệm Vi sinh - Sinh hóa — Sinh lý thực trường ĐH Sư

Phạm Thành phố Hồ Chí Minh Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu

đó.

Cảm ơn các anh chị, các bạn đồng môn đã động viên, giáp đỡ tôi trong

Một lần nữa em xin chân thành cdm on.

T.P Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2001.

LÊ THỊ THANH NGA

SVTH: Lê Thị Thanh Nga

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997- 2001 GVHD:7S Trần Thị Thanh

CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN

CKS: Chất kháng sinh

KTKS: Khuẩn ty khí sinh KTCC: Khuẩn ty cơ chất

TTNS: Tuyến trùng nốt sưng

SVTH: Lê Thị Thanh Nga

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997- 2001 GVHD:7S Trần Thị Thanh

LỜI MỞ ĐẦU

Hàng năm các loại dịch hại cây tréng đã gây những tổn thất to lớn

cho sản xuất nông nghiệp, trước tình trạng đó con người sử dụng các loại

thuốc hóa học để phòng trừ dịch hại nhằm hạn chế tác hại đo chúng gây

ra Việc sử dụng các loại hóa chất trong sản xuất nông nghiệp đã làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ con người, vật nuôi, gây ô nhiễm môi

trường và mất cân bằng sinh thái Để xây dựng một nền nông nghiệp sạch

và bền vững cần hạn chế đến mức thấp nhất việc sử dụng các chất hóa học

tổng hợp Vì vậy, hiện nay các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu tìm

ra các chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc tự nhiên ( kháng sinh, các

chất kích thích sinh trưởng ) để ứng dụng cho sản xuất nông nghiệp

Trong đó, các CKS có nguồn gốc vi sinh vật ( đặc biệt từ xạ khuẩn ) đang

rất được chú ý

Để góp phan tìm hiểu khả năng ứng dụng của CKS từ xạ khuẩn

trong sản xuất nông nghiệp, đặc biệt trong lĩnh vực phòng trừ bệnh hại cây

trồng chúng tôi thực hiện để tài “ Nghiên cứu đặc điểm của chủng xạ

khuẩn THs, sinh kháng sinh chống bệnh hại cây trồng ”

SVTH: Lê Thị Thanh Nga Trang |

LUẬN VAN TỐT NGHIỆP KHOA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

Phan I

TONG QUAN TAI LIEU

0 lực nh sự nghiên cứu chat khang sini AS):

Nhà vi sinh vật hoc người Anh Alexander Fleming là người đầu tiên

đặt nén móng cho khoa học nghiên cứu CKS Ông đã phát hiện ra penixilin

trong khi tiến hành thí nghiệm nuôi cấy vi khuẩn Staphylococcus aureus

trên đĩa thạch, tình cờ một bào tử nấm xanh trong không khí rơi vào Ông

quan sát thấy hiện tượng kỳ lạ: xung quanh khuẩn lạc của nấm xanh xuấthiện một vòng tròn trong suốt không có vi khuẩn này phát triển Điều đó

chứng tỏ loại nấm xanh đã sinh ra một chất ức chế và tiêu diệt

S.aureus.Ong đã phân lập và định loại vi nấm này là Penicillium notatum

và đặt tên cho chất kháng khuẩn là penixilin

Fleming đã cấy chủng nấm này vào môi trường dịch thể và phát hiện

dịch nuôi cấy cũng có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh.

Tháng 2-1929 Fleming công bố kết quả phát hiện vé khả năng ức chế vi

khuẩn của nấm Penicillium notatum tại câu lạc bộ y học Luân Đôn Thời

đó do còn nhiều hạn chế của khoa học kỹ thuật penixilin chưa được tinh

chế nên công trình của Fleming đã bị lãng quên.

Khi chiến tranh thế giới thứ hai diễn ra ngày càng ác liệt, nhu cầu cấp bách phải chữa trị vết thương nhiễm trùng cho các binh lính thì pinixilin

của Fleming mới được quan tâm trở lại Nhờ sự giúp đỡ của một nhóm các

nhà khoa học bao gồm Abraham, Chain, Florey thì penixilin đã được tỉnh

chế thành công và khẳng định giá trị to lớn của nó trong công tác điều trị

bệnh nhiễm trùng Kể từ đó penixilin chính thức được dùng để chữa bệnh

và cũng từ đó trong lịch sử y học xuất hiện một kỷ nguyên mới, kỷ nguyên

CKS chính thức ra đời.

Tốc độ tìm kiếm CKS ngày càng được đẩy mạnh Có thể nói thời kỳ

hoàng kim của CKS là những năm 1939-1959 Hàng loạt các CKS đã được

tách chiết và xác định như: streptomixin, neomixin, gramixidin,

clotetraxiclin, erytromixin Và ngày nay nhiều CKS mới vẫn đang được

SVTH:L2ThjThankNga—itst—‘“‘séSCSTM*;*;*;*;*‘* CMD:

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

tiến hành tìm kiếm và phát hiện Nếu năm 1940 chỉ có một CKS đầu tiên

là penixilin được phát hiện thì đến năm 1980 đã có tới 5.500 chất (trong đó

có 4.000 chất từ xạ khuẩn) Tuy nhiên chỉ có 2- 4% CKS đủ tiêu chuẩn để

sử dụng rộng rãi trong thực tiễn y học CKS không những dùng để chữa

bệnh nhiễm trùng mà còn sử dụng chống bệnh ung thư Ngay từ nhữngnăm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng phòng chống bệnh và kích

thích tăng trưởng cho động vật nuôi CKS còn được nghiên cứu để sử dụng

trong công nghiệp chế biến và bảo quản lương thực thực phẩm [5,trang 3].

Ở Việt Nam từ năm 1951-1952 giáo sư Đặng Văn Ngữ đã nghiên cứu

sản xuất dịch lọc penixilin để rửa vết thương cho thương binh trong chiến

dịch Thu - Đông Năm 1955 dưới sự lãnh đạo của giáo sư Đặng Văn Ngữ

những tinh thể penixilin đầu tiên được ra đời {6, trang 6] Tuy nhiên do còn

nhién nguyên nhân mà việc nghiên cứu sản xuất CKS của nước ta còn

nhiều hạn chế

Công việc nghiên cứu CKS đã, đang và sẽ là để tài thu hút sự quan

tâm của nhiều nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên thế giới.

