Nghiên cứu Đánh giá tính an toàn của một số chủng probiotic Được phân lập từ nguồn sữa mẹ và phân trẻ sơ sinh

Probiotic mang lại những tác động có lợi cho cơ thể như ức chế vi khuẩn có hại, tăng cường hệ miễn dịch và sức đề kháng cho cơ thể,… Do các công dụng hữu ích trên mà probiotic đã và đang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN CỦA MỘT

SỐ CHỦNG PROBIOTIC ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NGUỒN SỮA MẸ VÀ PHÂN TRẺ SƠ SINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN CỦA MỘT

SỐ CHỦNG PROBIOTIC ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NGUỒN SỮA MẸ VÀ PHÂN TRẺ SƠ SINH

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác

Các số liệu kết quả nêu trong luận văn là trung thực, một phần đã được công

bố trên các hội nghị, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất cứ công trình nào khác

Nếu có gì sai sót, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Ký và ghi rõ họ tên

Lộc Tú Anh

ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới cán bộ hướng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn La Anh và các cán bộ phòng bộ môn Công nghệ Sinh học Vi sinh, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo tôi trong nghiên cứu khoa học, cùng tôi giải quyết nhiều khó khăn vướng mắc trong quá trình hoàn thành luận văn đóng góp những ý kiến quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này

Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn các thầy cô Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi học tập và hoàn thành luận văn này

Và trên hết, tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình và bạn bè

đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và làm việc

Nghiên cứu này được hỗ trợ bởi Chương trình 562, lĩnh vực khoa học sự sống – Bộ Khoa học và Công nghệ, thông qua đề tài ĐTĐL.CN-59/19

Hà Nội, ngày tháng năm 2024

Học viên

Lộc Tú Anh

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii

MỞ ĐẦU 1

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Probiotic 3

1.1.1 Vai trò của probiotic đối với con người 3

1.1.1.1 Tác động của vi khuẩn probiotic đến hệ miễn dịch 3

1.1.1.2 Tác động đến hệ vi sinh vật trong cơ thể 4

1.1.2.Các nguồn vi khuẩn probiotics 6

1.1.2.1 Vi khuẩn probiotic từ thực phẩm lên men 6

1.1.2.2 Vi khuẩn probiotic từ sữa mẹ 8

1.1.2.3 Vi khuẩn probiotic từ phân trẻ sơ sinh 9

1.2 Các đặc điểm cần thiết của chủng vi khuẩn probiotic 10

1.2.1 Chức năng của chủng probiotic 10

1.2.1.1 Khả năng bám dính của vi khuẩn probiotic vào niêm mạc ruột 10

1.2.1.2 Khả năng chịu axit và muối mật của vi khuẩn probiotic 12

1.2.1.3 Khả năng chịu pH của vi khuẩn probiotic 13

1.2.1.4 Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh của vi khuẩn probiotic 13

1.2.2 Tính an toàn của chủng probiotics 14

1.2.2.1 Nguy cơ gây tan máu ở các chủng probiotics 14

1.2.2.2 Sự kháng kháng sinh ở các chủng probiotics 15

1.3 Tình hình nghiên cứu probiotic ở nước ngoài và Việt Nam 21

1.3.1 Tình hình nghiên cứu probiotic ở nước ngoài 21

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25

2.1 Vật liệu 25

2.1.1 Chủng giống vi sinh vật 25

iv

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 25

2.1.3 Hóa chất 26

2.1.4 Môi trường và dung dịch đệm 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Nuôi cấy 28

2.2.2 Xác định mật độ tế bào 28

2.2.3 Xác định khả năng tán máu 28

2.2.4 Đánh giá khả năng bám dính của các chủng vi khuẩn probiotic trên màng nhày ruột in vitro 29

2.2.5 Đánh giá ảnh hưởng của môi trường dạ dày đến khả năng sống sót của vi khuẩn 30

2.2.6 Đánh giá ảnh hưởng của môi trường dịch mật đến khả năng sống sót của vi khuẩn 31

2.2.7 Xác định sự kháng/nhạy cảm với kháng sinh 31

2.2.8 Tách chiết DNA 33

2.2.9 PCR 34

2.2.10 Điện di 35

2.2.11 Xử lý số liệu 36

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Đặc điểm probiotic của các chủng vi khuẩn 37

3.1.1 Khả năng sống sót vi khuẩn probiotic qua dịch dạ dày 37

3.1.2 Khả năng sống sót vi khuẩn probiotic qua dịch mật 39

3.1.3 Khả năng bám dính của vi khuẩn probiotic trên màng nhày ruột in vitro 41 3.2 Sàng lọc khả năng tan máu của các chủng probiotic 43

3.3 Sự tương tác của các chủng vi khuẩn probiotic với kháng sinh 44

3.3.1 Sự tương tác của các chủng Lactobacillus với kháng sinh 45

3.3.2 Sự tương tác của các chủng Bifidobacterium với kháng sinh 47

3.4 Kết quả sàng lọc gen của các chủng vi khuẩn probiotic 48

3.4.1 Kết quả sàng lọc gen của các chủng Lactobacillus 49

3.4.2 Kết quả sàng lọc gen của các chủng Bifidobacterium 53

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

v

4.1 Kết luận 554.2 Kiến nghị 55TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Các chủng vi sinh vật ứng dụng trong chế phẩm sinh học 3Bảng 1.2: Các chủng vi khuẩn được dùng trong chế phẩm probiotic và lợi ích sức khỏe được chứng minh thông qua các thử nghiệm lâm sàng ở người 5Bảng 1.3: Vi khuẩn probiotic phân lập từ thực phẩm lên men 6Bảng 1.4: Cơ chế và phương thức kháng kháng sinh 16

Bảng 1.5: Gen kháng kháng sinh của một số loài Lactobacillus và Bifidobacterium

19Bảng 2.1: Các chủng vi khuẩn probiotic có nguồn gốc phân lập từ sữa mẹ và phân trẻ sơ sinh 25 Bảng 2.2: Điểm cắt vi sinh (mg/l) của một số kháng sinh đối với các loài vi khuẩn 32Bảng 2.3: Dải nồng độ mg/l pha loãng kháng sinh 33Bảng 2.4: Các cặp mồi đặc hiệu của gen kháng kháng sinh và điều kiện thực hiện phản ứng PCR 34Bảng 3.1: Khả năng sống sót vi khuẩn probiotic qua dịch dạ dày 37Bảng 3.2: Khả năng sống sót vi khuẩn probiotic qua dịch mật 39Bảng 3.3: Khả năng bám dính của vi khuẩn probiotic trên chất nhầy thành ruột 41Bảng 3.4: Khả năng tan máu của các chủng probiotic 43Bảng 3.5: Nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh đối với các chủng vi khuẩn

vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc bề mặt của vi khuẩn Gram (+) 10Hình 1.2: Sơ đồ đánh giá sự kháng kháng sinh của một chủng vi khuẩn được sử dụng làm probiotics 20

