Khóa luận tốt nghiệp Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng loại nấm mốc được phân lập từ chế phẩm em có khả năng sinh kháng nấm gây bệnh

Để góp phần tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng chế phẩm EM tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành khảo sát và tìm hiểu ứng dụng của một số ching nấm mốc được phân lập từ chế phẩm EM với

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA SINH

PHẠM THỊ KIM CHI

ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ, SINH HÓA CỦA

CÁC CHUNG NAM MOC ĐƯỢC PHAN LẬP TỪ CHẾ PHẨM EM

CÓ KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH KHÁNG NẤM GÂY BỆNH

Ở CÂY TRỒNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGÀNH SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH

GVHD: TS TRẦN THỊ THANH

THƯ-VIỆN.

Tư ởx*) Bol-Hog Bu Phạm12 MO CM MINK

NIÊN KHOA 1997 - 2001

LOI CAM ON

Trude tiên em xin trân trong cảm ơn TS Trần Thi Thanh —

người thdy da tan tình chỉ bảo, hướng dẫn về mat khoa học,

nhiệt tinh gitp đỡ em trong sud? thời gian học tap và thực hiện

dé tài này.

Xin chân thành cam ơn Quy Thầy Cô trường Đại tiệc Su Pham TP Hé Chi Minh đã day dỗ, truyền dat cho em các kiến tức quy báu trong suốt thời gian học tập tai trường.

Đặc biệt xin cảm on Quy Thầy Cô công tác tại #hòng thí nghiém vi sinh, sinh hóa, sinh ly thực vật thaệc Khoa Sinh

trường Đại Hoe Su Phạm TP Hé Chi Minh đã tạo diéu kiện thuận lợi cho em trong thời gian thực hiện dé tài nay.

Xin cảm ơn Cha Me đã nuôi dạy con khôn lớn thành người nhu

ngày hém nay.

Cảm om các anh chi, các bạn đồng môn dé giúp đỡ, ding viên

tôi trọng suốt thời qian bốn năm học tập lại lrường.

TP tiề Chí Minh, thí" 5 năm 2007

Pham Thi Kim Chi

2 NAM MOC VA SU HÌNH THÀNH CHAT KHANG SINH: - 5c 555 5x5 5

3 BIEN PHÁP.SINH HỌC PHONG TRU BỆNH HAI CAY TRỒNG: - 6

3.1 Tình hình chung về bệnh hại cây trồng- -ccccccccccscscee 6

3.2 Biện pháp sinh học phòng trừ bệnh hại cây trồng: - 8

PHAN 2 NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

I ĐỐT TƯƠNG VÀ WAT LIÊHNGHIỀN GIẪN e-2-5-se-csce eeeseeseccesse 13

Ld ` Đổi tượng nghibn CMs cesoccscennnninraittittoiosattttitioaastsnsgitisafagfnat 13

hổi "VI TỆH(HENRIEH CINH:eeoeecreccsensorrieorresrernrrtngoskddrutnruaavodonvustosiodtogig 13

ÿ ĐI NT DEN (oaaitiaibiani0010020002210020012111004025249608800502i588228858524288ã28586ã86688E 15

2 NOI DUNG VÀ PHƯƠNG PHAP NGHIÊN CỨU: - «5555 <<<<<x 15

2? Quanisat fink thal va Glink dams ccccssacvesvoevsvevscevcrauvesooxsevasnecsaveens 15

2.2 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn: - 16

2.3 Xác định thời gian tạo chất kháng sinh: . LF2.4 Xác định ảnh hưởng của độ pH lên khả năng sinh chất kháng sinh:

342hö©z26ã8ã55ã222ãããããããã8855ã8ãñ208ãããã595ã8ã8añaagBaaiSanšaiEBBpaaaSEEBEYEEfREzBt0rrrfyeap 17

2.5 Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bên của chế phẩm kháng

SN sen SC En CL 18

2.6 Xác định khả năng sinh enzime ngoại bào: «. <<<<- 18

2.7 Khảo sát khả năng đối kháng của các chẳng nấm mốc gây bệnh ở

HỀP NET, «son den An U2E5651881518816ã8ã68865ã58815ã5Eã588ã8ããããÄ8Đ3ö580ãããEz2285g:5538538saszB 192.8 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của chất kháng sinh lên khả

PERIL Net Ped PEE 104C) ND ANH 19

PHAN 3: KET QUA VA BIEN LUẬN - ooo.‹ooee 20

1 KIỂM TRA LAI NGUỒN GIỐNG VI SINH VAT: - cccccccceeeecee 20

1.1 Kiểm tra về hình thái của các chủng nấm mốc phân lập từ chế

NIENNG,BNME co-c-«cecsesoseceesseseeerosessesesonaasni25EEGGSEIEEGEĐNNEHNINIENDBEWNANTOINNE 201.2 Kiểm tra hoạt tính kháng sinh của các chủng nấm mốc phân lập từ

chế phẩm EM đối với vi sinh vật kiểm định: -c<c<<<<< 30 1.3 Kiểm tra khả năng kháng nấm gây bệnh ở cây trồng của các chủng

nấm mốc phân lập từ chế phẩm EÌM: «-«+-<-<ccsesiesrekeerrke 34

2 TÌM HIỂU ĐẶC DIEM SINH LÝ, SINH HOA CUA MỘT SỐ CHUNG NAM MOC CÓ

KHẢ HE SILL ALS Che Lf So Eo ee eee 40

Š:1 Đặc Binh (NI scscssnyrnnmermnncaramammenseuns: 4I

2.2 Xác định thời gian tạo chất kháng sinh: «<<«s<<+ 43

2.3 Ảnh hưởng của độ pH lên khả năng tạo chất kháng sinh: - 45

2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bên của chế phẩm kháng sinh: 48

2.5 Khả năng phân giải các hợp chất cao phân tử: - - 50

3, ỨNG HUNGCIAPHE PHẨM EIN ccs cernonsucnsonannnnooxaxacansonsnnsasnevonsasnonsnansuanen 5I

3.1 Thử khả năng kháng nấm gây bệnh ở cây trồng: - 51

3.2 Anh hưởng của chất kháng sinh lên khả năng nảy mam của hạt: 60

PHAN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ, eooosoessssse O2

1; KẾT LUẬN?! no cseeoin d6i1n)0i610100016008401001156000168aa810181628105990151588ã043866 62

OA ee 63

TãIHIEUHTRAIMREBRANGii-.-caaaỷacaaa e=-ẳstszzaastes= 64

LỜI MỞ ĐẦU

Nhu cầu lương thực, thực phẩm của nhân loại ngày càng tăng Sự gia tăng

dân số và việc nâng cao mức sống đòi hỏi ngành sản xuất lương thực thực

phẩm phải phát triển không ngừng Trước đây phương thức canh tác được

chú trọng là sử dụng phân bón, thuốc trừ sâu hóa học nhằm tăng sản lượng

cho cây trồng Nhưng qua một thời gian dài, dư lượng của thuốc trừ sâu và

phân bón hóa học đã làm đất đai ngày càng bị thoái hóa, ảnh hưởng

nghiêm trọng đối với sức khỏe, đời sống của con người, vật nuôi và gây

mất cân bằng sinh thái.

Trước tình hình đó, các nhà khoa học đã không ngừng tìm kiếm các hình

thức hữu hiệu để khắc phục những hạn chế trên Dùng biện pháp sinh học

để phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng là một hướng có nhiều triển vọng.

Đầu tiên người ta chỉ chú ý đến vai trò của những côn trùng có lợi cho đấu

tranh sinh học (còn gọi là thiên địch) như bọ rùa, bọ xit, ong ký sinh, Sau

một thời gian người ta đã phát hiện vai trò tích cực của vi sinh vật Hướng

dùng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại bảo vệ cây trồng ngày một pháttriển Các chế phẩm có nguồn gốc vi sinh vật như phân vi sinh vật cố định

đạm (Nitrazin, Azotobacterin), phân vi sinh vật phân giải lân

(Phosphobacterin) Đặc biệt là chế phẩm EM (Effective Micro-organisms)

ngày càng được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước và mang lại nhiều hiệu quả

rõ rệt cho cây trồng: các mầm bệnh trong đất bị tiêu diệt, thúc đẩy khả

năng nảy mầm, ra hoa, kết trái đồng thời tăng năng suất và chất lượng của cây trồng.