Có thể nói công nghệ sản xuất CKS đang là một trong những hướng phát

triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học

II Xa khuẩn và CKS có nguồn gốc xe khuẩn:

1 Đặc điểm của xa khuẩn:

Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật đơn bào, phân bố rộng rãi trong tự

nhiên Về mặt cấu tạo, xạ khuẩn có nhiều nét khác với nấm mốc nhưng lại

giống với vi khuẩn: kích thước xạ khuẩn tương tự kích thước vi khuẩn, xạ

khuẩn chưa có nhân phân hoá, thành tế bào xạ khuẩn không chứa

xenluloza hay kitin, tế bào phân chia theo kiểu phân bào vô ty, xạ khuẩn

không có giới tính.

Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ khuẩn ty phát triển như hệkhuẩn ty của nấm mốc, phân nhánh và không có vách ngăn Hệ khuẩn ty

bao gồm rất nhiều khuẩn ty kết lại với nhau tạo thành từng búi Kích thước

và khối lượng của hệ khuẩn ty thường không ổn định, tuỳ thuộc vào từng

loài và điều kiện nuôi cấy.

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

Trong môi trường dịch thể, xạ khuẩn không làm đục môi trường như

vi khuẩn mà mọc thành một lớp màng trên bể mặt hoặc lắng ở đáy bình

thành từng đám như những sợi bông.

Khi nuôi cấy trên môi trường thạch, dựa vào hướng phát triển trong và

ngoài của hệ khuẩn ty đối với môi trường mà người ta chia thành hai loạikhuẩn ty: khuẩn ty khí sinh (KTKS) và khuẩn ty cơ chất (KTCC) KTCCcắm sâu vào môi trường để hấp thu nước và thức ăn KTKS phát triển trên

bể mặt môi trường.

Phần cuối của KTKS tạo thành cuống sinh bào tử Cuống sinh bào tử

dài, ngắn khác nhau tuỳ từng loài xạ khuẩn Cuống sinh bào tử có thể

thẳng, lượn sóng, uốn cong, xoắn lò xo, xoắn ốc, xoắn hình mốc câu

Chúng có thể phân bố theo kiểu mọc đơn, hay mọc vòng, mọc thành chùm.

Hình thái cuống sinh bào tử là đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn

Bào tử của xạ khuẩn được hình thành từ cuống sinh bào tử, thường có hình

câu, hình ovan, hình trụ Bé mặt bào tử có các dang: nhấn, dang gai, dang

xù xi.

KTKS phát triển tạo thành các khuẩn lạc thường chắc, xù xì, có dangvôi, dạng lông tơ, dạng nhung hay bột mịn chúng thường có các mau: đỏ,

lục, xám, đen, Một số xạ khuẩn tiết các sắc tố tan trong môi trường nuôi

cấy Kích thước của khuẩn lạc xạ khuẩn có thể thay đổi tùy từng loài vàtừng diéu kiện nuôi cấy, mỗi khuẩn lạc thường có đường kính từ 0,5-2mm,

có loài khuẩn lạc có đường kính 10mm Khuẩn lạc xạ khuẩn có ba lớp: lớp

vỏ ngoài, lớp trong, lớp giữa Lớp ngoài gồm các sợi bện chặt lại với nhau,

lớp trong tương đối xốp hơn, còn lớp giữa có cấu trúc tổ ong

Về cấu tạo tế bào, tế bào xạ khuẩn có cấu tạo tương tự tế bào vi

khuẩn Gồm có: thành tế bào, màng nguyên sinh chất, tế bào chất, chấtnhân, các hạt dự trữ, không bào.v.v

Thành tế bào: gồm 3 lớp: lớp ngoài dày khoảng 60 -120A°, khi khuẩn

ty già lớp này có thể dày đến 150 - 200 A° được cấu tạo từ lipit Lớp giữa

rắn chắc dày khoảng 50 A°, lớp trong dày khoảng 50 A° Thành tế bào còn

chứa nhiều enzim và tham gia vào quá trình trao đổi chất.

SVTH: Lê Thị Thanh Nga Trang 4

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

Màng nguyên sinh chất: dày khoảng 50 nm, được cấu tạo bởi 2 thành

phần photpholipit và protein Chức năng chủ yếu của mang là diéu hoà sự

hấp thu các chất dinh dưỡng vào tế bào

Tế bào chất của xạ khuẩn tương tự tế bào chất của vi khuẩn, bêntrong chứa nucleotit, không bào, các hạt dự trữ nhưng không có ty thể

Xa khuẩn thuộc cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng sử dụng được làtỉnh bột, đường, axit hữu cơ, polysacarit, protein, Nguồn nitơ vô cơ thường dùng là muối amon, muối nitrat, Nguồn nitơ hữu cơ thường là pepton,

protein ,cao ngô ,cao nấm men.

Đa số xạ khuẩn là sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, một số xạ khuẩn ưa nhiệt

Xạ khuẩn thường phát triển tốt trong môi trường pH trung tính, hơi kiểm.

ˆ + »* +

Xa khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên : trong đất, nước ao hổ, một

phần trong bùn và trong các chất hữu cơ khác Quan trọng và đáng chú ý

hơn cả là xạ khuẩn trong đất Ở nhiều vùng trên thế giới số lượng xạ

khuẩn trong đất chiếm 20-40% tổng số các vi sinh vật trong đất (6, Trang

7] Số lượng xạ khuẩn trong đất không chỉ phụ thuộc vào loại đất mà còn

phụ thuộc vào mức độ canh tác của đất và khả năng bao phủ của thực vật.

Xạ khuẩn có mặt trong tất cả các loại đất và vào các mùa trong năm, đất

giàu dinh dưỡng và lớp đất trên bể mặt (khoảng 40 cm) thường gặp số

lượng rất lớn xạ khuẩn, tuy nhiên số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thayđổi theo thời gian trong năm

Xạ khuẩn là một trong những loại vi sinh vật đóng vai trò quan trọng

trong tự nhiên, chúng tích cực tham gia vào các quá trình chuyển hoá các

hợp chất trong đất, trong nước.

Trong quá trình trao đổi chất xạ khuẩn còn có thể sinh ra các loại chất

hữu cơ: Vitamin nhóm B, một số axít hữu cơ như axít lactit, axetic các

loại enzim như: proteaza, amilaza và các chất kích thích sinh trưởng thực

vật.

Một số loài thuộc chi Frankia có khả năng tạo nốt sin ở những cây

không thuộc bộ đậu và có khả năng cố định nito.