Hình 3.1: A-Mẫu đối chứng dương của chủng Staphylococcus aureus; B-Mẫu đối chứng âm của chủng Lactobacillus salivarius 1134-3 44

Hình 3.2: Kết quả điện di các đoạn gen khuếch đại của các chủng Lbp, 1148-1, SD1, SH021, SH026, SH027, SH028 trên gel agarose 1% 52Hình 3.3: Kết quả điện di các đoạn gen khuếch đại của các chủng SH011, 1165-11, 1134-3 trên gel agarose 1% 52Hình 3.4: Kết quả điện di các đoạn gen khuếch đại của các chủng 1196-2, 1067-1, 1522-1, AS74, AP12, 1387-1 trên gel agarose 1% 53

1

MỞ ĐẦU

Hiện nay, việc sử dụng các chế phẩm sinh học, bao gồm các sản phẩm probiotic, nhằm hỗ trợ việc điều trị một số bệnh liên quan đến đường tiêu hoá đang ngày càng phổ biến Probiotic được biết đến là nhóm chế phẩm chứa vi

khuẩn sống điển hình như nhóm vi khuẩn Bifidobacterium và Lactobacillus

Probiotic mang lại những tác động có lợi cho cơ thể như ức chế vi khuẩn có hại, tăng cường hệ miễn dịch và sức đề kháng cho cơ thể,… Do các công dụng hữu ích trên mà probiotic đã và đang được xem là một trong những vấn đề cần quan tâm và nghiên cứu nhiều hơn để ứng dụng vào cuộc sống của con người

Hệ vi sinh vật đường ruột người rất đa dạng và phong phú, mật độ ước tính khoảng 1014 vi khuẩn và có đến 1000 – 1150 loài vi khuẩn khác nhau Nghiên cứu của Patterson (2003) đã chỉ ra có từ 20-50% vi khuẩn trong đường ruột là probiotic Trong cơ thể người, vi khuẩn probiotic được tìm thấy ở bề mặt niêm mạc của hệ tiêu hóa, niệu sinh dục và đường hô hấp Theo WHO, nên ưu tiên sử dụng các chủng probiotic có nguồn gốc từ người Do đó vi khuẩn probiotic được phân lập từ sữa mẹ và phân trẻ sơ sinh có tiềm năng sinh học lớn và có tính an toàn cao

Đặc tính đặc trưng của vi khuẩn probiotic bao gồm bám dính tốt vào tế bào biểu mô ruột, chịu được muối mật và pH thấp (từ 1,5-3) trong đường tiêu hoá của

vật chủ; ức chế một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột như Staphylococcus,

Escherichia coli, Salmonella, và đặc biệt có tác dụng kích thích quá trình tiêu

hoá thức ăn, hấp thu chất dinh dưỡng của vật chủ Theo FAO/WHO, các tiêu chí cần thiết để đánh giá vi sinh vật có tiềm năng làm probiotic bao gồm tính an toàn, mật độ lợi khuẩn, khả năng tồn tại trong cơ thể sống và không bị tạp nhiễm Trong

đó tiêu chí an toàn là một yêu cầu tiên quyết của vi khuẩn probiotic để ngăn ngừa mọi rủi ro liên quan đến sức khỏe con người Xuất phát từ những lý do trên, tôi

thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đánh giá tính an toàn của một số chủng probiotic được phân lập từ nguồn sữa mẹ và phân trẻ sơ sinh”

Mục tiêu: đánh giá tính an toàn của một số chủng probiotic được phân lập

từ nguồn sữa mẹ và phân trẻ sơ sinh

2

Nội dung nghiên cứu:

1 Đánh giá các đặc điểm probiotic của các chủng vi khuẩn phân lập được

2 Đánh giá sự tương tác với một số loại kháng sinh của các chủng probiotic

phân lập từ nguồn sữa mẹ và phân trẻ sơ sinh

3 Kiểm tra sự có mặt gen kháng kháng sinh ở các chủng probiotic phân lập

từ nguồn sữa mẹ và phân trẻ sơ sinh

có hại trong đường ruột và duy trì trạng thái cân bằng trong hệ vi sinh vật đường ruột [2] Các chủng vi sinh vật phổ biến trong probiotic là nhóm vi khuẩn lactic, chúng tạo ra sản phẩm là axit lactic trong quá trình lên men và được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như nông nghiệp, công nghiệp, y học và công nghệ thực

phẩm, Vi khuẩn probiotic chủ yếu thuộc vào hai chi vi khuẩn Bifidobacterium

và Lactobacillus, ngoài ra một số vi sinh vật khác như Saccharomyces boulardii,

Saccharomyces cerevisiae, Enterococcus faecium, Bacillus subtilis, … [3]

Bảng 1.1: Các chủng vi sinh vật ứng dụng trong chế phẩm sinh học [3] Lactobacillus sp L acidophilus, L paracasei, L crispatus, L gasseri ,

L gallinarum, L johnsonii, L plantarum, L reuteri, L rhamnosus, L casei

Bifidobacterium B animalis, B adolescentis, B breve, B bifidum, B

infantis, B lactis, B longum

Vi khuẩn axit

lactic khác

Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici

Các loại vi sinh

vật khác

Propionibacterium freudenreichii, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus cereus

1.1.1 Vai trò của probiotic đối với con người

1.1.1.1 Tác động của vi khuẩn probiotic đến hệ miễn dịch

Probiotic tác động đến hệ thống miễn dịch và khả năng chống viên bằng các sản phẩm như chất chuyển hóa, thành phần thành tế bào và DNA Những tác động này được thực hiện qua trung gian ở ruột bằng cách củng cố hàng rào bảo

vệ do sự gia tăng nồng độ của các bạch cầu biểu mô Ngoài ra, probiotic còn kích thích sản xuất yếu tố gây viêm TNF-α và cytokine điều hòa IL-6 để phòng chống lại mầm bệnh và bảo vệ niêm mạc ruột [4]

