Nghiên cứu Đặc Điểm sinh lý sinh hóa của các chủng loại nấm mốc Được phân lập từ chế phẩm em có khả năng sinh kháng nấm gây bệnh

Hướng dang vi sinh vật để phòng trừ sâu hại bảo vệ cây trồng ngày một phát đạm Nitrazin, Azotobacterin, phan vi sinh vật phân giải lân ngày càng được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước và man

LOT CAM ON Trước liên em xin trân ong cảm on TS Trdn Thi Thanh — người thdy da tan tình chỉ bảo, hướng cẩn về mặt khoa học,

“8 tài nà)

AXin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô trường Đại Học Sứ Pham TP H8 Chi Minh dé day dd, tuyển đạt cho cm các kiến thức quý: báu trong suốt thời gian học tập tại trưởng, Đặc biệt xin cảm ơn uy: Thầy Có công tác tại Phòng thí xghiệm ví si, sinh hóa, sinh lý thực vật thaậc Khoa Sinh than lei cho em trong thời gian thực hiện đ tài này:

An cảm ơn Cha AMẸ đã nuôi dạy cơn khôn lớn thành người nhục ngày hôm nay:

Cam on ede anh chi, cdc ban ding mn da giip dé, động viên

ôi trọng suối thời gian bốn năm học tập lại Imường

TP HÀ Chí AMinl, tháng 5 năm 20071 Pham Thi Kim Chỉ

1.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa:

2 NAM MOC VÀ SỰ HÌNH THÀNH CHẤT KHÁNG SINH:

3 BIEN PHAP.SINH HỌC PHÒNG TRỪ BỆNH HAI CÂY TRÔNG:

3.1 Tình hình chung về bệnh hại cây trốn;

3.2 Biện pháp sinh học phòng trừ bệnh hại cây trồng:

PHAN 2 NOI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU

1 ĐỐI TƯƠNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1 Đối tượng nghiên cứu:

1.2 Vật liệu nghiên cứu:

PHAN 3: KET QUA VA BIEN LUẬN

1 KIỂM TRA LAI NGUỒN GIỐNG VỊ SINH VẬT:

3.5 Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bên của chế phẩm Tư

KHẢ NĂNG TẠO KHÁNG SINH CAC

2.1 Đặc điểm hình thái:

2.2 Xác định thời gian tạo chất kháng sinh:

2.3 Ảnh hưởng cũa độ pH lên khả năng tạo chất kháng sinh: - 2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bên của chế phẩm kháng sinh: 48 2.5 Khả năng phân giải các hợp chất cao phân tử:

3 UNG DUNG CUA CHE PHẨM EM: St 3.1 Thử khả năng kháng nấm gây bệnh ở oy, rỗng: " 3.2 Anh hưởng của chất kháng sinh lên khả năng nảy mam của hạt: 60

LỜI MỞ ĐẦU

Nhu cầu lương thực, thực phẩm của nhân loại ngày càng tăng Sự gia tăng

dân số và việc nâng cao mức sống đòi hồi ngành sản xuất lương thực thực chú trọng là sử dụng phân bón, thuốc trừ sâu hóa học nhằm tăng sản lượng

cho cây trồng Nhưng qua một thời gian dài, dư lượng của thuốc trừ sâu và

phân bón hóa học đã làm đất đai ngày càng bị thoái hóa, ảnh hưởng nghiêm trọng đối với sức khỏe, đời sống của con người, vật nuôi và gây

mất cân bằng sinh thái

Trước tình hình đó, các nhà khoa học đã không ngừng tìm kiếm các hình thức hữu hiệu để khắc phục những hạn chế trên Dùng biện pháp sinh học

để phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng là một hướng có nhiễu triển vọn;

Đầu tiên người ta chỉ chú ý đến vai trò của những côn trùng có lợi cho đấu

tranh sinh học (còn gọi là thiên địch) như bọ rùa, bọ xít, ong ký sinh, Sau một thời gian người ta đã phát hiện vai rò tích cực của vi sinh vật Hướng dang vi sinh vật để phòng trừ sâu hại bảo vệ cây trồng ngày một phát đạm (Nitrazin, Azotobacterin), phan vi sinh vật phân giải lân ngày càng được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước và mang lại nhiều hiệu quả

năng nảy mắm, ra hoa, kết trái đồng thời tăng năng suất và chất lượng của cây trồng

Để góp phần tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng chế phẩm EM tại Việt

Nam, chúng tôi đã tiến hành khảo sát và tìm hiểu ứng dụng của một số chủng nấm mốc được phân lập từ chế phẩm EM với để tài: °Nghiên cứu

đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm mốc được phân lập từ chế

phẩm EM có khả năng sinh kháng sinh kháng nấm gây bệnh ở cây

trồng”

4 ;

PHAN 1:TONG QUAN TAI LIEU

1 MỘT SỐ KHÁI NIỆM VỀ NẤM MỐt

Nấm mốc (mold) là tên chung để chỉ các loại nấm hiển vi có cấu tạo sợi

mũ nấm như các loại nấm lớn Tuy nhiên ở các giai đoạn chưa sinh mũ

nấm thì khuẩn ty thể của nấm lớn vẫn được xem là nấm mốc

“Trong tự nhiên nấm mốc phân bố rất rộng rãi và tham gia tích cực vào các thành chất mùn