SVTH: Lê Thị Thanh Nga Trang 5

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

Đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS,

khoảng 60-70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng này Cho tới

nay, hơn 6000 CKS được biết thì có khoảng 60% CKS có nguồn gốc xạkhuẩn [5, trang 4]

Bên cạnh các đặc điểm có lợi của xạ khuẩn, một số xạ khuẩn có thể

sinh ra những chất độc kìm hãm sự sinh trưởng của thực vật Một số khác

là nguyên nhân gây ra những bệnh ở người và gia súc

Trong xạ khuẩn có hai chỉ quan trọng nhất được phân bố rộng rãi

trong tự nhiên và có thành phan loài phong phú là Streptomyces và

Norcadia.

3 Các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn:

3.1 Hoạt tính sỉ c của CKS từ xa khuẩn :

Trong quá trình sống xạ khuẩn sinh ra các chất có khả năng ức chếhay kìm hãm hoàn toàn sự sinh trưởng và phát triển của các vi sinh vậtkhác Chất mà xạ khuẩn sinh ra đó gọi là CKS

Theo Semiakin va Khokhlov thì CKS là tất cả các sản phẩm trao đổi

chất của cơ thể sống có tác dụng ức chế và tiêu điệt vi sinh vật khác (vikhuẩn, protozoa, virut, nấm, tế bào ung thư ) một cách chọn lọc ngay ởnồng độ thấp

CKS được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả trong y học cũng như

trong một số ngành kinh tế quốc dân : CKS được sử dụng trong lĩnh vực

bảo vệ thực vật có kết quả chống các bệnh do nấm, vi khuẩn như;streptomixin, polimixin, trong chăn nuôi người ta dùng các kháng sinh :streptomixin, oxytetraxyclin, bổ sung vào thức ăn cho gia súc mang lại

hiệu quả kinh tế cao: tăng trọng nhanh, tăng sức để kháng, rút ngắn thời

gian nuôi dưỡng, nâng cao hệ số tiêu hoá cho thức ăn Ngoài ra CKS còn

sử dụng trong bảo quản thịt, cá, hoa quả như biomixin, teramixin.

Khi tiếp xúc với tế bào vi sinh vật, tuỳ thuộc vào bản chất hoá học,

nông độ kháng sinh, cấu trúc hiển vi của tế bào vi sinh vật mà CKS tác

động theo những cơ chế khác nhau; CKS có tác dụng đặc hiệu và gắn liền với cơ chế tác động Penixilin, cephalosporin, vancomixin, movobioxin có

tác dụng ức chế tổng hợp vỏ tế bào vi khuẩn Tổng hợp vỏ tế bào chỉ xảy

SVTH: Lê Thị Thanh Nga Trang 6

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

ra trong giai đoạn phát triển, những CKS trên đây chỉ tác dụng trong thời

gian này vỏ bị hỏng sẽ dẫn đến sự phá huỷ tế bào nghiêm trọng

Polimixin, streptomixin, baxitraxin tác dụng đến màng tế bào chất của vi

khuẩn làm ảnh hưởng đến sức thẩm thấu của tế bào Các CKS cloramfenicol, tetraxiclin, erytromixin, streptomixin có thể tác dụng ức chế các phan ứng trao đổi chất tổng hợp protein của vi sinh vật [14, trang 325].

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

3.2 Các nhóm CKS chính có nguồn gốc xạ khuẩn:

Các CKS có nguồn gốc xa khuẩn có ý nghĩa trong thực tiễn [€, trang18].

chứa ôxy có hoạt lực với vi|vòng chứa ôxy

khuẩn Gram (+) và một vài

vi khuẩn Gram (-)

D.E

Các kháng sinh |Là nhóm lớn, đa dạng về cấu |Các CKS Polipepdt:

ipepu trúc và hoạt tính sinh học, có |Polimixin, Baxitraxin

cấu trúc hóa học bao gồm

các chuỗi axit amin

SVTH: Lê Thị Thanh Nga Trang 8

vi sinh vật không những phụ thuộc vào thành phần đỉnh dưỡng mà còn phụ

thuộc vào các diéu kiện nuôi cấy Do đó, trong quá trình lên men cần phải xác định thành phan đinh dưỡng thích hợp và các điều kiện nuôi cấy thuận

lợi để vị sinh vật sinh trưởng phát triển tốt và tạo sản phẩm tối ưu

Quá trình lên men tạo CKS ở xạ khuẩn chịu sự tác động của các yếu

tỐ sau:

> Thành phẩn môi trường lên men : Sinh tổng hợp CKS ở xạ

khuẩn phụ thuộc chặt chẽ vào các nguồn dinh dưỡng :

e Nguồn dinh dưỡng cacbon :

Các hợp chất chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sống của vi sinh vật, nó là thành phần cấu tạo nên tế bào, protein, axit nucleic và các

sản phẩm khác Nguồn cacbon chủ yếu mà vi sinh vật sử dụng là hydrat

cacbon Trong công nghệ lên men nói chung, trừ trường hợp thu sinh khối

vi sinh vật đơn thuần người ta cố gắn tạo điều kiện cho vi sinh vật có thể

sử dụng nguồn dinh dưỡng cacbon để tổng hợp các sản phẩm cần thiết

nhiều hơn so với để tăng sinh khối và tạo thành CO, Đối với xạ khuẩn,tuỳ từng chủng mà chọn mà chọn nguồn cacbon thích hợp Nhiều chủng xạ

khuẩn có hoạt tính amilaza cao nên nguồn cacbon thích hợp là tỉnh bột.

Nguồn dinh dưỡng cacbon bao gồm các loại đường : glucoza, fructoza,

saccaroza, maltoza, lactoza hay các thành phần khác như rỉ đường, bột đại

mạch

© Nguồn Nitơ:

Quá trình sinh tổng hợp CKS từ xạ khuẩn thường đòi hỏi cả hai nguồn

nitơ hữu cơ và vô co, Nguồn nitd hữu cơ thích hợp là các hợp chất từ thực

vật như : bột đậu tương (có gần 40% protein), bột đậu xanh, cao ngô, nước

ngâm ngô Nguồn nitơ vô cơ : muối amon hoặc nitrat.

e Nguồn photphat vô cơ:

Vai trò của photphat vô cơ như là yếu tố điều chỉnh sinh tổng hợp

CKS ở phần lớn xạ khuẩn Nồng độ photphat thích hợp cho sinh tổng hợp

SVTH: Lê Thị Thanh Nga Trang 9

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

phần lớn CKS không quá 10mg/ml Néng độ photphat ban đâu cao sẽ làm

tăng lượng axit nucleic trong khuẩn ty dẫn đến làm kéo đài pha sinh

trưởng, rút ngắn pha tổng hợp, làm tăng ATP trong tế bào dẫn đến làm giảm hoặc ngừng sinh tổng hợp CKS, sự dư thừa photphat cũng ức chế tổng

hợp các enzim tham gia vào quá trình tổng hợp CKS [5, trang! 1]

> Điều kiện nuôi cấy :

® Độ thông khí :

Oxy là một trong những yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến sinh trưởng

phát triển của các chủng vi sinh vật hiếu khí Trong quá trình lên men đối

với các vi sinh vật hiếu khí người ta cung cấp một lượng lớn khí vô trùng.