4

Axit teichoic, là một thành phần trong thành tế bào vi khuẩn Gram (+) của

L plantarum, có tác động đến hoạt động chống viêm Axit teichoic làm ức chế

các cytokine gây viêm bởi các tế bào đơn nhân và bạch cầu đơn nhân trong máu dẫn đến sự gia tăng đáng kể IL-10 Theo Grangette và cs., (2005) nghiên cứu

chủng L plantarum đối với mô hình viêm đại tràng ở chuột cho thấy sự tham gia

của TLR-2 giúp điều hòa miễn dịch và chống lại các tác nhân gây nhiễm trùng [5]

Hai protein p75 và p40 được tổng hợp từ Lactobacillus rhamnosus GG có

tác dụng cân bằng tế bào biểu mô ruột Những protein này kích hoạt Akt và protein kinase B qua trung gian TNF-α Ngoài ra, chúng còn làm bất hoạt con đường truyền tín hiệu protein kinase và kích hoạt các mitogen p38 trong tế bào biểu mô

có tác dụng điều hòa miễn dịch và chống viêm [6]

1.1.1.2 Tác động đến hệ vi sinh vật trong cơ thể

Probiotic có khả năng sống sót được trong hệ tiêu hoá của con người, chúng tập trung trong khoang ruột giúp tạo nên sự cân bằng về vi sinh Vi khuẩn probiotic tác động đến hệ vi sinh vật trong cơ thể thông qua sự cạnh tranh bám dính trên niêm mạc ruột; đối kháng với các tác nhân gây bệnh bằng cách thay đổi

pH, sinh tổng hợp các hợp chất kháng khuẩn; cạnh tranh dinh dưỡng và các yếu

tố tăng trưởng

Vi khuẩn probiotic có khả năng cạnh trạnh bám dính vào các tế bào biểu

mô trong các thử nghiệm nuôi cấy tế bào, do đó ngăn chặn sự bám dính của mầm

bệnh Một số vi khuẩn Lactobacillus và Bifidobacterium có khả năng cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh (bao gồm S Enterica và Yersinia enterocolitica) và

đẩy mạnh sự liên kết chặt chẽ giữa các tế bào biểu mô Chất nhầy do vi khuẩn probiotic sinh tổng hợp ra có tác dụng cô lập và bất hoạt vi sinh vật gây bệnh Mack và cs., (2003) đã nghiên cứu tạo ra chất nhầy MUC3 trong tế bào HT20-

MTX khi nuôi cấy chủng L plantarum 299v và L rhamnosus GG Chất nhầy MUC3 có tác dụng ức chế sự bám dính của chủng E coli gây bệnh đường ruột E2348/69 [7] Ngoài ra sự có mặt của các chủng Bifidobacteria lactis Bb12 và

5

Lactobacillus rhamnosus LGG làm hạn chế sự bám dính của các vi khuẩn gây

bệnh như Salmonella, Clostridium và E coli với chất nhầy trong ruột lợn [8]

Khi cư trú và phát triển ở khoang ruột, probiotic sinh tổng hợp các chất có hoạt tính kháng khuẩn như axit hữu cơ, hydrogen peroxide, bacteriocin … có tác dụng ức chế vi sinh vật gây bệnh Bacteriocin là các peptide hoặc protein được tổng hợp từ riboxom của vi khuẩn, có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn khác Bacteriocin được sản xuất bởi vi khuẩn Gram (+) và thường là LAB

như lactacin B từ L acidophilus, plantaricin từ L plantarum và nisin từ

Lactococcus lactis Chúng có phổ hoạt động hẹp và chỉ có tác dụng chống lại các

vi khuẩn có liên quan chặt chẽ, nhưng một số bacteriocin cũng có hoạt tính chống lại mầm bệnh truyền qua thực phẩm [9] Bacteriocin Abp118 được sản xuất bởi

chủng Lactobacillus salivarius UCC118 có khả năng bảo vệ chuột khỏi bị nhiễm

vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes từ thực phẩm [10]

Vi khuẩn probiotic sản xuất ra nhiều loại axit béo giúp tăng cường sức khỏe

Một số chủng Bifidobacteria và Lactobacillus đường ruột tạo ra axit linoleic liên

hợp (CLA), một chất chống ung thư [11] [12] Bên cạnh đó vi khuẩn probiotic còn sản xuất một số loại kháng sinh nhất định Kháng sinh reuterin (3-

hydroxypropionaldehyde) sản xuất bởi chủng Lactobacillus reuteri ATCC55730,

đây là một loại kháng sinh phổ rộng có hoạt tính chống lại vi khuẩn Gram (+), Gram (-), nấm men, nấm và virus [13]

Bảng 1.2: Các chủng vi khuẩn được dùng trong chế phẩm probiotic và lợi ích sức khỏe được chứng minh thông qua các thử nghiệm lâm sàng ở người [14]

Chủng vi khuẩn Lợi ích sức khỏe được ghi nhận ở người

Giảm tái phát bệnh viêm ruột

1.1.2 Các nguồn vi khuẩn probiotics

Vi khuẩn probiotic được đưa vào cơ thể thông qua các loại thực phẩm như dưa cải, sữa chua, nem, tôm chua và chúng hoạt động chủ yếu trong hệ tiêu hóa

Do đó vi khuẩn probiotics có thể được tìm thấy nhiều nơi như trong hệ tiêu hoá

và trong niêm mạc của người, trong phân của trẻ sơ sinh, sữa mẹ và các thực phẩm lên men khác

1.1.2.1 Vi khuẩn probiotic từ thực phẩm lên men

Hiện nay các loại thực phẩm lên men ngoài thị trường rất đa dạng như kim chi, phô mai, sữa chua và các loại sữa lên men khác Chúng chứa một lượng lớn

hệ vi sinh vật probiotic gồm các loài thuộc chi Lactobacillus, Bacillus,

Leuconostoc, Các loại thực phẩm lên men có tác dụng bổ sung vi khuẩn có lợi

và là nguồn chứa nhiều chất dinh dưỡng như vitamin (bao gồm vitamin C, B, K, B12, ), khoáng chất và chất xơ [15]

Bảng 1.3: Vi khuẩn probiotic phân lập từ thực phẩm lên men [15]

Nguồn phân

lập

Vi khuẩn probiotic Đặc tính vi khuẩn

Kim chi Lactococcus lactis

KC24

Có khả năng ức chế vi khuẩn gây các bệnh về đường tiêu hóa, có khả năng bám dính vào tế bào Caco-2, có hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm, hoạt tính chống oxy hóa và chống ung thư