“Trong thực tế, nấm mốc thường gặp ở dạng các mốc mọc trên thực phẩm,

cơ chất hữu cơ khi gặp khí hậu nóng ẩm Trên nhiều vật liệu vô cơ do dính

bụi như các thấu kính ở ống nhòm, máy ảnh, kính hiển vi nấm mốc vẫn

có thể phát triển, sinh axít và làm mờ các vật liệu này Nhiều log mốc có giá trị lớn trong công nghiệp, được dùng nhiều trong việc sẵn xuất các loại axít hữu cơ, men, chất kháng sinh, vitamin Trái lại nhiều loại nấm cũng gây thiệt hại trong bảo quản thực phẩm và

vật, thực vật gây ra các bệnh nấm khá nguy hiểm Nhiều loại nấm sinh ra

các độc tố có thể gây bệnh ung thư và nhiều bệnh tật khác.[1,90] 1.1 Đặc điểm hình thái

Nấm mốc có cấu tạo sợi, phân nhánh hoặc không phân nhánh, có vách

nhưng cũng có thể đến 10 um

Trong quá trình sinh trưởng, các sợi nấm vừa phát triển theo chiểu dài vừa

phân nhánh, riêng đối với các sợi nấm có ngăn vách thì còn phát triển

tiếp Toàn bộ sợi nấm và các nhánh phát triển từ một bào tử nấm được gọi

là hệ sợi nấm Hệ sợi nấm thường phát triển thành một khối có hình dạng

nhất định thường có tiết diện hình tròn hoặc gần tròn gọi là khuẩn lạc Các

sợi nấm chỉ có sự tăng trưởng ở ngọn Một số sợi nấm sinh trưởng bằng cách đâm sâu vào cơ chất và hút các chất dinh dưỡng ở trong đó gọi là

khuẩn ty cơ chất Ngược lại một phần hệ sợi nấm phát triển trên bể mặt

của cơ chất gọi là khuẩn ty khí sinh Ở nhiều loài, các sợi của hệ sợi nấm nằm bên ngoài cơ chất là cơ quan sinh sản [2,348-349]

Mỗi tế bào trong một sợi nấm (ngăn vách hoặc không ngăn vách) không

có giới hạn, không có cấu tạo riêng và cũng không có các hoạt động trao

có sự phân hóa khác nhau, nhưng sự phân hóa này không liên quan đến dạng cấu tạo tế bào đặc trưng của sợi nấm

Các thành phần cấu tạo của tế bào, nhân tế bào ở nấm vẻ cơ bản không celluloza,ngoại trừ một số nấm roi thuộc lớp phụ nấm noãn (Oomycetidae)

tế bào được cấu tạo bởi celluloza-glucan Thành phẩn gluxit của thành tế

bào ở các nhóm phân loại chiếm hẳu hết ở các loài nấm này 1a kitin,

kitozan va glucan, chất dự trữ gluxit ở tế bào nấm không phải là tỉnh bột

‘ma Ia glycogen ~ chất dự trữ thường có ở động ví

Nấm mốc không có chất diệp lục nên không có khả năng tổng hợp các chất hữu cơ từ khí cacbonic mà sử dụng trực tiếp chất hữu cơ có sẵn để sinh sống, sống dị dưỡng

Nấm mốc sống hoại sinh hoặc kí sinh, một số nhỏ cộng sinh với tảo trong

dia y

Nấm mốc chỉ mọc tốt trong môi trường có nhiễu không khí, thường phát

triển trên bể mặt của cơ chất dưới dạng những lớp lún phún hình sợi, lớp

màng nhện hay khối sợi bông

Nấm sinh sản chủ yếu bằng bào tử Từ bào tử mọc ra sợi nấm và sau đó là

hệ sợi nấm đều có thể dùng để sinh sản được Các mảnh này khi rơi trên môi trường dinh dưỡng thì phát triển và tạo thành một hệ sợi nấm mới Trong phòng thí nghiệm thường dùng phương pháp này để nhân giống

13.349]

1.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa:

Nấm mốc thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí nghĩa là không thể phát triển

được khi không có oxy

'Nấm mốc thường phát triển tốt trong môi trường trung tính (pH=7), một số

nấm mốc thích nghỉ với môi trường axit (pH<7) hoặc môi trường hơi ng:

về kiểm Tuy nhiên nấm mốc không chịu được môi trường quá axit hay

8280 bào tử nấm mốc trong I gam Mỗi loài nấm mốc có một độ ẩm tương

ứng thích hợp nhất cho việc phát triển.|5]

Mỗi loại nấm mốc phát triển thích hợp ở những nguồn cơ chất khác nhau

Hâu hết các nấm mốc phát triển thích hợp ở nhiệt độ từ 20°C đến 30°C

Bình thường các hợp chất cao phân tử như tỉnh bột, cellulose, protein, rất

khó phân giải nhưng nấm mốc có khả năng sinh ra các enzime như amylaza, celluloza, proteaza, 6 hoat tinh phân giải khá cao để phân giải các hợp chất cao phân tử này

Các enzime từ nấm mốc được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như trong

công nghiệp thực phẩm: sản xuất rượu, bia, bánh mì, nước tương, nước

chấm, trong công nghiệp thịt, sữa, trong bảo quản thực phẩm, trong nông nghiệp Ngoài ra enzime còn được sử dụng trong y học: sản xuất một số thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa, chữa bệnh tìm mạch, trong giải phẫu để làm thuốc chống viêm và làm sạch các vết thương 10,154- 168]

Giới thiệu một số enzime được sản xuất từ nấm mốc :

- Amylaza 1a enzime thủy phân tỉnh bột, được sử dụng nhiều nhất trong lĩnh vực đường hóa thực phẩm Thủy phân tỉnh bột bằng amylaza trước maltoza va cuối cùng là glucoza [8,173] Các giống nấm mốc được