Trong lên men công nghiệp thường sử dụng thiết bị lên men có hệ thống

khuấy đảo va sục khí, còn trong điều kiện phòng thí nghiệm tiến hành nuôicấy trên máy lắc để cung cấp oxy tuỳ theo nhu cầu của chủng vi sinh vật

Các xạ khuẩn sinh CKS được biết cho đến nay đều thuộc nhóm vi sinh vật

hiếu khí, do đó sự thông khí có ảnh hưởng rất lớn đến sinh tổng hợp CKS.Đối với hàng loạt CKS, độ thông khí để đạt hiệu suất cực đại là lưu lượng

thổi khí 1 thể tích / 1 thể tích môi trường / 1 phút.

© Nhiệt độ :

Quá trình lên men luôn có sự tod nhiệt làm cho nhiệt độ của thiết bị

lên men có xu hướng gia tăng quá ngưỡng nhiệt độ thích hợp đối với hoạt

động sống của vi sinh vật đó Vì vậy phải thường xuyên theo dõi và diéu chỉnh nhiệt độ phù hợp với quá trình lên men Đối với xạ khuẩn, đa số sinh

trưởng tốt ở 28-30°C Nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp CKS thường nằm

trong khoảng 18-28°C.

e pH:

Mỗi loài vi sinh vật thích hợp với một giá trị pH nhất định của môi

trường nuôi cấy Trong quá trình lên men, vi sinh vật tạo ra những sản

phẩm trao đổi chất có tính axit hay kiểm, làm cho pH của môi trường

không còn phù hợp cho hoạt động sống của chúng Do đó việc chủ động

diéu chỉnh pH của môi trường là diéu rất cần thiết khi thực hiện quá trìnhlên men.

SVTH: Lê Thị Thanh Nga Trang 10

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

Trong sinh tổng hợp CKS pH thích hợp thường là trung tính pH axit

hay kiểm mạnh đều ức chế quá trình này

e Nhân giống :

Sinh tổng hợp CKS không chỉ phụ thuộc vào diéu kiện lên men mà

còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng Môi trường

nhân giống thường nghèo định dưỡng hơn môi trường lên men, nhưng cũng

cố trường hợp môi trường nhân giống giàu dinh dưỡng hơn môi trường lên

men thì hiệu suất sinh tổng hợp CKS cao hơn Tuổi của giống cho hiệu suất

sinh tổng hợp cao nhất là 24" Tuy nhiên thời gian nuôi còn phụ thuộc vào

từng chủng và tuổi của bào tử giống Lượng giống cấy truyén (2-10%)sang

môi trường lên men phụ thuộc vào chủng xạ khuẩn và thành phần môi

trường nhân giống.

e Hình thức lên men:

Trong sinh tổng hợp CKS, phương pháp nuôi cấy cũng là một trong

những yếu tố có tính quyết định Quy trình sản xuất CKS thường được tiến

hành theo phương pháp nuôi cấy chìm trong nồi lên men có khuấy đảo vàsục khí Nổi lên men phải đảm bảo các điều kiện lên men tối ưu : độ thông

được con người trồng nhằm phục vụ cho lợi ích của họ.

Những sinh vật như thế bao gồm một số xác định các loại côn trùng,

tuyến trùng, vi nấm, vi khuẩn, cỏ dại, chim, chuột và một số động thực vật

có hại khác Trong những loại kể trên, côn trùng, tuyến trùng, vi nấm, vi

khuẩn và cỏ đại tạo nên những loại đối tượng gây hại được gọi là sâu hại,

SVTH: Lê Thị Thanh Nga Trang 11

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

Các loại dịch hại gây nên những tổn thất to lớn cho sản xuất nôngnghiệp Người ta ước tính hàng năm có khoảng 15-20% tổng sản lượng câynông nghiệp bị mất đi dưới tác động của các loại dịch hại.

Hầu như cây nông nghiệp nào cũng có các loại sâu bệnh hại Chúng phá

hoại mùa màng, làm giảm năng suất phẩm chất, đôi khi làm cây trồng

hoàn toàn thất thu,

Về sâu hại, ở cây lúa các loại sau đây là nguy hiểm nhất: sâu đục

thân, ray nâu, sâu cuốn lá, bọ xít hôi, muỗi lá hành.

Về bệnh hại: phổ biến nhất là bệnh do nấm gây ra Các loại nấm gây

bệnh thường gặp như:

| Pyricularia oryzae :

Nấm gây bệnh đạo ôn lúa Thuộc nhóm Nấm khuyết (nấm bất toàn)

Deuteromycetes, bộ nấm cành Hyphales, họ nấm chuỗi Moniliaceae Bào

tử phân sinh hình trái lê, không màu, thường có 3 tế bào, hình thành trên

các cuống sinh bào tử đơn bào mọc thành khóm (minh họa ở hình 1) Bào

tử phân sinh chính là phương tiện giúp nấm lan truyền va bùng phát trong

vụ thông qua gió và nước mưa.

Bệnh đạo ôn là một trong hai bệnh nguy hại nhất của lúa, là yếu tố

làm giảm năng suất lúa của nhiều vùng, đặc biệt các vùng lúa Đồng Bang

Sông Hồng và Duyên Hải Mién Trung Bệnh thường gây tác hại nặng

trong vụ lúa đông xuân Thời vụ có những diéu kiện ôn ẩm đó thuận lợi

nhất cho sự phát bệnh Chúng tàn phá đặt biệt đữ dội trên các giống nhiễm

hoặc trên các ruộng lúa bón dư thừa đạm.

an

Hình 1: Nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn lúa.(theø Roger,L.1953)

1/ Cụm cuống sinh bào tư 2/ Các bào tử phân sinh.

SVTH: Lê Thị Thanh Nga Trang 12

LUẬN VĂN TỐT NGIIIỆP KHÓA 1997-2001 GVIID: TS Trần Thị Thanh

2 Rhizoctonia solani :

Một loại nấm thuộc nhóm nấm vô sinh, theo đó dưới những điều kiệnthuận lợi về sinh thái và ký chủ, nấm không hình thành bất cứ loại bào tửhữu tính hoặc vô tính nào.