Để góp phần tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng chế phẩm EM tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành khảo sát và tìm hiểu ứng dụng của một số ching nấm mốc được phân lập từ chế phẩm EM với dé tài: “Nghién cứu

đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm mốc được phân lập từ chế

phẩm EM có khả năng sinh kháng sinh kháng nấm gây bệnh ở cây trong”

PHAN 1:TONG QUAN TÀI LIEU

1 MỘT SỐ KHÁI NIEM VỀ NAM MOC:

Nấm mốc (mold) là tên chung để chỉ các loại nấm hiển vi có cấu tạo sợi.Chúng gồm tất cả các loại nấm không phải nấm men và cũng không sinh

mũ nấm như các loại nấm lớn Tuy nhiên ở các giai đoạn chưa sinh mũ

nấm thì khuẩn ty thể của nấm lớn vẫn được xem là nấm mốc.

Trong tự nhiên nấm mốc phân bố rất rộng rãi và tham gia tích cực vào các

vòng tuần hoàn vật chất nhất là quá trình phân giải chất hữu cơ và hình

thành chất mùn

Trong thực tế, nấm mốc thường gặp ở dạng các mốc mọc trên thực phẩm,

trên quần áo, giầy dép, sách vở Chúng phát triển nhanh trên nhiều nguồn

cơ chất hữu cơ khi gặp khí hậu nóng ẩm Trên nhiều vật liệu vô cơ do dínhbụi như các thấu kính ở ống nhòm, máy ảnh, kính hiển vi nấm mốc vẫn

có thể phát triển, sinh axít và làm mờ các vật liệu này.

Nhiều loại nấm mốc có giá trị lớn trong công nghiệp, được dùng nhiều

trong việc sản xuất các loại axít hữu cơ, men, chất kháng sinh, vitamin

Trái lại nhiều loại nấm cũng gây thiệt hại trong bảo quản thực phẩm và

các hàng công nghiệp khác Nhiều loại nấm mốc kí sinh trên người, động

vật, thực vật gây ra các bệnh nấm khá nguy hiểm Nhiều loại nấm sinh ra

các độc tố có thể gây bệnh ung thư và nhiều bệnh tật khác.{ 1,90]

1.1 Đặc điểm hình thái:

Nấm mốc có cấu tạo sợi, phân nhánh hoặc không phân nhánh, có vách

ngăn hoặc không có vách ngăn ngang Đường kính của các sợi từ 3 - 5 pm

nhưng cũng có thể đến 10 um.

Trong quá trình sinh trưởng, các sợi nấm vừa phát triển theo chiéu dài vừa

phân nhánh, riêng đối với các sợi nấm có ngăn vách thì còn phát triển

thêm các vách ngăn ngang Các nhánh lại có thể tiếp tục phân nhánh liên

tiếp Toàn bộ sợi nấm và các nhánh phát triển từ một bào tử nấm được gọi

là hệ sợi nấm Hệ sợi nấm thường phát triển thành một khối có hình dạng

nhất định thường có tiết điện hình tròn hoặc gần tròn gọi là khuẩn lạc Các

sợi nấm chỉ có sự tăng trưởng ở ngọn Một số sợi nấm sinh trưởng bằng

cách đâm sâu vào cơ chất và hút các chất dinh dưỡng ở trong đó gọi là

khuẩn ty cơ chất Ngược lại một phan hệ sợi nấm phát triển trên bể mặt

của cơ chất gọi là khuẩn ty khí sinh Ở nhiều loài, các sợi của hệ sợi nấm

nằm bên ngoài cơ chất là cơ quan sinh sản [2,348-349]

Ludn văn tot nghiệp OVE 1, 4 044171 411, SE Coe

Mỗi tế bào trong một sợi nấm (ngăn vách hoặc không ngăn vách) không

có giới hạn, không có cấu tạo riêng và cũng không có các hoạt động trao đổi chất độc lập trong phạm vi tế bào Mặc dù mỗi đoạn trên một sợi nấm

có sự phân hóa khác nhau, nhưng sự phân hóa này không liên quan đếnđạng cấu tạo tế bào đặc trưng của sợi nấm

Các thành phần cấu tạo của tế bào, nhân tế bào ở nấm về cơ bản không khác ở các sinh vật có nhân thực Hầu hết các loài nấm đều không có celluloza,ngoại trừ một số nấm roi thuộc lớp phụ nấm noãn (Oomycetidae)

và một số nấm roi khác thuộc lớp phụ Hyphochytridiomycetidae có thành

tế bào được cấu tạo bởi celluloza-glucan Thành phần gluxit của thành tế bào ở các nhóm phân loại chiếm hầu hết ở các loài nấm này là kitin,

kitozan va glucan, chất dự trữ gluxit ở tế bào nấm không phải là tinh bột

mà là glycogen — chất dự trữ thường có ở động vat

Nấm mốc không có chất diệp lục nên không có khả năng tổng hợp các chất hữu cơ từ khí cacbonic mà sử dụng trực tiếp chất hữu cơ có sẵn để

sinh sống, sống dị dưỡng

Nấm mốc sống hoại sinh hoặc kí sinh, một số nhỏ cộng sinh với tảo trong

địa y.

Nấm mốc chỉ mọc tốt trong môi trường có nhiều không khí, thường phát

triển trên bể mặt của cơ chất dưới dạng những lớp lún phún hình sợi, lớp

màng nhện hay khối sợi bông

Nấm sinh sản chủ yếu bằng bào tử Từ bào tử mọc ra sợi nấm và sau đó là

hệ sợi nấm Mặc dù vậy bất cứ một đoạn sợi nấm hoặc một mảnh nào của

hệ sợi nấm đều có thé dùng để sinh sản được Các mảnh này khi rơi trên môi trường dinh dưỡng thì phát triển và tạo thành một hệ sợi nấm mới.

Trong phòng thí nghiệm thường dùng phương pháp này để nhân giống.

[3,349]

L2 Đặc đi ị inh hóa:

Nấm mốc thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí nghĩa là không thể phát triển

được khi không có oxy.

Nấm mốc thường phát triển tốt trong môi trường trung tính (pH=7), một số

nấm mốc thích nghỉ với môi trường axit (pH<7) hoặc môi trường hơi ngã

về kiểm Tuy nhiên nấm mốc không chịu được môi trường quá axit hay quá kiểm.

Nấm mốc phát triển tốt trong điểu kiện ẩm ướt, độ ẩm không khí cao.

Chẳng hạn như ở 20°C bột mì có độ ẩm 14.5% chứa khoảng 1200 bào tử

nấm mốc trong | gam, nhưng nếu độ ẩm tăng lên là 18% thì có tới khoảng

Luận văn tốt nghiệp OVINE cham ong nun Cn

8280 bào tử nấm mốc trong | gam Mỗi loài nấm mốc có một độ ẩm tương

ứng thích hợp nhất cho việc phát trién.[5]

Mỗi loại nấm mốc phát triển thích hợp ở những nguồn cơ chất khác nhau.