Asp batatae, Rhizopus delemer, Rh neveus, Rh japonicum va nhiéu

loài Mucor Ngày nay người ta dùng các tác nhân hóa học và vật lý

làm đột biến nấm mốc Aspergillus và thu được nhiều chủng mới có

hoạt lực sinh amylaza cao (Asp niger S, Asp.niger 2-4) Trong công nguyên thủy hoặc đột biến của các giống Asp oryzae, Asp usamii, Asp awamori, Asp niger, Asp batatae [10,116-117] + Proteaza là enzime công nghiệp quan trọng thứ hai sau amylaza Được

sử dụng nhiều nhất trong công nghiệp bột giặt, trong công nghiệp sữa,

nghiệp thực phẩm, xử lý chất thải Trên thị trường có các loại

nấm mốc được dùng để sẵn xuất proteaza gồm có:

«Nhóm mốc vàng (Asp oryzae, Asp flavus, Asp fumigatus, Asp terricola, Asp sojae,Pen chrysogenum) sinh proteaza có vùng pH

từ 3.7 đến 10 nhưng thích hợp nhất ở pH = 6.5

s Nhóm mốc đen (Asp usamii, Asp awamori, Asp niger, Pen 'expansum, Rh javanicus) chủ yếu tạo thành proteaza có vùng pH

từ 2.5 đến 3 [10,117-118]

- _ Cellalaza là một phức hệ enzime gồm có cellulaza C¡, cellulaza C, và

B glucosidiza (8,189] Các giống nấm mốc được dùng để sản xuất

cellulaza gồm có: Asp niger, Asp flavus, Asp oryzae, Fusarium

oxysporum, Fusarium solani, Pen notatum, Pen variabile, Rh species Alternaria, Tricoderma, Aspergillus, Penicilium, Chúng được tách từ

đất quanh vùng rễ cây, từ các mẫu thực vật, từ than bùn và các nguồn

tự nhiên khác có quá trình phân hủy cellulose Trong giống Alternaria

tenius có khoảng 150 chủng có thể phân hủy giấy lọc đến 80% [10,121]

Pectinaza được sẵn xuất từ các giống nấm mốc như: Pen glaucum, Pen, citrinum, Sclerotinia libertiana, Một số chủng đột biến của các

loài Asp awamori, Asp niger được chú ý nhiểu trong sản xuất

Sự phát triển của vi sinh vật trong tự nhiên liên quan mật thiết đến chất

dinh dưỡng trong môi trường và mối liên hệ giữa chúng Hiện tượng đối

kháng rất phổ biến và là cơ chế bảo vệ trong đấu tranh sinh tổn của các vi sinh vật trong quần thể,

Kháng sinh là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện tượng,

hoặc ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác

“Thuật ngữ kháng sinh (antibioric) được S.A Waksman để ra năm 1940 để

các chất có nguồn gốc vi sinh vật có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc

tiêu diệt một số vi sinh vật khác [10,320] Theo Semiakin và Khokhlov

có tác dụng ức chế và tiêu diệt vi sinh vật khác (vi khuẩn, vi rút, protozoa,

tế bào ung thư ) một cách chọn lọc ngay ở nổng độ thấp

Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ nấm mốc chiếm tỷ lệ khá lớn tuy

nhiên do độ độc tướng đối cao nên chưa được sử dụng rộng rãi trong thực chỉ

tiển Đa số những nấm mốc sinh chất kháng sinh thuộc nhóm nấm bất toàn

(Fungi imperfacti)

“Trước đây chất kháng sinh được sử dụng chủ yếu trong y học, nhưng sau đó

được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác [10,345-346]

Có thể đơn cử một số chất kháng sinh phổ biến có nguồn gốc từ nấm mốc 112.31:

~_ Penieillin được chiết từ dịch nuôi cấy Penicillium chrysogenum có hoạt

tính khá mạnh chống vì khuẩn gram (+): Staphylococcus, Diploeoecus đây là chất kháng sinh được tìm ra đầu tiên và được sử dụng rộng rãi ở

chủ yếu chống một loạt các vi khuẩn gây bệnh như: bệnh viêm màng não, bệnh viêm màng phổi bạch hầu, uốn ván, trong phẫu thuật chữa các bệnh nhiễm trùng, các vết thương,

- Cephalosporin: được chiết từ chủng nấm mốc thuộc giống

Cephalosporium có khả năng chống được cả vi khuẩn gram (+) và vi

khuẩn gram (-) Tuy nhiên hoạt tính kháng sinh của Cephalosporin kém

hơn hoat tinh cia Penicillin

- Griseofluvin: được chiết từ một số loài nấm mốc thuộc giống

Penicillium (Pen urticae, Pen nigricans, Pen raistrichi, _) không có

hoạt tính chống vi khuẩn nhưng khả năng chống nấm khá mạnh nên

thường được dùng để chữa các bệnh nấm cho người và gia súc

3 BIÊN PHÁP SINH HỌC PHÒNG TRỪ BÊNH HAI CÂY TRONG:

Hàng năm sâu bệnh đã gây ra những tổn thất khá lớn cho ngành nông nghiệp Theo tài liệu của FAO thì số thiệt hại do sâu gây ra chiếm tỉ lệ là 13.8%, do bệnh là 11.6%, do cỏ dại là 9.5% trên tổng sản lượng nông sản, ước tính khoảng 75 tỷ USD/ năm Sản lượng bị thiệt hại này đủ để nuôi

sống khoảng I50 triệu người Ngoài ra sâu bệnh còn làm giảm phẩm chất

của nông sản, gây độc cho người và gia súc, làm hỏng đất trồng, trở ngại

cho việc phát triển một số cây có giá trị kinh tế

Ở Việt nam do điều kiện khí hậu nhiệt đổi nên sâu bệnh có được môi

vi nấm gây bệnh chiếm khoảng 83% Theo kết quả nghiên cứu năm 1971-

1976 của Viện Bảo Vệ Thực Vật thì trong số 24 bệnh hại lúa thì có đến 13 bệnh do vi nấnñ, trong số 34 bệnh hại ngô thì có đến 26 bệnh do vi nấm