Để bảo tổn và lưu truyền, nấm hình thành các cấu trúc dạng hạch có

sức chống chịu cao và có khả năng phát tán rộng Nấm cũng lấy cấu trúc

này làm phương tiện phát tán và lây nhiễm Hach của R solani là dạng

hạch chưa hoàn thiện, được kết tụ và cấu trúc từ các sợi nấm với mức độ

chắc - chặc thấp Đó chỉ là những thể kép từ sợi, không mấy chặt chẽ,

không phân biệt về mặt giải phẩu giữa lớp vỏ và lớp ruột của hạch Một

số sợi nấm tạo hạch còn bám dính lại như những lông tơ, vì thế nhìn bể

ngoài các hạch như có lông Chính những lông tơ này giúp các hạch kết nốilại với nhau hoặc bám dính vào giá thể mà tại đó hạch tổn tại

R solani là nấm đa thực Chúng gây nên bệnh khô van hại lúa và một

số cây đơn tử điệp khác Chúng cũng là tác nhân gây các bệnh lở cổ rễ cho

nhiều loại cây trồng cạn Bệnh khô vần lúa là một trong hai loại bệnh nguy hại nhất của cây lương thực này.

tt lệ

Hình 2: Hình thái nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vần (theo Roger, L 1953)

1/ Diện mạo khuẩn ty thể và cách phân nhánh điển hình của chúng.

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

3 Fusarium oxysporum:

Nấm gây bệnh héo vàng.Thuộc nhóm nấm khuyết Deuteromycetes

(hay nhóm nấm bất toàn Fungi imperfecti), bộ nấm cành Hyphales, họ nấm

búi cành Cuberculariaceae.

Như tên gọi của nó chỉ rõ, loại nấm lưỡi này có đặc trưng điển hình

nhất là các bào tử phân sinh có hai đầu khá nhọn (oxysporum ~ có bào tửnhọn đầu) Nấm này rất đa thực Có thể sinh tổn độc lập trong đất và gây nên loại bệnh héo vàng cho rất nhiều cây trồng cạn: bông, day, nhiều loạiđậu đỗ, nhiều loại cà, khoai tây

Trong thực tế bảo vệ thực vật hiện nay, chưa có loại nông dược có

bản chất kháng sinh nào được sản xuất trên quy mô công nghiệp và được

thương mại hoá phục vụ cho việc phòng trị loại nấm này

Zz

8 ) i

ae)

Hình 3: Hình thái nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo vàng (theo Roger,L 1953)

1/ Các dạng đại bào tử khác nhau.

2/ Các tiểu bào tử.

3/ Hậu bào tử (bào tử vỏ đày) hình thành trên sợi nấm.

4/ Hậu bào tử hình thành trên đại bào tử.

SVTH: Lê Thị Thanh Nga Trang lá

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHOA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

4 Sclerotium sp :

Nấm gây bệnh tiêm hạch lúa Dưới tên gọi này nấm được xếp vào

nhóm nấm vô sinh, theo đó đưới các điều kiện thuận lợi, nấm lấy hạch làm

cơ quan bảo tôn, lưu truyền, phát tán và lây nhiễm.

Hach của Sclerotium là loại hạch thực sự, có kết cấu hoàn thiện Đó

là các cấu trúc hạt, nhỏ, bể mặt trơn nhấn, màu sậm, hoàn toàn biệt hoá

giữa hạch này với hạch khác, có cấu tạo giải phẩu khác biệt giữa phần vỏ

và phần ruột của hạch.

Người ta cũng phát hiện rằng dưới những điều kiện sinh thái xác định,

loại nấm này cũng hình thành các loại bào tử vô tính và hữu tính Giai

đoạn vô tính của nấm mang tên Helminthosporium sigmoideum Cay Giai

đoạn hữu tính của nấm mang tên Leptosphaeria salvinii Catt Ở Việt Nam,

nấm này tổn tại chủ yếu dưới giai đoạn hạch

Nấm này gây bệnh tiêm hạch ở lúa Tuy nhiên, do những thay đổi

mạnh mẽ vé phương thức canh tác, vé giống lúa và về tiểu sinh thái vùng lúa, bệnh tiêm hạch dang mất dần ý nghĩa của nó Bệnh này không là yếu

tố hạn chế năng suất Do đó không là đối tượng được quan tâm nhiễu trong

Hình 4: Hình thái nấm Sclerotium sp gây bệnh tiêm hạch (theo Roger, L 1953)

1/ Thể sợi nấm (khuẩn ty thể) trên môi trường nuôi cấy thuần.

2/ Những điện mạo đặc trưng khác nhau của khuẩn ty thể

3/ Kết cấu hạch.

SVTH: Lê Thị Thanh Nga Trang 15

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

5 Colletotrichum sp :

Nấm gây bệnh thán thư Thuộc nhóm nấm khuyết Deuteromycetes,

bộ nấm thán thư Melanconiales, họ nấm thán thư Melanconiaceae

Bào tử phân sinh của Colletotrichum đơn bào, không màu, sản sinh

trên những cuống sinh bào tử rất ngắn, mọc tập trung trong một dang quả

thể được gọi dưới tên Acervule - các bàn bào tử Đặc điểm của

Colletotrichum là xung quanh các Acervule có các lông cứng như một dạng

sợi vô sinh chuyển hoá từ các cuống sinh bào tử mà thành.

Nấm này gây nên một loại bệnh được gọi dưới tên chung : bệnh thán

thư Bệnh này gây hại trên nhiều loại cây trồng Tuy nhiên vì tính huỷ diệt

thấp nên loại bệnh này không mấy được chú ý.

Hình 5: Hình thái nấm Colletotrichum sp gây bệnh than thư (theo Roger, L.

1953)

1 Bàn bào tử (acervule)

S: Lông cứng.

2 Cách phân bố các lông cứng trên các bàn bào tử.

a Phân bố trải diéu.

b Phân bố tại ven bàn bào tử

3 Các dạng lông cứng.

Bên cạnh đó, các bệnh do tuyến trùng gây ra về mức độ gây hại cũng

không kém phần quan trọng.Ở Việt Nam, tuyến trùng là một trong những

trở ngại chủ yếu cho việt phát triển cây hổ tiêu, cà phê và một số cây công

nghiệp khác.