Hầu hết các nấm mốc phát triển thích hợp ở nhiệt độ từ 20°C đến 30°C

Bình thường các hợp chất cao phân tử như tinh bột, cellulose, protein, rất khó phân giải nhưng nấm mốc có khả năng sinh ra các enzime như

amylaza, celluloza, proteaza, có hoạt tính phân giải khá cao để phân giảicác hợp chất cao phân tử này

Các enzime từ nấm mốc được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như trong

công nghiệp thực phẩm: sản xuất rượu, bia, bánh mì, nước tương, nước

chấm, trong công nghiệp thịt, sữa, trong bảo quản thực phẩm, trong nông

nghiệp Ngoài ra enzime còn được sử dụng trong y học: sản xuất một số

thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa, chữa bệnh tim mạch, trong giải phẫu đểlàm thuốc chống viêm và làm sạch các vết thương 10, 154-168]

Giới thiệu một số enzime được sản xuất từ nấm mốc :

- Amylaza là enzime thủy phân tinh bột, được sử dụng nhiều nhất trong

lĩnh vực đường hóa thực phẩm Thủy phân tinh bột bằng amylaza trước

tiên cho những polymer mạch ngắn gọi là dextrins sau đó thành

maltoza và cuối cùng là glucoza [8,173] Các giống nấm mốc được

dùng sản xuất amylaza như: Asp oryzae, Asp usamii, Asp awamori,

Asp batatae, Rhizopus delemer, Rh neveus, Rh japonicum và nhiều

loài Mucor Ngày nay người ta dùng các tác nhân hóa học và vật lý

làm đột biến nấm mốc Aspergillus và thu được nhiều chủng mới có

hoạt lực sinh amylaza cao (Asp niger S, Asp.niger 2-4) Trong công

nghiệp sản xuất enzime amylaza người ta thường dùng các chủng

nguyên thủy hoặc đột biến của các giống Asp oryzae, Asp usamii,

Asp awamori, Asp niger, Asp batatae (10,116-1 17]

- Proteaza là enzime công nghiệp quan trong thứ hai sau amylaza Được

sử dụng nhiều nhất trong công nghiệp bột giặt, trong công nghiệp sữa,

các lĩnh vực khác như công nghiệp dược, công nghiệp thuộc da, công

nghiệp thực phẩm, xử lý chất thải Trên thị trường có các loại proteaza kiểm, proteaza trung tính và proteaza acid [8,185] Các giống nấm mốc được dùng để sản xuất proteaza gồm có:

e Nhóm mốc vàng (Asp oryzae, Asp flavus, Asp fumigatus, Asp

terricola, Asp sojae,Pen chrysogenum) sinh proteaza có vùng pH

từ 3.7 đến 10 nhưng thích hợp nhất ở pH = 6.5

“uận văn tốt nghiệp OVER: PHỤTH ony nun ons

se Nhóm mốc den (Asp usamii, Asp awamori, Asp niger, Pen

expansum, Rh javanicus) chủ yếu tạo thành proteaza có vùng pH

từ 2.5 đến 3 [10,117-118]

- Cellulaza là một phức hệ enzime gồm có cellulaza C,, cellulaza C, va

B glucosidaza [8,189] Các giống nấm mốc được dùng để sản xuất cellulaza gồm có: Asp niger, Asp flavus, Asp oryzae, Fusarium

oxysporum, Fusarium solani, Pen notatum, Pen variabile, Rh species.

Những nấm mốc có khả năng sinh nhiều cellulaza thuộc các giống

Alternaria, Tricoderma, Aspergillus, Penicillium, Chúng được tach từ

đất quanh vùng rễ cây, từ các mẫu thực vật, từ than bùn và các nguồn

tự nhiên khác có quá trình phân hủy cellulose Trong giống Alternaria tenius có khoảng 150 chủng có thể phân hủy giấy lọc đến 80%.

[10,121]

- Pectinaza được sản xuất từ các giống nấm mốc như: Pen glaucum,

Asp awamori, Asp niger, Asp terreus, Asp saitoi, Pen chrysogenum,

Pen citrinum, Sclerotinia libertiana, Một số chủng đột biến của các

loài Asp awamori, Asp niger được chú ý nhiều trong sản xuất

pectinaza.| 10,1 19-120]

Ngoài ra, nấm mốc còn có khả năng sinh ra các chất có hoạt tính sinh học

khác như chất kháng sinh hoặc độc tố có tác dụng tiêu diệt mầm bệnh.

a

N NH C :

Sự phát triển của vi sinh vật trong tự nhiên liên quan mật thiết đến chất dinh dưỡng trong môi trường và mối liên hệ giữa chúng Hiện tượng đối

kháng rất phổ biến và là cơ chế bảo vệ trong đấu tranh sinh tổn của các vi

sinh vật trong quần thể.

Kháng sinh là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện tượng

một vi sinh vật với sản phẩm trao đổi chất của mình có tác dụng kiểm hãm

hoặc ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác.

Thuật ngữ kháng sinh (antibiotic) được S.A Waksman đề ra năm 1940 để

chỉ các chất có nguồn gốc vi sinh vật có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc

tiêu diệt một số vi sinh vật khác [10,320] Theo Semiakin và Khokhlov

(1961) thì chất kháng sinh là tất cả sản phẩm trao đổi chất của cơ thể sống

có tác dụng ức chế và tiêu diệt vi sinh vật khác (vi khuẩn, vi rút, protozoa,

tế bào ung thư, ) một cách chọn lọc ngay ở nồng độ thấp.

Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ nấm mốc chiếm tỷ lệ khá lớn tuy

nhiên do độ độc tương đối cao nên chưa được sử dụng rộng rãi trong thực

Luận văn tất nghiệp SVTH: Phạm Thị Kim Chi

tiễn Da số những nấm mốc sinh chất kháng sinh thuộc nhóm nấm bất toàn

(Fungi imperfacti).

Trước đây chất kháng sinh được sử dụng chủ yếu trong y học, nhưng sau đó

được sử dung rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác { 10,345-346]

Có thể đơn cử một số chất kháng sinh phổ biến có nguồn gốc từ nấm mốc

[12.3]:

- Penicillin được chiết từ dịch nuôi cấy Penicillium chrysogenum có hoạt

tính khá mạnh chống vi khuẩn gram (+): Staphylococcus, Diplococcus

đây là chất kháng sinh được tìm ra đầu tiên và được sử dụng rộng rãi ở

hầu hết các nước trên thế giới Trong y học, Penicillin là một thứ vũ khí

chủ yếu chống một loạt các vi khuẩn gây bệnh như: bệnh viêm màng

não, bệnh viêm màng phổi, bạch hầu, uốn ván, trong phẫu thuật chữa

các bệnh nhiễm trùng, các vết thương

- Cephalosporin: được chiết từ chủng nấm mốc thuộc giống

Cephalosporium có khả năng chống được cả vi khuẩn gram (+) và vi

khuẩn gram (-) Tuy nhiên hoạt tính kháng sinh của Cephalosporin kém

hơn hoạt tính của Penicillin.

- Griseofluvin: được chiết từ một số loài nấm mốc thuộc giống

Penicillium (Pen urticae, Pen nigricans, Pen raistrichi, ) không có

hoạt tính chống vi khuẩn nhưng khả năng chống nấm khá mạnh nên

thường được dùng để chữa các bệnh nấm cho người và gia súc.

Hàng năm sâu bệnh đã gây ra những tổn thất khá lớn cho ngành nông nghiệp Theo tài liệu của FAO thì số thiệt hại do sâu gây ra chiếm tỉ lệ là

13.8%, do bệnh là 11.6%, do cỏ đại là 9.5% trên tổng sản lượng nông sản,

ước tính khoảng 75 tỷ USD/ năm Sản lượng bị thiệt hại này đủ để nuôi

sống khoảng 150 triệu người Ngoài ra sâu bệnh còn làm giảm phẩm chất của nông sản, gây độc cho người và gia súc, làm hỏng đất trồng, trở ngại cho việc phát triển một số cây có giá trị kinh tế

Ở Việt nam đo điều kiện khí hậu nhiệt đới nên sâu bệnh có được môi

trường thuận lợi để phát triển và gây hại Trong các loại bệnh cho cây thì

vi nấm gây bệnh chiếm khoảng 83% Theo kết quả nghiên cứu năm

1971-1976 của Viện Bảo Vệ Thực Vật thì trong số 24 bệnh hại lúa thì có đến 13 bệnh do vi nấm, trong số 34 bệnh hại ngô thì có đến 26 bệnh do vi nim

Luận văn tốt nuhiệp OVE Crm 29g 0X tt cm

Một số bệnh gây nguy hiểm cho cây như bệnh đốm van, đạo ôn, thối cổ rễ,

thin thư, mốc sương chủ yếu do vi nấm gây ra | 12]

Sau đây chúng tôi giới thiệu kỹ hơn một số bệnh do vi nấm gây ra:

3.1.1 Bệnh đốm van:

Bệnh đốm vằn do nấm Rhizoctonia gây ra Nấm Rhizoctonia không hình thành bào tử mà sinh sản bằng cách hình thành các cấu trúc dạng hạch.