7

Dưa chuột

muối

Lactobacillus spp Có khả năng ức chế vi khuẩn gây các

bệnh về đường tiêu hóa, có hoạt tính kháng khuẩn và bám dính với xylene Phô mát

truyền thống

L plantarum Có hoạt tính kháng khuẩn

Sữa bò L helveticus KII13,

L helveticus KHI1

Có khả năng ức chế vi khuẩn gây các bệnh về đường tiêu hóa, bám dính vào tế bào Caco-2, có hoạt tính kháng khuẩn và giảm cholesterol

Các sản phẩm sữa lên men là nguồn cung cấp vi khuẩn probiotic lớn, đặc

biệt là các sản phẩm sữa như sữa yak, sữa lạc đà, sữa dê và hạt kefr Chủng L

kefranofaciens XL10 được phân lập từ hạt kefr của Tây Tạng tạo ra các

polysaccharide ngoại bào (EPS) có tiềm năng sinh học lớn Gần đây Bengoa và

cs., (2018) đã đánh giá khả năng bám dính trong ống nghiệm của L paracasei phân lập từ hạt kefr, kết quả cho thấy sau khi đi qua đường tiêu hóa L paracasei

đã tăng khả năng bám dính vào chất nhầy và tế bào biểu mô Ngoài ra một số loại phô mai cũng được sử dụng để phân lập các vi sinh vật có đặc tính tốt như phô

mát Chanakh từ Armenia phân lập được chủng L helveticus INRA-2010-H11 cho

thấy hoạt tính kết tụ và bám dính cao trong ống nghiệm và in vivo [15]

Các sản phẩm lên men có nguồn gốc từ thực vật như bắp cải và dưa chuột muối được Zielinska và cs., (2014) nghiên cứu, kết quả phân lập được 38 chủng

trong đó có 14 chủng được xác định là Lactobacillus spp Các thử nghiệm cho

thấy 14 chủng chịu được pH 2,5, nồng độ muối mật 0,2% Tuy nhiên pH 1,5 làm

chết 11/15 chủng Lactobacillus Đánh giá tính an toàn của 14 chủng

Lactobacillus, kết quả loại bỏ 4/14 chủng Lactobacillus dựa trên tính kháng kháng

sinh và các hoạt động trao đổi chất để sử dụng làm probiotic [16]

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn phân lập có nguồn gốc từ con người có đặc tính probiotic khác so với vi khuẩn có nguồn gốc phân lập từ thực phẩm và các nguồn thông thường khác [17] Bunesova và cs., (2012) báo cáo các chủng phân lập từ đường ruột biểu hiện hoạt tính bám dính cao hơn các chủng phân lập có nguồn gốc từ thực phẩm [18] Theo FAO/WHO khuyến nghị ưu tiên

8

sử dụng vi khuẩn phân lập từ con người làm probiotic [19], do đường tiêu hóa con người có hệ vi sinh vật đa dạng và phong phú, mật độ vi sinh vật ước tính khoảng

1014 Các chủng Lactobacillus và Bifidobacterium phân lập từ con người được

công nhận đạt tiêu chuẩn an toàn giả định và có tiềm năng sinh học lớn [20]

1.1.2.2 Vi khuẩn probiotic từ sữa mẹ

Sữa mẹ là nguồn dinh dưỡng tốt nhất cho trẻ và chứa nhiều chất dinh dưỡng như chất đạm, chất bột đường, vitamin, khoáng chất và các yếu tố vi lượng Sữa

mẹ được đặc trưng bởi hàm lượng globulin miễn dịch cao, chủ yếu là globulin miễn dịch tiết A (sIgA), hỗ trợ khả năng miễn dịch của trẻ sơ sinh [21] Sữa mẹ

là một trong những yếu tố chính hình thành sự cân bằng hệ vi sinh vật trong đường

tiêu hóa của trẻ sơ sinh Trong sữa mẹ chứa tới 200 chủng vi khuẩn khác nhau và

lên đến 103–104 CFU/mL tế bào vi khuẩn Các nhóm vi khuẩn trong sữa mẹ bao

gồm chủ yếu là vi khuẩn lactic như Lactobacillus, Leuconostoc, Enterococcus,

Lactococcus, Weissella và một số loài Bifidobacterium [22] [3]

Đối với trẻ bú sữa mẹ hoặc bú sữa công thức được đặc trưng bởi chủng vi

khuẩn B breve và B infantis Sự đa dạng của hệ vi sinh vật đường ruột của trẻ bú

sữa mẹ có sự khác biệt đối với trẻ bú sữa công thức Ở trẻ sơ sinh được nuôi bằng

sữa mẹ, hệ vi sinh vật gồm Streptococcus và Bifidobacterium chiếm khoảng 90%

tổng số vi sinh vật đường ruột Tuy nhiên, ở trẻ nuôi bằng sữa công thức bao gồm

Bacteroides, Enterobacteriaceae, Enterococcus, Lachnospiraceae [23] và một

lượng Bifidobacterium ít hơn hẳn [24]

Hệ vi sinh vật trong sữa mẹ cũng phát triển theo thời kỳ cho con bú Trong thời kỳ đầu, hệ vi sinh vật trong sữa non đa dạng hơn, chứa nhiều các vi khuẩn có

lợi như Lactobacillus, Bifidobaterium và Streptococcus Ở giai đoạn sau, các lợi

khuẩn này thường giảm đi, thay vào đó là các vi khuẩn cơ hội khác Các yếu tố ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật trong sữa mẹ bao gồm sức khỏe của người mẹ và phương thức sinh nở [25] Đối với trẻ sơ sinh hệ miễn dịch chưa trưởng thành việc nuôi con bằng sữa mẹ giúp tăng cường phát triển hệ miễn dịch, chuyển hóa và hấp thu chất dinh dưỡng, cải thiện chức năng hàng rào ruột [26] Theo Heikkila và cs.,

9

(2003) đã chỉ ra rằng vi khuẩn có trong sữa mẹ có vai trò bảo vệ chống lại vi sinh

vật gây bệnh Staphylococcus aureus [27]

Theo Soto và cs., (2014) nghiên cứu phân lập các mẫu từ sữa mẹ đã phát

hiện vi khuẩn Lactobacillus và Bifidobacteria lần lượt chiếm tỷ lệ 40,91% và 10,61% Các chủng phân lập được thuộc các loài L casei, L fermentum, L

gastrotus, L gasseri, L plantarum, L reuteri, L rhamnosus, L salivius, L vagis,

B breve và B longum Trong đó các loài như L gasseri, L salvius, L reuteri, L fermentum và B breve được coi là những loài có tiềm năng sinh học và được Cơ

quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) công nhận [28]