SVTH: Lé Thị Thanh Nga Trang 16

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

Trong các loại tuyến trùng gây hại thực vật thì loài tuyến trùng nốt sưng (Meloidogyne spp) là nhóm gây hại quan trọng chiếm đa số Chúng

gây các bệnh tuyến trùng nốt sưng trên các loại cây: cà chua, mã để,xà

lách, dưa chuột, thuốc lá

Tác hai của các loại dịch hại to lớn đến như vậy nên trong sản xuất

nông nghiệp người ta phải áp dụng hàng loạt các biện pháp phòng và trừ

nhằm hạn chế thiệt hại do chúng Trong đó có biện pháp sinh học, biện

pháp này ngày càng được phát triển và được sử dụng như một biện pháp quan trọng cốt lõi của phòng trừ tổng hợp dịch hại.

2 Biện pháp sinh học phòng trừ dịch hại cây trồng:

Biện pháp sinh học là việc sử dụng những sinh vật sống hay các sản

phẩm hoạt động sống của chúng nhằm ngăn ngừa hoặc làm giảm bớt tác

hại do các sinh vật hại gây ra.

Trong tự nhiên giữa các loài sinh vật có nhiều mối quan hệ phức tạp,trong đó các mối quan hệ như: hiện tượng ăn thịt, ký sinh, kháng sinh có ý

nghĩa rất quan trọng trong phòng trừ dịch hại.

Dựa trên các mối quan hệ đó, biện pháp sinh học nghiên cứu sử dụng

những sinh vật có ích để phòng trừ dịch hại Những sinh vật có ích đượcdùng làm tác nhân sinh học bao gồm: côn trùng ký sinh,côn trùng ăn thịt,nhện bắt mỗi ăn thịt, chim, bò sát, vi khuẩn, xạ khuẩn, virus chúng có thể

trực tiếp tiêu diệt dịch hại hoặc thông qua cơ chế đối kháng, cạnh tranh để

kìm hãm dịch hại.

Có nhiều biện pháp sử dụng các tác nhân sinh học kể trên, các biện

pháp đó được xếp theo bốn hướng chính sau:

- Bao vệ, duy trì và phát triển quần thể thiên địch trong tự nhiên

- _ Bổ sung thiên địch vào sinh quần cây trồng nông nghiệp

- Tao khả năng miễn dịch của cây trồng đối với vi sinh vật gây

bệnh cây.

- Sw dụng chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật.

Sử dụng chất kháng sinh là một hướng quan trọng của biện pháp sinh

học phòng trừ bệnh cây Sử dụng chất kháng sinh có nhiều ưu điểm: có tác

dụng nhanh và tác dụng chọn lọc đối với một số vi sinh vật nhất định, dùng

SVTH: Lê Thị Thanh Nga Trang 17

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

phun lên cây trồng thường ở nồng độ rất thấp Chất kháng sinh được phân

giải nhanh bởi các vi sinh vật trong đất do đó không gây ô nhiễm môi

trường.

Trên thế giới biện pháp sinh học đã và đang đạt được nhiều kết quả

tốt đẹp trong nhiều lĩnh vực phòng chống dịch hại cây trồng Ở nước ta,

biện pháp này tương đối mới, những nghiên cứu mới về biện pháp sinh họctrừ dịch hại còn chưa được tiến hành mạnh mẽ, kết quả thu được còn rấtthấp so với thế giới và so với yêu cầu thực tiễn bảo vệ môi trường hiện

nay.

Các thuốc phòng trừ dịch hại là khái niệm hàm chỉ mọi loại chất hoặchỗn hợp chất được dùng cho việc ngăn ngừa, tiêu diệt, xua đuổi hoặc làm

thuyên giảm các sinh vật bị coi là dịch hại trên cả hai phương diện mật độ

quần thể và mức độ gây hại

Dựa vào đối tượng gây hại, thuốc trừ dịch hại được chia ra thànhthuốc: trừ sâu, trừ nhện, trừ nấm, trừ vi khuẩn, trừ tuyến trùng, trừ ốc sên,

trừ cỏ, trừ chuột

Trong những loại kể trên, các loại thuốc trừ sâu, trừ nhện, trừ nấm, trừ

vi khuẩn, trừ tuyến trùng, trừ chuột và trừ cỏ được sử dụng phổ biến hơn và

dùng với số lượng nhiều hơn.

Việc sử dung các CKS (chủ yếu là CKS có nguồn gốc vi sinh vật: vi

khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc) dưới dạng các chế phẩm sinh học phòng trừ

dịch hại chưa được áp dụng rộng rãi trong sản xuất.

Các CKS hiện nay đùng làm thuốc trừ dịch hại thường là từ xạ khuẩn.

Chúng điều thuộc vào hai nhóm thuốc trừ sâu và thuốc trừ nấm

Đại diện điển hình cho thuốc trừ sâu có bản chất kháng sinh là

Abamectin Chất này được xác định là hoạt chất trừ sâu kiêm trừ nhện hại Thuốc này được thương mại hóa dưới các tên Avid,Affirm, Zephyr và đã

được dang ký vào thị trường Việt Nam.

Đại diện cho các thuốc trừ nấm mang bản chất kháng sinh có thể kể

tới các chất Polyoxin, Valiđamycin, Kasugamycin.

SVTH: Lê Thị Thanh Nga Trang 18

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

Polyoxin là tên dùng chung cho một loạt 13 chất tương déng về cấu

trúc, do đó tương déng về các lý hoá tính Polyoxin được xác định là hoạtchất từ nấm, trong đó polyoxin D trừ nấm gây bệnh khô vần hại lúa và

nhiều loại bệnh lở cổ rễ chết cây ở cây trồng cạn gây ra bởi nấm

Kasugamycin là hoạt chất trừ nấm được chỉ định phòng trị các bệnh

đạo ôn, mốc lá cà chua, cháy qudng lá đậu Hoạt chất này được thương

mại hoá dưới các tên Kasumin, Kasai, Kasuran.

Các chất kháng sinh trên đây, trong vai trò là các thuốc trừ nấm, đã

được đăng ký và thương mại hoá tại thị trường Việt Nam Riêng

Validamycin là chất đang được sản xuất tại Việt Nam để trừ bệnh khô vần

do Công ty Thuốc sát trùng Việt Nam (Vipesco) liên doanh với Trung

Quốc sản xuất Sản phẩm này được thương mai hoá dưới các ténVivadamy

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

Phần H VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I Vật liêu:

1 Các chủng vi sinh vat:

- Ching xạ khuẩn THs„ nhận từ phòng thí nghiệm bộ môn vi sinh

trường Đại học sư phạm TP.HCM.

~ Vị sinh vật kiểm định: Bacillus subtilis, Echerichia coli nhận từ

trường Đại học Y TP.HCM.

- Các chủng nấm gây bệnh cây trồng: Rhizoctonia solani,

Pyricularia oryzae, Fusarium oxysporum, Sclerotium sp,Colletotrichum sp Nhận từ Trung tâm nghiên cứu sản xuất hoá

chất nông được.