Chính các hạch nấm và sợi khuẩn ty là phương tiện phát tán và lây nhiễm

Hạch nấm có màu trắng khi còn non, chuyển sang màu nâu dần và trở

thành nâu sậm khi già Ở dạng hạch nấm hoặc sợi khuẩn ty chúng có thể

tồn tại lâu dai Đặc biệt các hạch nấm có thể sống trong nhiều tháng ở cácđiều kiện khác nhau ví dụ như: trong đất khô hay đất ẩm có thể sống ít

nhất từ 4 đến 21 tháng; trong điều kiện ngập nước có thể sống tới 8 tháng

nhưng tỷ lệ sống giảm đi rất nhiều do bị yếm khí hay do vi sinh vật đối

kháng tiêu diệt (theo T.W Mew va A.M Rosale - IRRI 1989).

Vết bệnh đầu tiên thường ở bẹ lá, ngang mặt nước ruộng Bệnh lan dần từ

be dưới lên be trên kể cả phiến lá Đốm có hình bầu dục dài từ 1-3 cm, có màu trắng hay xám xanh với vién mau nâu Khi bệnh phát triển đến lá cờ năng suất có thể giảm 20-25% Bệnh đốm văn gây thiệt hại mạnh khi

nhiệt độ và ẩm độ cao [7].

Trong những năm gần đây bệnh đốm van trở nên nghiêm trọng ở hầu hết

các quốc gia trồng lúa trên thế giới Riêng tại đồng bằng sông Cửu Long,

bệnh có mặt ở nhiễu nơi trong tất cả các vụ lúa nhưng vụ hè thu thì gây hại

nặng hơn Hiện nay bệnh này khá phổ biến ở các tỉnh Tiền Giang, An

Giang, Long An, Bệnh thường xuất hiện khi lúa sau 45 ngày tuổi nhưng thường phát triển mạnh lúc lúa ở giai đoạn 60 ngày tuổi.

3.1.2 Bệnh thối cổ rễ:

Bệnh thối cổ rễ do các nấm Fusarium oxysporum, Rhizoctonia, Sclerotium

gây ra Bệnh này thường xuất hiện sớm Cây bị vàng héo từ các lá phía

dưới lan dần lên các lá trên rồi chết khô do thiếu chất dinh dưỡng Gốc rễ

bị thối khô, quanh gốc có vết nâu lõm vào và trong diéu kiện ẩm ưới

thường được phủ đầy bởi các sợi nấm màu trắng, sau đó xuất hiện các

hạch nấm màu trắng rối chuyển dần sang màu nâu Hach nấm cũng rơi vã trên đất quanh gốc, mô dẫn truyền trong thân bị thối nâu.

Các cây họ đậu điều có thể bị nhiễm bệnh này Nấm lưu tên trong đất, cá:

xác cây bệnh [7].

Luân văn tốt nghiệp SVTH: Phạm Thị Kim Chỉ

3.1.3 Bệnh thán thư:

Bệnh này do nấm Colletotrichum gây ra.

Trên lá có đốm màu nâu sậm, dạng có góc cạnh không đều gân lá có màu

đen hoặc nâu sậm Thân và trái có vết nâu tròn và lõm xuống Trong điều kiện ẩm ướt, trên các vết bệnh có chất nhờn màu hồng nhạt Khi bệnh

nặng, cây bị làn [7].

3.2 Biện pháp sinh học phòng trừ bệnh hai cây trông:

Hiện nay người ta nhận thấy biện pháp sử dụng hóa chất phòng trừ sâu

bệnh có nhiều nhược điểm như: gây ô nhiễm môi trường, gây độc hại cho

người va gia súc, một số hóa chất là tác nhân gây ung thw Đặc biệt là dư

lượng thuốc trừ sâu cao trong lương thực thực phẩm có thể gây ngộ độc cho

người sử dụng Từ đó yêu cầu về an toàn vệ sinh thực phẩm đã được đặt

ra, theo đó cần phải sản xuất ra những sản phẩm sạch, không dùng hoá

chất, năng suất cao,

Để giải quyết được vấn đề trên biện pháp dùng vi sinh vật tỏ ra rất có hiệu

quả Đặc điểm nổi bật của các chế phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật là

không gây ô nhiễm môi trường, hầu như không gây độc cho người và vật

nuôi; có tính đặc hiệu cao mà lại tránh được hiện tượng “lờn” thuốc của

côn trùng gây hại Các vi sinh vật trong chế phẩm có tính thích nghi cao

nên tham gia vào các hoạt động đấu tranh sinh học một cách tích cực như:

tạo ra chất kháng sinh hoặc độc tố để tiêu diệt các mầm bệnh Các vi sinh

vật diệt côn trùng có thể nhiễm lên côn trùng bằng nhiều con đường khác

nhau, có khả năng phát tán rộng do đó có thể xuất hiện bất ngờ, tốc độ

nhanh mang tính chất ổ bệnh dẫn đến gây chết côn trùng có hại trên một địa bàn rộng giúp cho cây trồng được bảo vệ một cách có hiệu quả.

Thực tế cho thấy hiện nay người ta ngày càng sử dụng rộng rãi nhiều chế

phẩm kháng sinh và các chủng vi sinh vật đối kháng làm phân vi sinh sử

dụng trong nông nghiệp mang lại hiệu quả kinh tế cao và khắc phục các

yếu tố bất lợi của thuốc hóa học như Polioxin (NhậU trừ bệnh đạo ôn hại

lúa, Phitobacteriomicin phòng trừ vi khuẩn hại các cây họ đậu, chế phẩm

là Boverin (có chứa nấm Beauveria bassiana) có khả năng tiêu diệt hơn

một trăm loài côn trùng gây hại 14, 120-122]

Đặc biệt chế phẩm EM có hiệu quả hết sức lớn lao, hiện nay đã và đang

được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi.

Luận văn tốt nghiệp vin: roam ony nunc

3.2.1 Giới thiệu về chế phẩm EM:

Vào năm 1980, giáo sư tiến sĩ Teruo Higa (Nhật) đã lần đầu tiên giới thiệu

khái niệm “Vi sinh vật hữu hiệu ” (EM - Effective Micro-organisms) Theo

đó, một số các vi sinh vật có lợi đã được nuôi cấy để làm phương tiên cảithiện đất trồng, trừ khử các loại bệnh, cải thiện hiệu quả sử dụng các loạichất hữu cơ có trong đất trồng Công nghệ này mang lại một triển vọng cho

ngành nông nghiệp, nên đã được đẩy mạnh nghiên cứu triển khai áp dụng Tháng 11/1989, tại Thái Lan chế phẩm EM đã được giới thiệu trong hội

nghị quốc tế giữa các nước Châu Á - Thái Bình Dương Tại Việt Nam, Bộ

Khoa Học Công Nghệ Và Môi Trường đã quyết định triển khai việc ứng

dụng EM từ tháng 5/1997.

EM là một sản phẩm dịch thể chứa khoảng 80 loài vi sinh vật thuộc 10 chỉ

và 5 bộ khác nhau Năm bộ khác nhau đó là: vi khuẩn quang dưỡng, vi

khuẩn lactic, nấm men, nấm mốc và xạ khuẩn Đặc biệt EM gồm cả hai

loại vi sinh vật hiếu khí (aerobic) và kị khí (anaerobic) sống chung Chúng

tạo ra những sản phẩm khác nhau hỗ trợ nhau phát triển và cải tạo môi

trường chúng sống [18,10]

Chế phẩm EM có thể được sử dụng như chất phòng ngừa để làm tăng tính

đa dạng của vi khuẩn có trong đất Vì vậy có thể cải thiện năng suất và chất lượng cây trồng.