1.1.2.3 Vi khuẩn probiotic từ phân trẻ sơ sinh

Hiện nay một số bằng chứng cho thấy sự có mặt của vi khuẩn trong môi trường tử cung và những vi khuẩn này có ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật của trẻ trước khi sinh Sự xuất hiện của các loài vi khuẩn trong phân trẻ sơ sinh là kết quả

của sự vận chuyển của các vi khuẩn đường ruột từ người mẹ Enterococcus,

Streptococcus và các loài Propionibacterium đã được phân lập từ máu dây rốn Lactobacillus và Bifidobacterium đã được phát hiện trong nhau thai sinh thường

và sinh mổ ở trẻ sơ sinh [29] [30]

Bifidobacterium là một chi vi khuẩn chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật

đường ruột của trẻ sơ sinh Theo Matamoros và cs., (2013) các chủng

Bifidobacterium phân lập từ phân của 15 trẻ sơ sinh (từ 8 đến 42 ngày tuổi) gồm

sáu loài khác nhau: Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum,

Bifidobacterium teenis, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium bifidum và Bifidobacterium dentium, với B breve và B longum là phổ biến nhất

[30]

Thời gian mang thai là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình hình thành hệ vi sinh vật đường ruột của trẻ sau này So sánh hệ vi sinh vật trong phân của trẻ sinh đủ tháng và sinh non cho thấy sự khác biệt đáng kể

Enterobacteriaceae và các vi khuẩn có khả năng gây bệnh khác như Clostridium difficile hoặc Klebsiella pneumoniae được tìm thấy với số lượng lớn hơn ở trẻ

10

sinh non Ở trẻ đủ tháng, sự đa dạng của vi sinh vật trong phân cao hơn và phổ

biến như Bifidobacterium, Lactobacillus và Streptococcus [30]

1.2 Các đặc điểm cần thiết của chủng vi khuẩn probiotic

1.2.1 Chức năng của chủng probiotic

1.2.1.1 Khả năng bám dính của vi khuẩn probiotic vào niêm mạc ruột

Sự bám dính của vi khuẩn probiotic vào niêm mạc ruột là một trong những tiêu chí lựa chọn quan trọng nhất đối với vi khuẩn probiotic Sự bám dính vào niêm mạc ruột giúp cho các tế bào probiotic không bị rửa trôi; do đó, cho phép chúng lưu trú trong đường ruột, điều chỉnh miễn dịch và cạnh tranh loại trừ các vi sinh vật gây bệnh Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng sự bám dính xảy ra và có tác dụng như một cơ chế hoạt động của probiotic

Vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột ban đầu được thúc đẩy bởi liên kết vật lý không đặc hiệu như các tương tác kỵ nước, sau đó là sự bám dính vào các thành phần thành tế bào Một số nghiên cứu đã báo cáo mối tương quan giữa tính

kỵ nước và độ bám dính Protein bề mặt như proteinase neo ở thành tế bào được nghiên cứu và báo cáo có khả năng tăng cường tính kỵ nước và độ bám dính ở một số vi khuẩn axit lactic [31]

Hình 1 1: Cấu trúc bề mặt của vi khuẩn Gram (+) [32]

Lactobacillus và Bifidobacteria là những vi khuẩn Gram (+) và có các phân

tử bề mặt như axit lipoteichoic (LTA), protein liên kết lớp bề mặt và protein liên kết với chất nhầy (Mubs), chúng đóng vai trò quan trọng trong tương tác với các thành phần chất nhầy Protein liên kết với chất nhầy là các protein kết dính bề mặt

11

có chứa Mub hoặc MucBP (MUCin-Binding Protein), có khả năng liên kết với chất nhầy và được liên kết với thành tế bào peptidoglycan bằng liên kết Leu-Pro-any-Thr-Gly ở đầu C-terminal (LPxTG) MucBP được phát hiện ở các loài vi khuẩn khác nhau, trong khi đó Mub chỉ được tìm thấy ở vi khuẩn lactic phân lập

từ đường tiêu hóa của con người [31]

Ngoài ra, nhóm fimbriae hoặc pili (những cấu trúc phụ của vi sinh vật có dạng như sợi lông trên bề mặt vi khuẩn) thúc đẩy sự bám dính của vi khuẩn Pili loại IV được đặc trưng ở vi khuẩn Gram (-) Những cấu trúc này tạo giúp cho vi khuẩn xâm nhập bề mặt niêm mạc được dễ dàng, các nghiên cứu gần đây đã chỉ

ra rằng vi khuẩn Gram (+) như Bifidobacteria cũng có cấu trúc lông tương tự Một

số loài Lactobacillus như Lactobacillus rhamnosus LGG đặc trưng bởi SpaCBA

và bao gồm các thành phần như SpaA, SpaB, SpaC giúp tăng khả năng bám dính cao ở vi khuẩn [31]

Các protein bề mặt khác như protein liên kết với fibronectin (FBP) và protein lớp bề mặt (SLP) cũng góp phần vào sự bám dính trong niêm mạc ruột của vi khuẩn Fibronectin là một glycoprotein ngoại bào được tìm thấy ở dạng không hòa tan trong ruột FBP đã được đặc trưng ở cả vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) Sự hiện diện của FBP có liên quan đến độc lực của một số mầm bệnh do khả năng xâm nhập vào các tế bào biểu mô của vật chủ Tuy nhiên, FBP có lợi cho vi khuẩn probiotic vì chúng làm tăng khả năng bám dính vào tế bào vật chủ và giúp loại trừ mầm bệnh [33]

Mặt khác, các protein lớp bề mặt (SLP) là các protein ngoại bào bao phủ bề mặt tế bào của vi khuẩn và có vai trò là thành phần cấu trúc và kích thích sự bám dính Một nghiên cứu đã chỉ ra khi loại bỏ lớp SLP bằng phương pháp xử lý hóa học thì độ bám dính vào niêm mạc ruột của vi khuẩn giảm Ngoài ra, SLP có thể tạo ra phản ứng miễn dịch bằng cách tương tác với các thụ thể đường ruột của vật chủ, đồng thời đóng vai trò là yếu tố điều hòa miễn dịch ở vi khuẩn probiotic [31]

Sự bám dính của vi khuẩn probiotic được đánh giá bằng cách sử dụng chất nhầy được hấp phụ trên bề mặt sinh học và các dòng tế bào gây khối u ở người như Caco-2 và HT-29 để mô phỏng sự bám dính với các tế bào biểu mô ruột (IEC)