2 Hoá chất và dụng cụ:

- Hod chất: Dung dịch lugol: lot— 2,5g; KI — 5g; nước cất IL

Xanh cotton: xanh cotton — 0,05ml; Lactophenol — 100ml.

- Môi trường A-4 (g/1)(MT 2): glucoza-10; bột đậu tương-10,

NaCl-5; CaCOy-1; nước 1l; pH=7

Môi trường A 4H (g/1)(MT 3):glucoza — 15; bột đậu tương

-15;NaCl - 5; CaCO; — 1; nước cất 11; pH = 70

SVTH: Lê Thị Thanh Nga Trang 20

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

- Môi trường A-12(gA)(MT 4): tinh bột tan-10; rỉ đường- 10; bột

đậu tương-10; KzHPO,-2; CaCO;-1; NaCl-5; nước cất 11; pH=7

- Môi trường ISP-I(g/)(MT 5): Trypton-5; cao nấm men-3;

thạch-20; nước cất 11; pH=7-7,2

- Môi trường phân giải tinh bột (g/)(MT 6): tinh bột tan-10;

pepton-5 ; KH;PO,-1; MgSO¿.7H;O-5; thạch-20; nước cất 11

- Môi trường nước chiết khoai tây (g/l) (MT 7): khoai

tây-300(đun sôi 30phút, lọc lấy nước); Saccaroza-50; nước cất II

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn kiểm định (g/) (MT 8):

glucoza-10; pepton-5; MgSO¿.7H;O-5; NaCl-5; nước cất 1; thach-20

- Môi trường Czapek-dox (g/l) (MT 9): saccaroza-30; NaNO;-3,5;

K;HPO,-I1,5; MgSO,.7H;O-0,5; KCI-0,5; FeSO,.7H;O-0,1; thạch

—20; nước II.

4 Quan sát đại thể: Quan sát khuẩn lạc của xạ khuẩn

Cho 3 mÌ nước cất vô trùng vào ống giống đã được hoạt hóa, lắc nhẹ

để bào tử trộn đều vào nước tạo thành dịch huyền phù, lấy 1ml dịch huyền

phù pha loãng cho đến tỉ lệ 10° Nhỏ một giọt dịch pha loãng ở néng độ

10 ° vào đĩa petri có chứa môi trường MT7.Dùng que gat dàn đều bào tử

trên đĩa petri, nuôi ở nhiệt độ phòng sau 7-10 ngày lấy ra quan sát khuẩn

lạc xạ khuẩn

% Quan sát vi thể: Quan sát hình dạng khuẩn ty ký sinh, cuống

sinh bào tử , bào tử xạ khuẩn.

- Dùng phương pháp làm phòng ẩm:

Nhỏ một giọt môi trường Gauzel lên lam kính đã được đặt sẵn trong

dia petri có lót giấy thấm Nghiêng nhẹ dia petri để môi trường dàn đềuthành một lớp mỏng trên lam kính, để nguội cho thạch đông lại Cho một ítnước cất vô trùng vào đĩa petri sao cho nước cất vừa thấm đều giấy thấm

Cấy xạ khuẩn lên môi trường đã được dàn đều trên lam kính, để ở nhiệt độ

SVTH: Lê Thị Thanh Nga Trang 2ï

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

phòng sau 2 ngày lấy ra quan sát hình dạng khuẩn ty khí sinh, cuống sinh bào tử và bào tử xạ khuẩn.

1.2 Đặc điểm nuôi cấy:

Quan sát màu KTKS, KTCC, sắc tố hoà tan.

Xạ khuẩn được nuôi cấy ở dạng thạch nghiêng trên các môi trường: MT1, MT7, MT9 Dé ở nhiệt độ phòng sau 7, 14, 30 ngày lấy ra quan sátmàu KTKS, KTCC, màu sắc tố hoà tan trong môi trường.

1.3, Đặc điểm sinh lý ~ sinh hoá:

- Xác định nhiệt đô thích hợp cho sinh trưởng của chủng xa khuẩn

THy.

Xa khuẩn được nuôi cấy ở dạng thạch nghiêng trên môi trường MT],

nhiệt độ 37°C, 45°C và ở nhiệt độ phòng Sau 4 ngày quan sát khả năng

sinh trưởng của xạ khuẩn

+ Nguyên tắc:

Tinh bột khi gặp thuốc thử lot (dung dich lugol) sẽ bắt màu xanh đậm

Ở chủng vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột, khi nhỏ thuốc thử Iot,

môi trường sẽ không xuất hiện màu xanh đậm mà có vòng phân giải trongsuốt

+ Phương pháp:

Cho 2-3 ml nước cất vào ống giống, nghiêng nhẹ để bào tử trộn đều với nước tạo dịch huyén phù Dùng que cấy thẳng nhúng vào dịch huyển

phù sau đó chấm một điểm ở giữa dia petri có chứa môi trường MT6 Sau 7

ngày, nhỏ thuốc thử dung dịch lugol vào xung quanh khuẩn lạc và tráng

đều thuốc thử trên bể mặt môi trường Quan sát và đo đường kính vòng

phân giải, đường kính khuẩn lạc

Hiệu suất phân giải tỉnh bột được tính bằng hiệu số của đường kính vòng phân giải (B) và đường kính khuẩn lạc (b).

- Khả nang chiu muối NaCl:

SVTH: Lê Thị Thanh Nga Trang 22

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

Xạ khuẩn được nuôi cấy ở đạng thạch nghiêng trên môi trường MT5 nhưng có bổ sung thêm NaCl với các nông độ 0,5; 1; 3; 5; 7; 10% Sau 5-7 ngày quan sát sự sinh trưởng của xạ khuẩn.

- Nguyên tắc:

Để xác định hoạt tính kháng sinh người ta dựa vào sự khuếch tán của

chất kháng sinh trong thạch Chổ nào có chất kháng sinh khuếch tán thì nơi

đó vi khuẩn kiểm định không mọc được và sẽ tạo thành vòng vô khuẩn Hoạt tính kháng sinh được xác định bằng hiệu số giữa đường kính vòng vô

Cho 2ml nước cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có cấy sẵn vi

khuẩn kiểm định để tạo thành dịch huyển phù Môi trường MT8 đã để

nguội khoảng 40-45°C cho dịch huyén phù vào trộn đều sau đó đổ vào các

đĩa petri Dùng khoan lá (d = 8mm) đục các lỗ trên môi trường thạch, nhỏ

vào lỗ khoan dịch cần thử Các đĩa petri được để ở tủ lạnh 4-5 giờ cho chất

kháng sinh khuếch tán trong thạch Nuôi trong tủ ấm ở 37°C đối với E.coli

và ở nhiệt độ phòng đối với Bac.subtilis Sau 24 giờ quan sát kết quả.