Chế phẩm EM không phải là thuốc trừ sâu tổng hợp nên không chứa hóa

chất mà là chất phòng ngừa thuộc loại vi sinh hoạt động như một máy

kiểm soát vi sinh trừ khử và kiểm soát sâu hại bằng cách đưa các vi sinh

vật có lợi vào môi trường Do đó sâu hại và các tác nhân gây bệnh bị tiêu

diệt hay kiểm soát bằng một quá trình tự nhiên do sự gia tăng hoạt động cạnh tranh và đối kháng của những vi sinh vật có trong chế phẩm EM

Khi chế phẩm EM tạo thành một cộng đồng trong đất thì số lượng vi sinh

vật hữu hiệu cũng tăng lên Do vậy hệ vi sinh vật trở nên phong phú và hệ

sinh thái vi sinh trong đất trở nên cân bằng Chế phẩm EM làm cho một sé

vi sinh vật đặc trưng (đặc biệt là vi sinh vật có hại) không gia tăng nên các

căn bệnh trong đất không còn nữa

Ré cây tiết ra các chất hoạt động như carbon-hydrat, axit amin, axit hữu cc

và enzime Chế phẩm EM đã sử dụng các chất này cho sự tăng trưởng Trong suốt quá trình này, rễ cây cũng tiết ra và cung cấp axit amin, axi nucleic, các loại vitamin, hormon cho cây Chính vì thế trong những vin;

đất có chế phẩm EM cây xanh luôn phát triển tốt [18,6-7].

Luận văn tốt nghiệp OVE Pian E244 wun com

- Chiết xuất cây cỏ lên men EM (EM-F.P.E.:Effective

Micro-organisms Fermented Plant Extract).

La dung dich vi sinh vật sống ở dang tiém sinh EMI nguyên chất là dung

dịch lỏng, mùi dé chịu, vị chua ngọt, độ pH<3.5

Dung dịch gốc EMI có tác dụng: tăng sinh khối vi sinh vật trong đất; cải

thiện đất trồng, thay đổi các đặc tính lý hóa của đất theo chiêu hướng có

lợi cho cây trồng; ngăn ngừa sâu bệnh; tăng năng suất, chất lượng câytrồng; khử mùi, bảo quản thực phẩm

Dung dịch gốc EMI phải pha loãng với nước và rỉ đường rồi tưới vào đất

hoặc phun lên cây trong vòng 24 giờ sau khi pha [18,12].

Dung dich EMS:

Được điều chế từ EMI và một số yếu tố khác EMS là chất tiêu diệt côn

trùng, không gây độc.

Dung dịch EM5 có tác dụng kích thích sự nảy mầm, ra hoa, kháng sâu

bệnh Ngoài ra EM5 còn được dùng để kiểm soát quần thể côn trùng (EM5

được côn trùng mang đến nơi dự trữ thức ăn, quá trình lên men xảy ra trong

thức ăn làm cho côn trùng không ăn được dẫn tới số lượng quần thể bị

giảm).

EMS được dùng với nồng độ loãng từ 1 đến 2 phần nghìn Phun EMS sau khi cây nảy mầm, khi phát hiện cây bị bệnh và sâu hai Phun vào buổi sáng hoặc sau khi mưa to Có thể phun trực tiếp lên côn trùng Hàm lượng

dư không gây hại mà còn có tác dụng tốt cho vụ sau Phun EMS tốn thời

gian và lâu có tác dụng nhưng có lợi lâu dài và không hại sức khỏe, không

gây 6 nhiễm môi trường [18,221-22]

Luận văn tốt nghiệp OVID chum ang nen set

hôi từ chất thải động vat Bon EM Bokashi cho đất trồng làm tăng hiệu

xuất sử dụng chất hữu cơ, cung cấp nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật.

EM Bokashi được sử dụng trong vòng 3 đến 14 ngày sau khi lên men Sử dụng cho đất trồng chứa các chất hữu cơ chưa phân hủy.

Tùy thuộc vào qui trình sản xuất có 2 loại: loại hiếu khí và loại ky khí.

- Loại hiếu khí có ưu điểm là có thể sản xuất ở qui mô lớn do không cần

ủ kín và thời gian lên men ngắn nhưng có nhược điểm là năng lượng phát sinh bị mất mát nếu không kiểm soát hợp lý.

Loại ly khí có ưu điểm là duy trì được năng lượng chất hữu cơ nhưng có

nhược điểm là dé hư hỏng nếu không bảo quản tốt [18,14-15].

Chiết xuất cây cd lên men EM (EM-F.P.E):

Gồm cỏ tươi lên men với mật rỉ, EMI EM-E.P.E có tác dụng cung cấp chất

dinh dưỡng tiêu diệt côn trùng nhờ những hoạt chất từ các loài cây cỏ,

dược thảo Ngoài ra còn có tác dụng xua đuổi, tiêu diệt côn trùng, tăng khả

năng miễn dịch cho cây trồng vật nuôi.

Sử dụng bằng cách phun (với nông độ | phần nghìn) sau khi cây nảy mam; khi phát hiện cây bị sâu bệnh Phun vào buổi sáng hoặc sau khi mưa to

{18,24-25].

3.2.3 Các lĩnh vực ứng dụng của chế phẩm EM:

Chế phẩm EM đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực:

EM trong sản xuất lương thực:

Ngâm hạt giống trong dung dịch EM loãng (1 phần nghìn) để thúc đấy su

nảy mâm, phòng dịch và sâu hại cho cây trồng Thường phun EM lên cây

trong các giai đoạn cây con, giai đoạn phát triển Sau khi thu hoạch, vẻ

tru, rơm ra, được xử lý tạo thành phân bón cho cây trồng bằng cách phur

EM loãng (1 phần nghìn) và Bokashi.

Ngoài ra EM còn có tác dụng trừ cỏ trên ruộng lúa theo nguyên tắc: kick

thích cỏ mọc bằng cách ngâm nước ruộng Sau khi cỏ mọc mạnh thi phd

nắng đất, cày xới cho cỏ chết Sau đó phun EM để phân hủy cỏ thành pha:

bón cho đồng ruộng | 18,27-30].

EM được sử dụng trong chăn nuôi đem lại nhiều hiệu quả rõ rệt: khử mù

hôi, giảm ruồi nhặng; tăng năng suất chất lượng thịt, sữa, làm gia súc ma dé Ngoài ra EM còn được sử dụng trong ngành thủy sản nhằm cải thiệ môi trường nước, diệt mùi hôi Khi trộn EM Bokashi vào thức ăn với til

11

Luận văn tốt nghiệp OVI 7 IIQFEE 2 tHỊ nun X2

I - 5% sẽ kích thích cho vật nuôi ăn nhiều, chóng lớn, chất lượng thịt cao

[18,31-34] _

Việc ứng dụng chế phẩm EM ở một số nước trên thế giới đã đem lại nhiều

kết quả đáng chú ý:

Ở Hàn Quốc, khi tiến hành thử nghiệm ảnh hưởng của EM lên sự sinh

trưởng và hiệu quả ở những loại cây trồng khác nhau nhận thấy: sản lượng lúa tăng 16%, sự sinh trưởng của rau cải và cà rốt tăng cao hơn

so với cách sử dụng phân bón hóa học Đối với tiêu đỏ thì cho sản

lượng không thay đổi nhiều nhưng tăng khả năng chống chịu của cây

trồng (bình thường tiêu đỏ bị chết 50% do nấm gây ra còn khi phun EMthì chỉ còn 2% chịu ảnh hưởng của nấm gây bệnh)

Ở Đài Loan, EM được sử dụng trong việc canh tác vải nhằm nâng cao

chất lượng quả, quản lý và tiêu diệt các loài côn trùng gây hại

Ở Brazil, EM đã được dùng trong sản xuất ngũ cốc, chăn nuôi gia súc

gia cầm, các loài sống dưới nước EM cũng đã được ứng dụng để xử lý nước, nước thải và chất thải công nghiệp (của các ngành sản xuất dầu

cọ, giấy, thuộc da, cao su, ), đã tái chế bã bùn của nhà máy ở dạng

rắn và lỏng thành các chất dinh dưỡng hữu ích cho cây trồng.