12

[34] Việc sử dụng các dòng tế bào biểu mô nhằm giúp ích cho việc xác định cơ chế và phân tử bám dính Wang và cs., (2017) sử dụng dòng tế bào HT-29 đã xác định được một loại protein lớp bề mặt mới (protein liên kết choline A) cần thiết

cho sự bám dính của chủng vi khuẩn Lactobacillus salrius REN [35] Việc xác

định các phân tử bám dính và gen của chúng có tác dụng cho việc tạo ra các vectơ nhằm tăng hiệu quả bám dính của các chủng vi khuẩn có lợi khác Cụ thể, khả

năng bám dính thấp của chủng vi khuẩn L casei ATCC 393 đã tăng lên khi gen protein liên kết collagen được nhân bản từ vi khuẩn L reuteri PG4, dẫn đến khả

năng cạnh tranh cao hơn trong tế bào Caco-2 [31]

1.2.1.2 Khả năng chịu axit và muối mật của vi khuẩn probiotic

Axit mật là thành phần chính của mật, được tổng hợp từ quá trình chuyển hóa cholesterol và tham gia vào quá trình tiêu hóa giúp phân cắt và hấp thụ cholesterol, đồng thời chúng cũng ngăn chặn sự hoạt động của hệ vi khuẩn trong đường tiêu hoá [36] Trong quá trình tiêu hóa, chủng probiotic di chuyển từ dạ dày đến tá tràng và tiếp xúc với muối mật Đối với cơ thể người, nồng độ trung bình hiện diện ở ruột non là 0,3% [37] Các chủng probiotic phải có khả năng chịu axit và muối mật từ 0,1 - 0,3% để đảm bảo sự tồn tại và phát triển trong đường tiêu hóa

Axit mật được khử bởi enzyme hydrolase muối mật (BSH) tạo ra axit mật thứ cấp có tác dụng kháng khuẩn mạnh Hoạt tính BSH được phát hiện ở một số

chủng Lactobacillus, Bifidobacteria, Enterococcus và Bacteroides spp BSH có

khả năng miễn dịch, điều hòa hấp thu lipid trong chế độ ăn uống, chuyển hóa cholesterol, cân bằng nội môi về năng lượng và có thể hoạt động như các phân tử tín hiệu [38]

Liong và cs., (2005) đã khảo sát khả năng chịu axit và muối mật của 11

chủng vi khuẩn Lactobacillus trong đó gồm 4 chủng L acidophilus và 7 chủng L

casei Axit cholic và axit cholaic được sử dụng bổ sung vào môi trưởng để đánh

giá khả năng chịu axit – muối mất Kết quả chỉ ra 11 chủng Lactobacillus đều có khả năng chịu được nồng độ axit – muối mật 0,3% Các chủng L casei cho thấy khả năng chịu axit cholic tốt hơn so với chủng L acidophilus Ngược lại với axit

13

cholaic, các chủng L acidophilus cho thấy khả năng chịu axit tốt hơn so với các chủng L casei [39] Theo Alp và cs., (2010) Bifidobacteria spp đều ảnh hưởng bởi nồng độ muối mật 0,3%, một số chủng B breve và B bifidum có khả năng kháng muối mật cao hơn các chủng B lactis và B pseudocatenulatum [40]

1.2.1.3 Khả năng chịu pH của vi khuẩn probiotic

Một tiêu chí quan trọng khác để lựa chọn vi khuẩn probiotic là khả năng chịu được nồng độ axit có trong dạ dày Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn probiotic có thể sống sót khi vận chuyển qua dạ dày, nơi các tế bào được tiếp xúc với giá trị pH nằm trong khoảng từ 1,5 đến 3,0 [41] Theo Haddadi và cs., (2004) điểm ngưỡng để xác định khả năng chịu axit được đặt ở giá trị pH là 3,0 và thời gian ủ bệnh là 3 giờ trong nghiên cứu in vitro vì nó mô phỏng thời gian cư trú trong dạ dày [42] Các nghiên cứu của Hyronimus và cs., (2000); Tee và cs.,

(2013) cho thấy, các chủng vi khuẩn probiotic thuộc chi Lactobacllus có khả năng

chịu được pH thấp ở mức 1,5 đến 2,5 trong thời gian 2 giờ [43] [44] Đối với các

chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus có khả năng chịu được mức pH thấp từ 1,5 đến

2,5 chỉ trong thời gian 90 đến 120 phút [45]

1.2.1.4 Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh của vi khuẩn probiotic

Vi khuẩn probiotic có khả năng tiêu diệt và gây ức chế sự phát triển đối với một số vi khuẩn gây bệnh Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh thông qua các tương tác vật lý giữa vi khuẩn probiotic và biểu mô; giữa vi khuẩn probiotic và

hệ thống miễn dịch và cuối cùng là sự tương tác trực tiếp giữa vi khuẩn với vi khuẩn [46] Probiotic sản sinh ra một số hợp chất kháng khuẩn (như bacteriocin, axit hữu cơ, ) tác động trực tiếp lên mầm bệnh làm giảm sự bám dính của cả mầm bệnh và độc tố của chúng với biểu mô ruột Bacteriocin là hợp chất kháng khuẩn, hoạt động dựa trên việc hình thành các lỗ trên màng tế bào chất sau đó enzyme được tiết ra gây trở ngại cho quá trình trao đổi chất của một số vi khuẩn

gây bệnh Một số chủng Bifidobacteria đã được phát hiện có khả năng tạo ra các

hợp chất giống bacteriocin gây ức chế cho vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) [47]

Bên cạnh đó, các chủng Lactobacillus tạo ra axit axetic, lactic và propionic làm

giảm độ pH dẫn đến kìm hãm quá trình sinh trưởng của nhiều loại vi khuẩn gây

14

bệnh [46] Nhóm vi khuẩn bị ức chế gồm Helicobacter pylori, Staphylococcus

aureus, Salmonella, Listeria monocytogenes, Escherichia coli và Vibrio cholerae,

1.2.2 Tính an toàn của chủng probiotics

Tiêu chí an toàn là một trong những điều kiện tiên quyết của vi khuẩn probiotic Theo khuyến nghị của tổ chức y tế thế giới (WHO), vi sinh vật an toàn

sử dụng trong sản xuất probiotic phải có nguồn gốc, tên khoa học rõ ràng với một

số tiêu chí nhất định sau: thuộc nhóm GRAS (General Recornized as Safe); các chủng vi sinh vật có nguồn gốc phân lập từ người và động vật hoặc từ thực phẩm lên men đã được xếp vào nhóm vi sinh vật an toàn; là nhóm vi sinh vật được lưu trữ trong bộ sưu tập vi sinh vật của tổ chức khoa học có thẩm quyền, có tên khoa học, nguồn gốc và kết quả nghiên cứu đảm bảo an toàn sinh học [1]