Một số bệnh gây nguy hiểm cho cây như bệnh đốm văn, đạo ôn, thối cổ rễ, thần thư, mốc sương chủ yếu do vi nấm gây ra | 12] Sau đây chúng tôi giới thiệu kỹ hơn một số bệnh do vi nấm gây ra: 3.1.1 Bệnh đốm vằn:

Bệnh đốm vằn do nấm Rhizoctonia gây ra Nấm Rhizoctonia không hình Chính các hạch nấm và sợi khuẩn ty là phương tiện phát tán và lây nhiễm

Hạch nấm có màu trắng khi còn non, chuyển sang màu nâu dẫn và trở

điểu kiện khác nhau

nhất từ 4 đến ZI tháng; trong điều kiện ngập nước có thể sống tới 8 tháng

kháng tiêu diệt (theo T.W Mew va A.M Rosale ~ IRRI 1989)

'Vết bệnh đầu tiên thường ở bẹ lá, ngang mặt nước ruộng Bệnh lan dẫn từ

bẹ dưới lên bẹ trên kể cả phiến lá Đốm có hình bầu dục dài từ 1~3 cm, có năng suất có thể giảm 20-25% Bệnh đốm vần gây thiệt hại mạnh khi

nhiệt độ và ẩm độ cao [7]

Trong những năm gắn đây bệnh đốm vần trở nên nghiêm trọng ở hầu hết bệnh có mặt ở nhiễu nơi trong tất cả các vụ lúa nhưng vụ hè thu thì gây hại

nặng hơn Hiện nay bệnh này khá phổ biến ở các tỉnh Tiển Giang, An

thường phát triển mạnh lúc lúa ở giai đoạn 60 ngày tuổi 3.1.2 Bệnh thối cổ rễ:

Bệnh thối cổ rễ do các nấm Fusarium oxysporum, Rhizoctonia, Sclerotium

gây ra Bệnh này thường xuất hiện sớm Cây bị vàng héo từ các lá phía

dưới lan dân lên các lá trên rồi chết khô do thiếu chất đinh dưỡng Gốc rễ

thường được phủ đẩy bởi các sợi nấm màu trắng, sau đó xuất hiện các

hạch nấm màu trắng rối chuyển dẫn sang màu nâu Hạch nấm cũng rơi vã

xúc cây bệnh [7]

3.1.3 Bệnh thán thư:

Bệnh này do nấm Colletotrichum gây ra

Trên lá có đốm màu nâu sậm, dạng có góc cạnh không đều gân lá có màu

đen hoặc nâu sâm Thân và trái có vết nâu tròn và lõm xuống Trong điều nặng, cây bị lùn [7]

3.2 Biện pháp sini thòng trừ bệnh:

Hiện nay người ta nhận thấy biện pháp sử dụng hóa chất phòng trừ sâu người và gia súc, một số hóa chất là tác nhân gây ung thư Đặc biệt là dư

lượng thuốc trừ sâu cao trong lương thực thực phẩm có thể gây ngộ độc cho

ra, theo đó cần phải sản xuất ra những sản phẩm sạch, không dùng hoá

chất, năng suất cao,

Để giải quyết được vấn để trên biện pháp dùng vi sinh vật tỏ ra rất có hiệu quả Đặc điểm nổi bật của các chế phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật là không gây ô nhiễm môi trường, hầu như không gây độc cho người và vật

nuôi; có tinh đặc hiệu cao mà lại tránh được hiện tượng “lờn” thuốc của

côn trùng gây hại Các vi sinh vật trong chế phẩm có tính thích nghỉ cao

nên tham gia vào các hoạt động đấu tranh sinh học một cách tích cực như:

vật diệt côn trùng có thể nhiễm lên côn trùng bằng nhiéu con đường khác nhanh mang tính chất ổ bệnh dẫn đến gây chết côn trùng có hại trên một địa bàn rộng giúp cho cây trồng được bảo vệ một cách có hiệu quả

“Thực tế cho thấy hiện nay người ta ngày càng sử dụng rộng rãi nhiều chế

phẩm kháng sinh và các ching vi

dụng trong nông nghiệp mang lại

yếu tố bất lợi của thuốc hóa học như Polioxin (NhậU trừ bệnh đạo ôn hại

lúa, Phitobacteriomicin phòng trừ vi khuẩn hại các cây họ đậu, chế phẩm

là Boverin (có,chứa nấm Beauveria bassiana) có khả năng tiêu diệt hơn một trăm loài côn trùng gây hại 14, 120-122]

Đặc biệt chế phẩm EM có hiệu quả hết sức lớn lao, hiện nay đã và đang,

được nghiên cứu ứng dụng rông rãi

3.2.1 Giới thiệu về chế phẩm EM:

Vào năm 1980, giáo sư tiến sĩ Teruo Higa (Nhật) đã lẫn đầu tiên giới thiệu khái niệm “Vi sinh vật hữu hiệu " (EM ~ Effective Micro-organisms) Theo thiện đất trồng, trừ khử các loại bệnh, cải thiện hiệu quả sử dụng các loại

chất hữu cơ có trong đất trồng Công nghệ này mang lại một triển vọng cho

ngành nông nghiệp, nên đã được đẩy mạnh nghiên cứu triển khai áp dung, Tháng 11/1989, tại Thái Lan chế phẩm EM đã được giới thiệu trong hội nghị quốc tế giữa các nước Châu Á - Thái Bình Dương Tại Việt Nam, Bộ