Ở Thái Lan, EM đã được sử dụng nhiéu trong việc xử lý rác.

Ở Việt Nam, dưới sự hỗ trợ của trung tâm giao lưu kinh tế, văn hóa đối

ngoại Quảng Tây, trường Đại học Quốc gia Hà Nội đã hợp tác với Sở

nông lâm nghiệp Hà Tây và Nông trường 1A để thử nghiệp trên lúa,

chè, dưa chuột, đậu céve, lợn, và đã thu được những hiệu quả rõ rệt

Chẳng hạn như dịch pha loãng 1% EM phun cho chè làm tăng sản lượng trên 11%, phun 3 lần cho lúa làm tăng thêm 460kg thóc trên |

ha Dịch pha loãng 0.5% phun cho dưa chuột, cho đậu côve làm tăng

sản lượng hơn so với đối chứng không phun Đáng lưu ý là tại các

ruộng có phun EM sâu và bệnh giảm hẳn Lợn ăn thức ăn có trộn chế phẩm EM làm tăng hẳn sản lượng, khi phun EM vào chuồng trại thì

giảm hẳn mùi hôi thối [18].

12

PHẦN 2

NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 ĐỐI TƯỢNG VÀ VAT LIEU NGHIÊN CỨU:

- Các chủng nấm mốc được phân lập từ chế phẩm EM do phòng thí

nghiệm vi sinh trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh cung cấp.

- Vi sinh vật kiểm định: Escherichia coli gram(-) và Bacillus subtilis

gram(+) do trường Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh cung cấp

- Các giống nấm gây bệnh ở cây tréng bao gồm: Colletotrichum,

Rhizoctonia, Sclerotium, Fusarium oxysporum do Bộ môn bảo vệ thực

vật trường Đại học Nông Lâm cung cấp.

- _ Một số giống cây trồng: đậu xanh, dưa gang, xà lách do Công ty Giống

cây trồng miền Nam cung cấp.

1.2 Vật liệu nghiên cứu:

1.2.1 Môi trường Czapek - Dox (MTI):

ha: | 1000 ml

Khoai tây 300 g Đường kính 50 g

NHẤT uc 1000 ml Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, thái hat lựu, cân lấy 300 g cho vào 500 ml nước

cất đun sôi trong 30 phút Lọc lấy nước trong, bổ sung nước cất cho đi

1000 ml, cho 50 g đường kính rồi đun cho tan đường là được

Nếu làm môi trường đặc thì bổ sung 2 % agar.

- a ss

Lian văn tốt nghiệp 3 V//17 rnam any num on

12.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định (MT3):

CÍÌCOB ooeereceercooeee 10 g

MgSO, ©°ssEÐesssetesaeaseseeaeae 5 8 NHÍ or rrgsnererrtrrrrnn 5 g AQP izenrreeerevooroeig 20 g

Nước cất 1000 ml

Tinh bột tan 10 g FSEPIDTluerrratrrreesnnrduuya 5 g

NT guueeeeereeneseeser 3 g

K;HPO, 9996099669909690069666666666 1.5 Ẽ

KH;PO - 15g PROM Go tgGa6:ttoasssae IS g

| 1000 ml

Cazein được làm tan riêng bằng NaOH IN, các chất còn lại chung với

nhau Sau đó trộn 2 dung dich lại với nhau và sử dụng dung dịch HCI 1N

để chỉnh lại độ pH=7

1.2.6 Môi trường phân giải Cellulose (MT6):

Se 10 g c 5 8 L4; Fl aS TU TT cư l g MpSDNseeeraronennreơon 5 8

FAROE coevsocsususancvsseerersvees 20 g

od: | 1000 ml

Môi trường này tương tự như MT4 chỉ khác là thay vì dùng tinh bột thi thay

thé bằng CMC (Carboxy Methyl Cellulose)

14

Lucin văn tốt nghiệp V171: raam int NƯU Cứu

L.3 Hóa chất:

1.3.1 Dung dịch Lactophenol:

Acid phenic 10 g

Acid lactic 10 g GÌYXETNHsrrerenireaeoceo 20 g

Cấy nấm mốc nghiên cứu vào ống thạch nghiêng, sau 3 ngày cho khoảng

5ml nước cất vô trùng vào ống giống Sau đó lăn nhẹ ống giống trong lòng bàn tay để các bào tử thấm nước tạo thành dịch huyền phù Dùng que cấy

thẳng đã vô trừng nhúng nhẹ vào dịch huyền phù rồi cấy 1 điểm vào giữa

dia petri có đổ I lớp MT1 Để khuẩn lạc nấm mốc mọc được gọn, không có

tình trạng bào tử bị rơi rớt thì khi cấy cần chú ý phải cấy ngược theo cách

như sau: lật úp đĩa môi trường, nâng phần đĩa có môi trường lên, mặt môitrường hướng xuống và que cấy được đưa từ dưới lên trên Sau khi cấy

xong để đĩa petri ở nhiệt độ phòng và quan sát khuẩn lạc từng ngày về các đặc điểm sau:

- _ Tốc độ phát triển của khuẩn lạc.

- Màu sắc và sự biến đổi màu sắc của khuẩn lạc.

- Hình dáng khuẩn lạc, mép khuẩn lạc.

15

Luận văn tốt nghiệp Ovi) PHẠ THỊ nun tựa

- Sac tố tiết vào môi trường

2.1.2 Quan sát vi thể:

Phương pháp làm phòng ẩm để quan sát hệ sợi khuẩn ty của nấm mốc:

Đặt vào giữa đĩa petri một miếng thạch có kích thước 5mm x 5mm Sau đó

cấy nấm mốc nghiên cứu vào 2 góc đối của miếng thạch, đậy lamen đã tiệttrùng lên miếng thạch rồi đậy nắp đĩa petri lại Để ở nhiệt độ phòng, sau 3

ngày thì quan sát.

Khi nấm mốc phát triển chỉ cần lấy lamen ra rồi nhỏ vào dung dịch

lactophenol hoặc xanh cotton vào nơi có sợi nấm phát triển và quan sátdưới kính hiển vi ở vật kính x 40 và x 100 về các đặc điểm sau:

Trong quá trình sống một số vi sinh vật tiết vào môi trường một số chất (có

thể là kháng sinh hoặc độc tố) có tác dụng kiểm hãm hoặc ức chế hoàn toàn sự tăng trưởng và phát triển của các vi sinh vật khác.

Hoạt tính ức chế vi sinh vật kiểm định được xác định bằng kích thước của

vòng vô khuẩn Kích thước vòng vô khuẩn được tính bằng hiệu số của

đường kính trung bình của vòng vô khuẩn với đường kính lỗ thạch (9mm).

Phương pháp khuếch tán trong thạch:

- Cho 50 ml MT2 vào mỗi bình tam giác (loại 250 ml), sau đó cấy nan

mốc nghiên cứu vào.

- Pun chảy MT3, đợi cho môi trường nguội dần đến khoảng 40 — 45°C

thì trộn dịch huyền phù vi sinh vật kiểm định vào Lắc đều rồi từ từ dé

vào đĩa petri Chờ cho môi trường đông lại, dùng khoan thạch đường

kính 9 mm ấn nhẹ lên bé mặt thạch để lấy ra những thỏi thạch hình trụ

- Dung pipet Iml đã vô trùng hút lấy 2 giọt dịch nuôi cấy nấm mốc (di

được nuôi cấy 5 ngày) rồi nhỏ vào lỗ thạch

16

Luận văn tốt nghiệp V171: roam ing noncn

Để dia petri vào tủ lạnh khoảng 4 — 5 giờ cho chất kháng sinh khuếch

tán vào môi trường thạch Sau đó đặt vào tủ ấm giữ nhiệt độ 37°C đối với E coli và ở nhiệt độ phòng đối với Bac subtilis Sau 36 giờ lấy ra

quan sát và đo đường kính vòng vô khuẩn

Lưu ý:

Phải chọn các đĩa petri có đáy phẳng và có kích thước bằng nhau bởi vìchiều dày của lớp thạch ảnh hưởng đến độ khuếch tán của chất kháng

sinh.