Theo FAO/WHO, chỉ tiêu an toàn quan trọng cần được đánh giá là khả năng tan máu Khả năng tan máu được coi là điều kiện an toàn tiên quyết cho việc lựa chọn chủng vi khuẩn probiotic bởi đây là một yếu tố độc lực được biết đến trong các vi sinh vật truyền bệnh Năm 2007, Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu lần đầu tiên giới thiệu tình trạng kháng kháng sinh và mối lo ngại về an toàn liên quan đến vi khuẩn probiotic [48] Gueimonde và cs., báo cáo về sự chuyển gen ngang

từ vi khuẩn có lợi sang vi khuẩn gây bệnh trong ruột của vật chủ Do đó năm 2012, tiêu chí đánh giá tình trạng kháng kháng sinh ở vi khuẩn probiotic đã được đưa vào tiêu chuẩn GRAS của chế phẩm sinh học [49]

1.2.2.1 Nguy cơ gây tan máu ở các chủng probiotics

Theo Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu, việc đánh giá hoạt động tan máu là một tiêu chí quan trọng để lựa chọn một chủng vi khuẩn được phân lập dự định sử dụng trong các sản phẩm thực phẩm, ngay cả khi chúng có trạng thái GRAS hoặc QPS (giả định chất lượng an toàn)

Tan máu là hiện tượng vi khuẩn làm phân hủy các tế bào hồng cầu để giải phóng huyết sắc tố, thường do vi khuẩn gây bệnh gây ra Tan máu gây các bệnh thiếu máu và gây phù nề ở vật chủ [50] Tan máu alpha (α-hemolysis) là do hydro

15

peroxide của vi khuẩn tạo ra, oxy hóa hemoglobin thành methemoglobin và tạo

ra màu xanh lục cho khuẩn lạc Tan máu beta (β-hemolysis) là sự phân giải hoàn toàn các tế bào hồng cầu trong môi trường xung quanh và khuẩn lạc, vùng này có màu sáng hơn (màu vàng) và trong suốt [51]

Baumgartner và cs., (1998) đã chỉ ra hoạt tính tan máu α trên máu cừu ở tất

cả 53 chủng L rhamnosus thử nghiệm bao gồm 17 chủng phân lập từ thực phẩm,

5 chủng phân lập lâm sàng và 31 chủng phân lập từ phân người khỏe mạnh [52] Tương tự, nghiên cứu của Maragkoudakis và cs., (2006) và Pradhan và cs., (2018)

cũng phát hiện kiểu hình α-hemolysis ở các chủng Lactobacillus [53] [54] Hầu

hết các nghiên cứu đã cho biết không có hiện tượng tan máu β trên các chủng

Lactobacillus [55] Tuy nhiên, một nghiên cứu gần đây của Domingos-Lopes và

cs., (2017) đã quan sát thấy kiểu hình β ở hai chủng L paracasei subsp paracasei

(L3B21R1 và L3B21R2) [56] Abushelaibi và cs., (2017) cũng quan sát thấy kiểu hình β-hemolysis ở 2/9 chủng lactic phân lập từ mẫu sữa lạc đà [57] Do đó, các chủng probiotic cần được đánh giá về khả năng tan máu để loại trừ bất kỳ rủi ro liên quan đến sức khỏe con người

1.2.2.2 Sự kháng kháng sinh ở các chủng probiotics

Hiện nay tình trạng kháng thuốc kháng sinh đang là mối lo ngại của cộng đồng và một số tổ chức, như Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Tổ chức Lương thực

và Nông nghiệp (FAO), Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA)

và Cơ quan An toàn Thực phẩm (EFSA) do chúng có thể làm ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng Việc sử dụng kháng sinh ở người (cephalosporin, penicillin phổ rộng và fluoroquinolone) đã tăng 36% từ những năm 2000 đến 2010, chủ yếu là

do việc kê đơn và sử dụng kháng sinh không phù hợp để điều trị bệnh Theo báo cáo toàn cầu về tình trạng kháng thuốc kháng sinh, trong đó chỉ ra hơn 700.000

ca tử vong ở người mỗi năm liên quan đến kháng thuốc kháng sinh, với ước tính tăng thêm 10 triệu ca tử vong mỗi năm tính đến năm 2050 [58]

Kháng sinh là những chất kháng khuẩn được tạo bởi các chủng vi sinh vật

có tác dụng ngăn chặn sự sinh sản của vi sinh vật khác và làm bất hoạt chúng

16

thông qua một số cơ chế như ức chế sự tổng hợp của thành tế bào hoặc màng tế bào chất, ngăn chặn quá trình tổng hợp protein hoặc quá trình sao chép DNA, làm thay đổi quá trình trao đổi chất hoặc tác động trực tiếp chống lại con đường kháng thuốc của vi khuẩn Tình trạng kháng kháng sinh xảy ra khi các vi sinh vật tiếp xúc với các chất kháng sinh và nhờ quá trình thích ứng, một số vi sinh vật có thể tồn tại và phát triển Do đó, kháng sinh trở nên không hiệu quả, các vi sinh vật kháng kháng sinh có thể tồn tại và cơ chế kháng thuốc của chúng có thể được chuyển sang các vi sinh vật khác và trở thành mối đe dọa đối với sức khỏe cộng đồng Sự hiện diện của các vi sinh vật kháng thuốc không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe con người và động vật mà còn làm tăng nguy cơ lây lan, ô nhiễm thực phẩm, cây trồng và vật nuôi [58]

Bảng 1.4: Cơ chế và phương thức kháng kháng sinh [58]

tRNA với ribosome

Amphenicols, lincosamides Macrolidea, ketolides Tổng hợp

17

Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus có lịch sử sử dụng lâu dài và được

công nhận đạt tiêu chuẩn an toàn giả định (GRAS) [20] Tuy nhiên, việc phát hiện

vi sinh vật có khả năng kháng kháng sinh và việc thích ứng với các điều kiện môi trường có thể thúc đẩy vi sinh vật trở thành các nguồn chứa các gen kháng kháng

sinh Đặc biệt, chi Lactobacillus và Bifidobacterium tiềm ẩn nguy cơ rủi ro liên quan

đến sức khoẻ con người, vì chúng mang các gen kháng thuốc bẩm sinh và cư trú nhiều trong thực phẩm cũng như trong hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa của người

và động vật [59]