Khoa Học Công Nghệ Và Môi Trường đã quyết định triển khai việc ứng

dụng EM từ tháng 5/1997

EM là một sản phẩm dịch thể chứa khoảng 80 loài vi sinh vật thuộc 10 chỉ

khuẩn lactic, nấm men, nấm mốc và xạ khuẩn Đặc biệt EM gồm cả hai

loại vi sinh vật hiếu khí (aerobic) và kị khí (anaerobic) sống chung Chúng,

tạo ra những sản phẩm khác nhau hỗ trợ nhau phát triển và cải tạo môi

trường chúng sống [18,10]

Chế phẩm EM có thể được sử dụng như chất phòng ngừa để làm tăng tính

chất lượng cây trồng

Chế phẩm EM không phải là thuốc trừ sâu tổng hợp nên không chứa hóa

chất mà là chất phòng ngừa thuộc loại vi sinh hoạt động như một máy

kiểm soát vi sinh trừ khử và kiểm soát sâu hại bằng cách đưa các vi sinh

vật có lợi vào môi trường Do đó sâu hại và các tác nhân gây bệnh bị tiêu

diệt hay kiểm soát bằng một quá trình tự nhiên do sự gia tăng hoạt động cạnh tranh và đối kháng của những vi sinh vật có trong chế phẩm EM Khi chế phẩm EM tạo thành một cộng đồng trong đất thì số lượng vi sinh

vật hữu hiệu cũng tăng lên Do vậy hệ vi sinh vật trở nên phong phú và hệ

vi sinh vật đặc trưng (đặc biệt là vi sinh vật có hại) không gia tăng nên các căn bệnh trong đất không còn nữa

Rễ cây tiết ra các chất hoạt động như carbon-hydrat, axit amin, axit hữu ec

và enzime Chế phẩm EM đã sử dụng các chất này cho sự tăng trưởng Trong suốt quá trình này, rễ cây cũng tiết ra và cung cấp axit amin, axi

nucleic, các loại vitamin, hormon cho cây Chính vì thế trong những vùn đất có chế phẩm EM cây xanh luôn phát t

La dung dich vi sinh vật sống ở dạng tiểm sinh EMI nguyên chất là dung,

dịch lỏng, mùi đễ chịu, vị chua ngọt, độ pH<3.5

Dung dịch gốc EMI có tác dụng: tăng sinh khối vi sinh vật trong đất; cải

thiện đất trồng, thay đổi các đặc tính lý hóa của đất theo chiều hướng có

lợi cho cây trồng; ngăn ngừa sâu bệnh; tăng năng suất, chất lượng cây trồng; khử mùi, bảo quản thực phẩm

Dung dịch gốc EMI phải pha loãng với nước và rỉ đường rồi tưới vào đất hoặc phun lên cây trong vòng 24 giờ sau khi pha [18,12]

Dune dich EMS:

Được điều chế từ EMI va một số yếu tố khác EMS là chất tiêu diệt côn trùng, không gây độc

Dung dịch EM5 có tác dụng kích thích sự nảy mẫm, ra hoa, kháng sâu được côn trùng mang đến nơi dự trữ thức ăn, quá trình lên men xảy ra trong

thức ăn làm cho côn trùng không ăn được dẫn tới số lượng quần thể bị

iảm)

EM5 được dùng với nổng độ loãng từ 1 đến 2 phần nghìn Phun EMS sau

sáng hoặc sau khi mưa to Có thể phun trực tiếp lên côn trùng Hàm lượng gian và lâu có tác dụng nhưng có lợi lâu dài và không hại sức khỏe, không gây ô nhiễm môi trường [18,221-22]

Luận tăn tối nghiệp OVE Engen en mes

hôi từ chất thải động vật Bón EM Bokashi cho đất trồng làm tăng hiệu xuất sử dụng chất hữu cơ, cung cấp nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật

EM Bokashi được sử dụng trong vòng 3 đến 14 ngày sau khi lên men Sử dung cho đất trồng chứa các chất hữu cơ chưa phân hủy

Tùy thuộc vào qui trình sản xuất có 2 loại: loại hiếu khí và loại ky khí -_ Loại hiếu khí có ưu điểm là có thể sản xuất ở qui mô lớn do không cân

ủ kín và thời gian lên men ngắn nhưng có nhược điểm là năng lượng

phát sinh bị mất mát nếu không kiểm soát hợp lý

-_ Loại ly khí có ưu điểm là duy trì được năng lượng chất hữu cơ nhưng có nhược điểm là dễ hư hỏng nếu không bảo quần tốt { L8,14- 15]

Chiết suất cây cỡ lên men EM (EM-E.P,E)

Gồm cỏ tươi lên men với mật rỉ, EMI EM-F.P.E có tác dụng cung cấp chất

dinh dưỡng tiểu diệt côn trùng nhờ những hoạt chất từ các loài cây cổ,

dược thảo Ngoài ra còn có tác dụng xua đuổi, tiêu diệt côn trùng, tăng khả năng miễn dịch cho cây trồng vật nuôi

Sử dụng bằng cách phun (với nổng độ 1 phần nghìn) sau khi cây nảy mẫm;

khi phát hiện cây bị sâu bệnh Phun vào buổi sáng hoặc sau khi mưa to (18,24-25}

3.2.3 Các lĩnh vực ứng dụng của chế phẩm EM:

Chế phẩm EM đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiễu lĩnh vực:

EM trong sản xuất lượng thức:

Ngâm hạt giống trong dung dịch EM loãng (1 phần nghìn) để thúc đẩy sụ

nảy mắm, phòng dịch và sâu hại cho cây trồng Thường phun EM lên cây

trấu, rơm rạ được xử lý tạo thành phân bón cho cây trồng bằng cách phur

EM loãng (1 phẩn nghìn) và Bokashi

Ngoài ra EM còn có tác dụng trừ cỏ trên ruộng lúa theo nguyên tắc: kict

nắng đất, cày xới cho cỏ chết Sau đó phun EM để phân hủy cỏ thành phâ:

bón cho đồng ruộng |18,27-30]

EM trong chăn nu

EM được sử dụng trong chăn nuôi đem lại nhiều hiệu quả rõ rệt: khử mù

đề Ngoài ra EM còn được sử dụng trong ngành thủy sản nhầm cải thiệ

môi trường nước, diệt mùi hôi, Khi trộn EM Bokashi vào thức ăn với tỉ I

1 ~ 5% sẽ kích thích cho vật nuôi ăn nhiều, chóng lớn, chất lượng thịt cao [1831-34] —,

Việc ứng dụng chế phẩm EM ở một số nước trên thế giới đã đem lại nhiều kết quả đáng chú ý:

- _ Ở Hàn Quốc, khi tiến hành thử nghiệm ảnh hưởng của EM lên sự sinh trưởng và hiệu quả ở những loại cây trồng khác nhau nhận thấy: sẵn

xo với cách sử dụng phân bón hóa học Đối với tiêu đỏ thì cho sản trồng (bình thường tiêu đỏ bị chết 50% do nấm gây ra còn khi phun EM thì chỉ còn 2% chịu ảnh hưởng của nấm gây bệnh)

Ở Đài Loan, EM được sử dụng trong việc canh tác vải nhằm nâng cao

chất lượng quả, quản lý và tiêu diệt các loài côn trùng gây hại

Ở Brazil, EM đã được dùng trong sản xuất ngũ cốc, chăn nuôi gia súc

gia cảm, các loài sống dưới nước EM cũng đã được ứng dụng để xử lý

nước, nước thải và chất thải công nghiệp (của các ngành sản xuất dầu

cọ, giấy, thuộc da, cao su, , đã tái chế bã bùn của nhà máy ở dạng

rn va lỏng thành các chất dinh dưỡng hữu ích cho cây trồng

Ở Thái Lan, EM đã được sử dụng nhiều trong việc xử lý rác -_ Ở Việt Nam, dưới sự hỗ trợ của trung tâm giao lưu kinh tế, văn hóa đối

ngoại Quảng Tây, trường Đại học Quốc gia Hà Nội đã hợp tác với Sở chè, dưa chuột, đậu côve, lợn, và đã thu được những hiệu quả rõ rệt

Chẳng hạn như dịch pha loãng 1% EM phun cho chè làm tăng sản

lượng trên 11%, phun 3 lẫn cho lúa làm tăng thêm 460kg thóc trên 1

ha Dịch pha loãng 0.5% phun cho dưa chuột, cho đậu côve làm tăng

ruộng có phun EM sâu và bệnh giảm hẳn Lợn ăn thức ăn có trộn chế giảm hẳn mùi hôi thối [18]

PHAN2

NOI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 ĐỐI TƯƠNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU:

Các chủng nấm mốc được phân lập từ chế phẩm EM do phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh cung cấp

- Vi sinh vật kiểm djnh: Escherichia coli gram(-) va Bacillus subtilis

gram(+) do trường Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh cung cấp

- Các giống nấm gây bệnh ở cây trồng bao gổm: Colletotichum,

Rhizoctonia, Sclerotium, Fusarium oxysporum do Bộ môn bảo vệ thực vật trường Đại học Nông Lâm cung cấp

~ _ Một số giống cây trồng: đậu xanh, dưa gang, xà lách do Công ty Giống cây trồng miễn Nam cung cấp

1.2 Vật liệu nghiên cứu:

Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, thái hạt lựu, cân lấy 300 g cho vào 500 ml nước

cất đun sôi trong 30 phút Lọc lấy nước trong, bổ sung nước cất cho đủ

1000 mi, cho 50 ø đường kính rồi đun cho tan đường là được

Nếu làm môi trường đặc thì bổ sung 2 % agar

12.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định (MT3):

đĩa petri có đổ I lớp MTI Để khuẩn lạc nấm mốc mọc được gọn, không có

tình trạng bào tử bị rơi rớt thì khi cấy cẩn chú ý phải cấy ngược theo cách như sau: lật úp đĩa môi trường, nâng phẩn đĩa có môi trường lên, mặt môi

trường hướng xuống và que cấy được đưa từ dưới lên trên Sau khi cấy

xong để đĩa petri ở nhiệt độ phòng và quan sát khuẩn lạc từng ngày về các

đặc điểm sat

độ phát triển của khuẩn lạc

sắc và sự biến đổi màu sắc của khuẩn lạc

~ _ Hình đáng khuẩn lạc, mép khuẩn lạc

2.1.2 Quan sat vi thé:

Phương pháp làm phòng ẩm để quan sát hệ sợi khuẩn ty của nấm mốc:

Đặt vào giữa dia petri một miếng thạch có kích thước 5mm x 5mm Sau đó

cấy nấm mốc nghiên cứu vào 2 góc đối của miếng thạch, đậy lamen đã tiệt trùng lên miếng thạch rồi đậy nắp đĩa petri lại Để ở nhiệt độ phòng, sau 3

ngày thì quan sát

Khi nấm mốc phát triển chỉ cẩn lấy lamen ra rồi nhỏ vào dung dịch

lactophenol hoặc xanh coton vào nơi có sợi nấm phát triển và quan sát

dưới kính hiển vi ở vật kính x 40 và x 100 về các đặc điểm sau:

Hoạt tính ức chế vi sinh vật kiểm định được xác định bằng kích thước của

đường kính trung bình của vòng vô khuẩn với đường kính lỗ thạch (9mm)

Phương pháp khuếch tán trong thạch:

~_ Cho 50 mÌ MT2 vào mỗi bình tam giác (loại 250 mÌ), sau đó cấy nấm mốc nghiên cứu vào

Đun chây MT3, đợi cho môi trường nguội dẫn đến khoảng 40 ~ 45°C

thi trộn dịch huyền phù vi sinh vật kiểm định vào Lắc đều rồi từ từ đc

vao dia petri Chờ cho môi trường đông lại, dùng khoan thạch đườn;

kính 9 mm ấn nhẹ lên bề mặt thạch để lấy ra những thỏi thạch hình trụ

~_ Dùng pipet Iml đã vô trùng hút lấy 2 giọt dịch nuôi cấy nấm mốc (đi được nuôi cấy 5 ngày) rồi nhỏ vào lỗ thạch

- Dé dia petri vao ti lanh khoảng 4 - 5 giờ cho chất kháng sinh khuếch

tán vào môi trường thạch Sau đó đặt vào tủ ấm giữ nhiệt độ 37°C đối

quan sát và đo đường kính vòng võ khuẩn

Lưuý:

- _ Phải chọn các đĩa petri có đáy phẳng và có kích thước bằng nhau bởi vì chiểu dày của lớp thạch ảnh hưởng đến độ khuếch tán của chất kháng xinh

Lượng dịch nuôi cấy phải như nhau ở tất cả các đĩa petri

~_ Mật độ vi sinh vật kiểm định dùng để thử phải ổn định cho tất cả các

~_ Sau thời gian nuôi cấy tương ứng với thời điểm tạo kháng sinh nhiều

nhất (đã được xác định ở thí nghiệm trên) tiến hành quan sát: s_ Cách mọc của tần nấm trên bể mặt môi trường + _ Sắc tố tiết vào môi trường

*_ Độ đục của môi trường

~ _ Sau đó tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn

3.5 Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bên của chế phẩm iz

- Cho 50 ml MT2 vao méi bình tam giác (loại 250 ml), sau đó cấy nấm

mốc nghiên cứu vào

Sau thời gian nuôi cấy tương ứng với thời điểm tạo kháng sinh nhiều 5ml dịch nuôi cấy cho vào mỗi ống nghiệm đã vô trùng và xử lý ở phút và 60-phút để tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn ở từng,

điểu kiện tương ứng

trường sẽ không xuất hiện màu xanh đậm mà có vòng phân giải trong suốt,

không nhuộm màu xanh xung quanh và dưới khuẩn lạc

Phương pháp:

Tiến hành cấy khuẩn lạc khổng 18 của nấm mốc nghiên cứu trong MT4 trên đĩa petri Sau 3 ngày khuẩn lạc đã mọc tốt, nhỏ lugol vào đĩa và quan sát, đo đường kính vòng phân giải và đường kính khuẩn lạc 2.6.2 Xác định khả năng phân giải cazein:

"Tiến hành cấy khuẩn lạc khổng lổ của nấm mốc nghiên cứu trong MTS

Sau 4 ngày quan sát, đo đường kính vòng phân giải và đường kính khuẩr

lạc

3.6.3 Xác định khả năng phân giải cellulose:

~ Cho I0 ml MT2 vào mỗi ống nghiệm rồi cấy nấm mốc nghiên cứu vào

“Sau 5 ngày quan sit:

® _ Cách mọc của tản nấm trên bể mặt môi trường

+ Sắc tố tiết vào môi trường

+ Độ đục của môi trường

Dang pipet Iml da v6 trùng hút lấy Imi dịch nuôi cấy nấm mốc nghiên

cứu cho vào ống nghiệm có chứa sắn 4ml MT2 Xoay nhẹ ống nghiệm vào Quan sát từng ngày về các đặc điểm sau:

© Sy phat triển hay không của các chủng nấm gây bệnh trên bể mặt

môi trường

®_ Độ đục của môi trường

« _ Sắc tố tiết ra của các chủng nấm gây bệnh ở cây trồng (nếu có) 2.8 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của chất kháng sinh lên khả năng

nảy mâm của hạt:

Phương pháp: _

= Cho 50 ml MT2 vào mỗi bình tam giác (loại 250 ml), rồi cấy nấm mốc nghiên cứu vào Sau 5 ngày, thu địch nuôi cấy để tiến hành khảo sát thí nghiệm này chúng tôi khảo sát tỉ lệ nảy mắm của một số loại hạt

tỉ lệ pha loãng 1%, 50%, 100% dịch nuôi cấy Đối chứng ngâm trong nước cất

Luận sn nghiệp x71

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

1 KIỂM TRA LAI NGUỒN GIỐNG VI SINH VẬT:

Thời gian qua phòng thí nghiệm vi sinh ~ sinh hóa ~ sinh lý thực vật của

trường Đại học sư phạm TP Hỗ Chí Minh phải sửa chữa kéo dài dẫn đến điểu kiện bảo quản giống vi sinh vật không được duy trì một cách bình

thường Do vậy bộ giống của bộ môn vi sinh có ít nhiều bị ảnh hưởng,

khiến cho một số giống sinh trưởng, phát triển không bình thường, bị tạp nhiễm, thậm chí một số giống bị chết Xuất phát từ tình hình nói trên, bộ

môn đã đặt ra nhiệm vụ phải phân lập lại những giống bị tạp nhiễm, kiểm

tra lại hoạt tính cần có của các giống đang được bảo quản Chúng tôi đã nhận 17 chủng nấm mốc phân lập từ chế phẩm EM nằm điểm sau:

Kiểm tra về hình tụ

EM:

Ti I7 chủng nếm mốc nói trên, chúng tôi tiến hành phân lập lại, thu được

chủng này, chúng tôi có nhận xét như sau:

Đối với các chủng NI, N3, N4, N5, N9, N15 và N17 đã được tác giả trong điều kiện có nhiều biến động không thuận lợi Sau khi phân lập lại,

không thay đổi so với kết quả nghiên cứu trước đây [12]

Đối với các chủng còn lại N2, N6, N7, N8, N10, N11, N12, N13, N14 và

NI6 vì nhiều lý do trước đây chưa được khảo sát, chúng tôi tiến hành quan

điều kiện phòng thí nghiệm hiện tại không cho phép nên chúng tôi không bày các hình ảnh đại thể của chúng Kết quả được ghỉ nhận như sau:

chủng nấm mốc phân chế,

CHỦNG N2

© Khuẩn lạc tròn, sau 5 ngày nuôi cấy đường kính bằng 77 mm 'Khuẩn lạc phát triển nhanh, tâm khuẩn lạc màu trắng gồm những

lạc mẫu trắng

'Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, cuống sinh bào tử phình to ở

đầu, thể bình ngắn một tẳng, bào tử hình cầu kết thành chuỗi

Hình 1: Đặc điểm hình thái chủng N2 khi nuôi cấy trên MTI (khuẩn lạc khổng lỗ)

21

CHUNG N6

* Khudn lac tron déu, mọc xốp, sau 5 ngày nuôi cấy đường kính bang 84 mm Bể mặt khuẩn lạc có màu xanh xám Mặt trái khuẩn lạc lõm vào có màu vàng nhạt chạy theo chiều xoắn ốc

© Khudn ty phân nhánh, không có vách ngăn, bào tử hình cẩu kết

thành chuỗi, túi bào tử kín hình câu

Hình 2: Đặc điểm hình thái chủng Nó khi nuôi cấy trên MT (khuẩn lạc khổng lô)

CHỦNG N7

© Khudn lạc tròn, sau 7 ngày nuôi cấy đường kính bằng 35 mm Sới

khuẩn ty mọc bện chặt Rìa khuẩn lạc có màu xanh nhạt Bể mặt

khuẩn lạc có nhiễu giọt tiết màu vàng Mặt tái khuẩn lạc có màu vàng cam,

Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, cuống sinh bào tử gồm

những thể hình tỉa, bào tử hình cầu kết thành chuỗi

Hình 3: Đặc điểm hình thái chủng N7 khi nuôi cấy trên MT1

mẫn lạc khổng lỗ)

CHỦNG N12

Khuẩn lạc tròn đều, sau 5 ngày nuôi cấy đường kính bằng 44 mm

Bể mặt khuẩn lạc có màu đen mọc theo những vòng tròn đồng, tâm Rìa khuẩn lạc có màu trắng

Khuẩn ty phân nhánh, không có vách ngăn, cuống sinh bào tử hình cầu chứa các bào tử hình cầu ở bên trong

CHUNG N16

Khuẩn lạc tròn, sau 5 ngày nuôi cấy đường kính bằng 72 mm Bể

mặt khuẩn lạc có màu xanh gồm 3 vòng tròn đồng tâm Bể trái

khuẩn lạc gồm 3 vòng tròn đổng tâm: vòng trong cùng có màu vàng nhạt; kế đến là vòng màu đen; vòng ngoài cùng màu xanh 'Khuẩn ty phân nhánh, không có vách ngăn, bào tử hình cầu

Hình 7: Đặc điểm hình thái chủng N12 và N16 khí nuôi cấy trên MTI (khuẩn lạc khổng lỗ)

CHUNG N13

© Khudn lac tròn, sau 7 ngày nuôi cấy đường kính bằng 90 mm Bể mặt khuẩn lạc có màu xám xanh mọc theo những vòng tròn đồng vòng tròn đồng tâm

Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, cuống sinh bào tử phình to ở

đầu, thể bình một tâng chặt, bào tử hình cầu kết thành chuỗi

Hình 8: Đặc điểm hình thái chủng N13 khi nuôi cấy trên MT1

(khuẩn lạc khổng lổ)

Với kết quả quan sát đại thể và vi thể của 10 chủng nấm mốc trên, đối

chiếu khóa phân loại (theo tài liệu của tác giả Nguyễn Lân Dũng [2,tập 21) chúng tôi đã sơ bộ định danh các chủng nói trên như sau:

1.2 Kiểm tra hoạt tính kháng sinh của các chủng nấm mốc phân lập từ

Từ 17 chủng nấm mốc hiện có chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn trên vi sinh vật kiểm định: gram (-): Escherichia coli (E coli) trong thạch

Khả năng ức chế vì sinh vật kiểm định được xác định bằng độ lớn kích thước vòng vô khuẩn Kích thước vòng vô khuẩn được tính bằng hiệu số (9mm) Kết quả thí nghiệm được ghỉ nhận như sau:

~ Đối với vi sinh vật kiểm định gram (

không có khả năng ức chế

~ _ Đổi vỡi vi sinh vật kiểm định gram (+): Bac subtilis:

«Các chủng NI, N3, N4, N5, N9, N15 và NI7 đều có khả

năng ức chế vi sinh vật kiểm định Bac subtilis Từ kết quả hoạt tính sinh học — chất kháng sinh làm ức chế sự phát hoạt tính tạo kháng sinh cao nhất (thể hiện qua kích thước

coli các chủng nấm mốc