Lượng dịch nuôi cấy phải như nhau ở tất cả các đĩa petri.

Mật độ vi sinh vật kiểm định dùng để thử phải ổn định cho tất cả cácmẫu thí nghiệm

2.3 Xác định thời gian tạo chất kháng sinh:

Phương pháp:

Cho 50 ml MT2 vào mỗi bình tam giác (loại 250 ml), sau đó cấy nấm

mốc nghiên cứu vào

Vào các thời điểm 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ, 144 giờ kể từ khi cấy nấm mốc tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn của các chủng nấm mốc để xác định thời gian tạo chất kháng sinh nhiều nhất.

2.4 Xác định ảnh hưởng của H lên khả năng sinh

Phương pháp:

Lần lượt cho 50 ml MT2 đã điều chỉnh độ pH=2, pH=3, pH=4, pH=5, pH=6, pH=7, pH=8 vào các bình tam giác (loại 250 ml), sau đó cấy

nấm mốc nghiên cứu vào

Sau thời gian nuôi cấy tương ứng với thời điểm tạo kháng sinh nhiều

nhất (đã được xác định ở thí nghiệm trên) tiến hành quan sát:

e Cách mọc của tản nấm trên bể mặt môi trường

e Sắc tố tiết vào môi trường

e _ Độ đục của môi trường.

Sau đó tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn.

17

Luận văn tốt nghiệp QWVJET rngm ing nue Cn

2.5 Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của chế phẩm kháng

sinh:

Phương pháp:

- Cho 50 ml MT2 vào mỗi bình tam giác (loại 250 ml), sau đó cấy nấm

mốc nghiên cứu vào

- Sau thời gian nuôi cấy tương ứng với thời điểm tạo kháng sinh nhiều

nhất (đã được xác định ở thí nghiệm trên) dùng pipet đã vô trùng hút

5ml dịch nuôi cấy cho vào mỗi ống nghiệm đã vô trùng và xử lý ở

nhiệt độ 30°C, 40°C, 60°C, 80°C, 100°C trong vòng 10 phút, 20 phút, 40

phút và 60-phút để tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn ở từng

điều kiện tương ứng

2.6 Xác định khả năng sinh enzime ngoại bào:

2.6.1 Xác định khả năng phân giải tỉnh bột:

Nguyên tắc:

Tinh bột khi gặp thuốc thử iode (dung dịch lugol) sẽ bắt màu xanh đậm Ở

nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột khi nhỏ thuốc thử lugol thì môi

trường sẽ không xuất hiện màu xanh đậm mà có vòng phân giải trong suốt,

không nhuộm màu xanh xung quanh và dưới khuẩn lạc.

Phương pháp:

Tiến hành cấy khuẩn lạc khổng 16 của nấm mốc nghiên cứu trong MT4 trên đĩa petri Sau 3 ngày khuẩn lạc đã mọc tốt, nhỏ lugol vào đĩa và quan sát, đo đường kính vòng phân giải và đường kính khuẩn lạc.

2.6.2 Xác định khả năng phân giải cazein:

Nguyên tắc:

Một số nấm mốc có khả năng tạo thành men cazeinaza do đó có kha năng

phân giải cazein thành acid amin Xung quanh khuẩn lạc của các chủng

nấm mốc này sẽ hình thành các vòng phân giải trong suốt.

Phương pháp:

Tiến hành cấy khuẩn lạc khổng 16 của nấm mốc nghiên cứu trong MT5

Sau 4 ngày quan sát, đo đường kính vòng phân giải và đường kính khuar

lạc.

18

tuận vữn tốt nghiệp Y1: Pram in nun xu

2.6.3 Xác định kha năng phân giải cellulose:

Phương pháp:

Tiến hành cấy khuẩn lạc khổng 16 của nấm mốc nghiên cứu trong MT6

trên đĩa petri Sau 4 ngày khuẩn lạc đã mọc tốt, nhỏ dung dịch TCA 10%

vào đĩa và quan sát, đo đường kính vòng phân giải và đường kính khuẩn

- Cho 10 ml MT2 vào mỗi ống nghiệm rồi cấy nấm mốc nghiên cứu vào.

Sau 5 ngày quan sát:

e Cách mọc của tản nấm trên bé mặt môi trường.

© Sắc tố tiết vào môi trường.

e Độ đục của môi trường.

- Dùng pipet Iml đã vô trùng hút lấy Iml dịch nuôi cấy nấm mốc nghiên

cứu cho vào ống nghiệm có chứa sin 4ml MT2 Xoay nhẹ ống nghiệm

để trộn đều hỗn hợp này, rồi sau đó cấy nấm gây bệnh hai cây trồng

vào Quan sát từng ngày về các đặc điểm sau:

© Sy phát triển hay không của các chủng nấm gây bệnh trên bể mặt

môi trường.

¢ D6 đục của môi trường.

e Sắc tố tiết ra của các chủng nấm gây bệnh ở cây trồng (nếu có)

nước cất

— Bot Wes Su Đsuey,

+99) Csi Menene ,

Luận văn tốt nghiệp OVI: ram THỊ Nữ Xứ

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

1 KIEM TRA LAI NGUỒN GIỐNG VI SINH VAT:

Thời gian qua phòng thí nghiệm vi sinh — sinh hóa — sinh lý thực vật của

trường Đại học sư phạm TP Hồ Chí Minh phải sửa chữa kéo dài dẫn đến

điều kiện bảo quản giống vi sinh vật không được duy trì một cách bìnhthường Do vậy bộ giống của bộ môn vi sinh có ít nhiều bị ảnh hưởng

khiến cho một số giống sinh trưởng, phát triển không bình thường, bị tạp

nhiễm, thậm chí một số giống bị chết Xuất phát từ tình hình nói trên, bộ

môn đã đặt ra nhiệm vụ phải phân lập lại những giống bị tạp nhiễm, kiểm

tra lại hoạt tính cần có của các giống đang được bảo quản

Chúng tôi đã nhận 17 chủng nấm mốc phân lập từ chế phẩm EM nằm trong tình trạng nói trên và đã tiến hành phân lập lại, kiểm tra một số đặc

điểm sau:

EM:

Từ I7 chủng nấm mốc nói trên, chúng tôi tiến hành phân lập lại, thu được

các chủng ở dạng thuần khiết Khảo sát về đặc điểm hình thái của các

chủng này, chúng tôi có nhận xét như sau:

Đối với các chủng NI, N3, N4, NS, N9, NIS và N17 đã được tác giả

Nguyễn Ngọc Phương [12] khảo sát trước đây, vừa qua được bảo quản

trong điều kiện có nhiều biến động không thuận lợi Sau khi phân lập lại,

chúng tôi đã thu được những chủng thuần khiết, có đặc điểm hình thái

không thay đổi so với kết quả nghiên cứu trước đây [12].

Đối với các chủng còn lại N2, Nó, N7, N8, N10, N11, N12, N13, N14 và

N16 vì nhiều lý do trước đây chưa được khảo sát, chúng tôi tiến hành quan sát đại thể và vi thể nhằm sơ bộ định danh các chủng nấm mốc này Vì

điều kiện phòng thí nghiệm hiện tại không cho phép nên chúng tôi không

thể chụp được hình ảnh vi thé của các chủng nấm mốc này mà chỉ trìnF

bày các hình ảnh đại thể của chúng Kết quả được ghi nhận như sau:

20

Lưáận văn tốt nghiện SVIH: Phạm thi) Kimcn

CHỦNG N2

e Khuẩn lạc tròn, sau 5 ngày nuôi cấy đường kính bằng 77 mm

Khuẩn lạc phát triển nhanh, tâm khuẩn lạc màu trắng gồm những

vòng tròn đồng tâm lấm tấm các bào tử màu xanh đen Rìa khuẩn

lạc mẫu trắng

e Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, cuống sinh bào tử phình to ở

đầu, thể bình ngắn một tầng, bào tử hình cầu kết thành chuỗi.