2.2 Phương pháp xác định sinh khối khô :

Giấy lọc được sấy khô ở 105° C đến trọng lượng không đổi Lấy 5ml

dịch lên men lọc qua giấy lọc và rửa sinh khối bằng dung dich HCI 0,1N

(1-2 lần) Sau đó sấy khô ở nhiệt độ 105°C đến trọng lượng không đổi.

Sinh khối vi sinh vật (P) được xác định theo công thức :

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

2.3 Lưa chon môi trường lên men thích hợp:

- Nhân giống : Giống được nhân lên trong bình tam giác 250ml

chứa 25ml môi trường MT? và nuôi trên máy lắc tròn (130 vòng/phút)

trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng.

- Lên men : Giống phát triển tốt được cấy truyền với tỷ lệ bằng

2% sang bình tam giác 250ml chứa 50m! môi trường: Gauze I, A-4, A-12,

A-4H, MT7 Sau 120 giờ nuôi trên máy lắc (130 vòng/ phút) ở nhiệt độ

phòng Xác định sinh khối và hoạt tính kháng sinh

Xa "khuẩn TH,, được nuôi cấy lắc trên môi a A-4 (130

vòng/phút) đã chỉnh pH theo các thang 5, 6, 7, 8, 9 bằng HCI va NaOH IN

Sau 120 giờ xác định hoạt tinh kháng sinh.

2.4.2 Ảnh hưởng của chế 46 thông khí lên sinh tổng hợp CKS :

Xa khuẩn được nuôi cấy lắc trên môi trường A-4 (pH = 7) ở các tốc độ khác nhau : 100 vòng/phút, 130 vòng/phút, 150 vòng/phút và không lắc.

Sau 120 giờ thử hoạt tính kháng sinh.

2.4.3 Xác định thời gian sinh kháng sinh tối ưu :

Xa khuẩn được nuôi cấy lắc (150 vòng/phút) trên môi trường A-4 (pH=7) Cứ sau 24 giờ lấy mẫu theo định kỳ xác định sinh khối và hoạt tính

kháng sinh.

2.5 Xác định khả năng bền nhiệt của CKS :

Xa khuẩn được nuôi cấy lắc (150 vòng/phút) trên môi trường A-4

(pH=7) Sau 96 giờ lấy dịch nuôi cấy li tâm (3000 vòng/phút, trong 5phút)

loại bỏ sinh khối sau đó đem nung cách thủy ở 40°C, 60°C, §0°C,100°C kéo

dài 10, 20, 40, 60 phút Làm nguội và xác định hoạt tính kháng sinh.

3 Tìm hiểu kha năng ứng dung của CKS từ chủng xạ khuẩnTH.„

3.1 Thăm đò khả năng ức chế nấm gây bệnh ở cây trồng :

Chủng xạ khuẩn TH, được nuôi cấy lắc (150 vòng/phúU trên môi

trường MT7, sau 96 giờ lấy dịch nuôi cấy thử với các nấm bệnh theo 2

phương pháp :

$VTH: Lê Thị Thanh Nga Trang 24

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

- Phương pháp đục lổ :

Đổ môi trường khoai tây (MT7) vào đĩa petri, để nguội, sau đó đục lổ.

Cấy nấm bệnh thành 2 chấm đối xứng qua lổ thạch và cách lổ thạch

khoảng 2cm Nhỏ dịch nuôi cấy xạ khuẩn vào lổ thạch Để đĩa petri này

vào tủ lạnh trong 3-5 giờ cho CKS khuếch tán Sau đó để ở nhiệt độ

phòng, quan sát kết quả sau 3-5 ngày.

- Phương pháp dịch thể :

Cho Iml dich nuôi cấy xạ khuẩn vào ống nghiệm chứa 4ml môi

trường MT7, cấy nấm bệnh vào Đối chứng bằng cách cấy nấm bệnh vào

ống nghiệm chứa 5ml môi trường MT? Sau 5-7 ngày quan sát sự sinh

trưởng hay không của các chủng nấm bệnh

a Phương pháp tách TTNS từ rễ cây bị nhiễm bệnh:

Rễ cây bị bệnh TTNS rửa sạch, để ráo nước, cất thành từng đoạn

khoảng 1-2cm, cho vào đĩa petri và đổ nước cất vào vừa ngang mặt rễ.

Dùng kim mũi mác và kim mũi nhọn xé rễ cây theo chiều ngang cho tuyến

trùng chui ra khỏi mô rễ, Quan sát đĩa petri dưới kính lúp sẽ thấy trứng

tuyến trùng cái, tuyến trùng đực và các dạng ấu trùng lơ lững trong nước

cất Tách lấy các tuyến trùng này để lên lam kính sau đó nhuộm bằng

dung dịch xanh cotton trong 3-5 phút, đậy lamen lại quan sát dưới kính

hiển vi ở độ phóng đại x10

a Phương pháp tách tuyến trùng ra khỏi đất :

Cho 20ml nước cất vào 10g đất bị nhiễm TTNS, trộn đều để yên trong

| phút Lấy dịch ở phẩn trên cho vào ống quay li tâm với tốc độ 3.000

vòng/phút trong 3 phút Sau khi li tâm phần cát mịn và tuyến trùng chịu lực

li tâm nên bị đẩy xuống đáy ống nghiệm, đổ bd lớp nước phần trên của

ống li tâm Cho nước cất vào ống li tâm, quay cho tan diéu phần đất mịn

và tuyến trùng vào nước cất, li tâm tiếp lần thứ hai với tốc độ

3.000vòng/phút trong 30 giây Phần cát mịn nặng chịu lực li tâm kéo về đáy ống nghiệm, tuyến trùng do quá nhẹ lơ lửng trong nước Đổ phần nước

SVTH: Lê Thị Thanh Nga Trang 25

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS Trần Thị Thanh

có tuyến trùng vào đĩa petri quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại

x10.

a Phương pháp đếm số lượng tuyến trùng

Lấy 1 ml nước có chứa tuyến trùng nhỏ thành từng giọt lên lam kínhsau đó đếm số lượng tuyến trùng trên các giọt nước đó đưới kính hiển vi ở độ

phóng đại x10 cho đến khi hết | ml nước

SVTH: Lê Thị Thanh Nga Trang 26