21

Luận văn tốt nghiệp V111: Pham !Hị aim Chỉ

CHUNG N6

e Khuẩn lạc tròn đều, mọc xốp, sau 5 ngày nuôi cấy đường kính

bằng 84 mm Bề mặt khuẩn lạc có màu xanh xám Mặt trái khuẩn

lạc lõm vào có màu vàng nhạt chạy theo chiều xoắn ốc

e Khuẩn ty phân nhánh, không có vách ngăn, bào tử hình cầu kết

thành chuỗi, túi bào tử kín hình cầu.

22

Luận văn tốt nghiệp XVIH: Phạm thy Kum Chì

CHỦNG N7

e Khuẩn lạc tròn, sau 7 ngày nuôi cấy đường kính bằng 35 mm Sợi

khuẩn ty mọc bện chặt Rìa khuẩn lạc có màu xanh nhạt Bề mặt

khuẩn lạc có nhiều giọt tiết màu vàng Mặt trái khuẩn lạc có màu

vàng cam.

e Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, cuống sinh bào tử gồm

những thể hình tia, bào tử hình cầu kết thành chuỗi.

23

Luận văn tốt nghiệp SVIH: Pham [hj Kim Cat

CHUNG N8

e Khuẩn lạc tròn, sau 5 ngày nuôi cấy đường kính bằng 70 mm.

Khuẩn lạc gồm 2 vòng tròn đồng tâm: vòng trong có màu xanh có

những giọt tiết màu vàng nhạt; vòng ngoài có màu trắng Khuẩn

ty mọc theo hình phóng xạ.

e Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, cuống sinh bao tử phình to ở

đầu, thể bình một tầng lỏng lẽo, bào tử hình cầu kết thành chuỗi.

Luận văn tốt nghiệp SVTH: Pham Thị Kim Cín

CHỦNG NI10

e Khuan lạc tròn, sau 7 ngày nuôi cấy đường kính bằng 40 mm Sợi

khuẩn ty mọc bện chặt Rìa khuẩn lạc có màu trắng Khuẩn lạc gồm nhiều vòng tròn déng tâm Khuẩn ty mọc theo hình phóng

xạ.

e Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, cuống sinh bào tử phân

nhánh 2 lần và đối xứng, bào tử hình cầu kết thành chuỗi.

Luận văn tốt nghiệp SVIH: Phạm [hy Kim Cnt

CHUNG NII

e Khuan lạc tròn, sau 5 ngày nuôi cấy đường kính bằng 13 mm Sợi

khuẩn ty mọc bện chặt, mịn Bề mặt khuẩn lạc có màu trắng về

sau chuyển sang màu nâu Bề trái khuẩn lạc lõm vào có sắc tố

màu vàng nhạt về sau chuyển sang màu tím.

e Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, cuống sinh bào tử dày đặc,

bào tử hình cầu kết thành chuỗi

CHUNG N14

e Khuan lạc tròn, sau 5 ngày nuôi cấy đường kính bằng 40 mm Bề

mặt khuẩn lạc có màu vàng nhạt, ở giữa có khuẩn ty khí sinh mọc

vươn lên.

e Khuẩn ty phân nhánh, không có vách ngăn, bao tử hình cầu.

26

Luận văn tốt nghiệp SVTH: Phạm Thị Kim Cm

CHUNG N12

e Khuẩn lạc tròn đều, sau 5 ngày nuôi cấy đường kính bằng 44 mm

Bề mặt khuẩn lạc có màu đen mọc theo những vòng tròn đồng

tâm Rìa khuẩn lạc có màu trắng.

e Khuẩn ty phân nhánh, không có vách ngăn, cuống sinh bao tử

hình cầu chứa các bào tử hình cầu ở bên trong.

CHUNG N16

e Khuẩn lạc tròn, sau 5 ngày nuôi cấy đường kính bằng 72 mm Bề

mặt khuẩn lạc có màu xanh gồm 3 vòng tròn đồng tâm Bề trái

khuẩn lạc gồm 3 vòng tròn đồng tâm: vòng trong cùng có màu

vàng nhạt; kế đến là vòng màu den; vòng ngoài cùng màu xanh

e Khuẩn ty phân nhánh, không có vách ngăn, bào tử hình cầu.

27

Luận văn tốt nghiệp SVTH: Phạm Thị Kim Chỉ

CHUNG N13

e Khuẩn lạc tròn, sau 7 ngày nuôi cấy đường kính bằng 90 mm Bề

mặt khuẩn lạc có màu xám xanh mọc theo những vòng tròn đồng

tâm, ria khuẩn lạc có màu trắng Bể trái khuẩn lạc gồm nhiều

vòng tròn đồng tâm.

e Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, cuống sinh bao tử phình to ở

đầu, thể bình một tầng chặt, bào tử hình cầu kết thành chuỗi

Luận văn tốt nghiệp SVTH: Phạm Thị Kim Chi

Với kết quả quan sát đại thể và vi thể của 10 chủng nấm mốc trên, đối

chiếu khóa phân loại (theo tài liệu của tác giả Nguyễn Lân Dũng [2,tap 2])

chúng tôi đã sơ bộ định danh các chủng nói trên như sau:

Bang 1: Sơ bộ định danh các chủng nấm mốc phân lap tit chế phẩm EM:

CHỦNG KẾT LUẬN

Chủng N2 Chi Aspergillus.

Ching N6 Chi Mucor.

Ching N7 Chi Penicillium.

‘Ching N8 Chi Aspergillus.

Ching N10 Chi Penicillium.

Ching N11 Chi Penicillium.

Ching N12 Chi Mucor.

Ching N13 Chi Aspergillus.

Ching N14 Chi Rhizopus.

Ching N16 Chi Rhizopus

Kết qua ở Bảng ! cho thấy:

- C6 3 chủng thuộc chi Aspergillus (N2, N8, N13)

- Có 2 chủng thuộc chi Mucor (Nó, N12)

- Có 3 chủng thuộc chi Penicillium (N7, N10, N11)

- Có 2 chủng thuộc chi Rhizopus (N14, N16)

29

Luận văn tất nghiệp SVTH: Phạm Thị Kim Chỉ

1.2 Kiểm tra hoạt tính kháng sinh của các chủng nấm mốc phân lập từ chế phẩm EM đối với vi sinh vật kiểm định:

Từ 17 chủng nấm mốc hiện có chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng

kháng khuẩn trên vi sinh vật kiểm định: gram (-): Escherichia coli (E coli)

và gram (+): Bacillus subtilis (Bac subtilis) bằng phương pháp khuếch tán

trong thach.

Khả năng ức chế vi sinh vật kiểm định được xác định bằng độ lớn kích

thước vòng vô khuẩn Kích thước vòng vô khuẩn được tính bằng hiệu số của đường kính trung bình của vòng vô khuẩn với đường kính lỗ thạch

(9mm) Kết quả thí nghiệm được ghi nhận như sau:

- Đối với vi sinh vật kiểm định gram (-): E coli các chủng nấm mốc

không có khả năng ức chế.

- Đối với vi sinh vật kiểm định gram (+): Bac subtilis:

e Các chủng NI, N3, N4, N5, N9, NI5 và N17 đều có khả

năng ức chế vi sinh vật kiểm định Bac subtilis Từ kết quả

này một lần nữa khẳng định chúng có thể tiết ra các chất có

hoạt tính sinh học - chất kháng sinh làm ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định Trong số đó chủng N9 có

hoạt tính tạo kháng sinh cao nhất (thể hiện qua kích thước

vòng vô khẩn lớn nhất là 44.7 mm)

e Các chủng còn lại như N2, Nó, N7, N8, NI0, N11, N12,

N13, N14 và N16 không có khả năng ức chế vi sinh vật kiểm định.

Kết quả thí nghiệm trên hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác

giả Nguyễn Ngọc Phương [12] Điều này chứng tổ các chủng nấm mốc này khá ổn định sau thời gian bảo quản khoảng | năm trong điều kiện ở phòng

thí nghiệm.

30