* Sự kháng kháng sinh ở vi khuẩn Lactobacillus

Lactobacillus thể hiện sự kháng với kháng sinh vancomycin và các kháng sinh

ức chế tổng hợp protein như chloramphenicol, erythromycin, clindamycin và tetracycline [60] Guo và cs., (2017) đã quan sát thấy 85% tỷ lệ kháng vancomycin

ở các chủng Lactobacillus phân lập trong thực phẩm, đặc biệt là ở Lactobacillus

plantarum và Lactobacillus casei [61] Ngoài ra, khả năng kháng tetracycline và

erythromycin đã được phát hiện ở các loài Lactobacillus được phân lập từ men vi

sinh và thực phẩm [58]

Lactobacillus thường nhạy cảm với kháng sinh ức chế sự tổng hợp thành tế

bào như penicillin (ampicillin, oxacillin và piperacillin), chất ức chế β-lactamase và cephalosporin (cephalothin, cefuroxime, ceftriaxone và cefoxitin) Một số nghiên

cứu gần đây đã chỉ ra sự kháng penicillin G xuất hiện ở một số chủng Lactobacillus

rhamnosus, Lactobacillus reuteri và Lactobacillus plantarum [58]

Lactobacillus thường kháng với hầu hết các kháng sinh ức chế tổng hợp axit

nucleic gồm enoxacin, pefloxacin, norfloxacin, axit nalidixic, sulphamethoxazole, trimethoprim, co-trimoxazole và metronidazole Sự đề kháng với các kháng sinh này

được cho là kháng nội tại ở các loài Lactobacillus [62]

Sự kháng tetracycline và erythromycin ở các loài Lactobacillus đã được chỉ

ra trong nhiều nghiên cứu Các gen biểu hiện hai tính kháng này thường nằm trên các yếu tố di truyền di động như plasmid liên hợp và transposon Vì vậy, việc xác định tính kháng tetracycline và erythromycin ở các loài vi sinh vật sử dụng trong thực phẩm sẽ tiềm ẩn nguy cơ lây truyền gen kháng kháng sinh trong thực phẩm

reuteri SD 2112 [65] Các gen erm(A), erm(C), erm(T) và erm(B) thể hiện sự kháng

erythromycin Trong đó, gen erm(B) mã hóa cho enzym rRNA methylase hoạt động trên tiểu đơn vị 23S ribosom, chiếm ưu thế ở chi Lactobacillus [63] Nghiên cứu của Gevers và cs., (2003) cho thấy có sự truyền gen tet(M) từ Lactobacillus kháng tetracycline sang các loài Enterococcus faecalis và Lactococcus lactis nhưng không truyền sang Staphylococcus aureus [66] Ngược lại, nghiên cứu của Guo và cs., (2017) cho thấy gen tet(M) ở Lactobacillus không có khả năng truyền gen [61] Những nghiên cứu này chỉ ra sự kháng tetracycline ở Lactobacillus, do đó cần phải

đánh giá thêm trước khi được lựa chọn làm chủng probiotics

* Sự kháng kháng sinh ở vi khuẩn Bifidobacterium

Bifidobacteria thường nhạy cảm với kháng sinh phổ Gram (+) (như

erythromycin, lincomycin, teicoplanin và vancomycin), kháng sinh phổ rộng (rifampicin và chloramphenicol) và β-lactamase (penicillin, ampicillin, amoxicillin,

piperacillin, ticarcillin và imipenem) Ngược lại, hầu hết các loài Bifidobacteria đều

kháng với kháng sinh metronidazole, kháng sinh phổ Gram (-) (axit fusidic, axit nalidixic và polymyxin B) và aminoglycoside (neomycin, gentamicin, kanamycin

và streptomycin) Đặc biệt bifidobacteria có khả năng kháng mupirocin, một loại

kháng sinh được sử dụng trong môi trường chọn lọc cho chi này [67]

B bifidum và B breve được báo cáo là có khả năng kháng streptomycin Kiểu

hình kháng streptomycin được chứng minh là do đột biến nhiễm sắc thể không phải

do thu nhận các gen kháng kháng sinh Do đó, khả năng kháng streptomycin là do

đột biến trên gen rpsL mã hóa cho protein S12 của ribosom và không có khả năng

di truyền cho các loài khác Ngoài ra, chủng B bifidum nhạy cảm thấp với

erythromycin do đột biến gen đối với RNA ribosome 23S [67]

Sự đề kháng đối với tetracycline ở các chủng Bifidobacteria được đặc biệt chú

ý Gen Tet, mã hóa cho các protein bảo vệ ribosome khỏi tác động của kháng sinh

19

tetracycline Các gen tet(W), tet(M), tet(O), tet(W/32/O) và tet(O/W) đã được phát hiện trong một số loài Bifidobacteria, bao gồm: B animalis subsp lactis, B bifidum,

B breve, B logum, B thermophilum và B pseudocatenulatum Gen tet(W) được

phát hiện với tần suất cao ở các chủng B logum và ở tất cả chủng B animalis đã

nghiên cứu [67]

Gen tet(W) ở Bifidobacteria được tích hợp trong nhiễm sắc thể và các trình

tự xung quanh gen này có thể thay đổi tùy thuộc vào chủng, các gen mã hóa cho các transposase hoặc enzyme xúc tác cho sự di chuyển của các đoạn DNA giữa các vị trí khác nhau thông qua việc nhận biết các trình tự đích đặc biệt Điều này cho thấy, trong các điều kiện thích hợp gen có thể được vận chuyển Kazimierczak và cs.,

(2006) báo cáo gen tet(W) của B longum có thể chuyển sang B adolescentis ở tần

suất thấp (< 2 × 107 tế bào) và trong điều kiện in vitro Kết quả này cho thấy tiềm

năng của vi khuẩn Bifidobacteria trong việc truyền các gen kháng thuốc kháng sinh

cho các vi khuẩn gần gũi về mặt di truyền [67] [68]

Bảng 1.5: Gen kháng kháng sinh của một số loài Lactobacillus và

Lactobacillus

acidophilus

aph(2’’)Ia Aminoglycoside tet(M), erm(B) Tetracycline

aaa(6’)Ie-erythromycin

Lactobacillus

animalis erm(B) Erythromycin

20

Lactobacillus

casei tet(M), erm(B)

Tetracycline, Erythromycin

Bifidobacterium

longum

H66 F5, F8, F10 B36 tet(W) Tetracycline

* Đánh giá sự kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn được sử dụng làm probiotics

Hình 1 2: Sơ đồ đánh giá sự kháng kháng sinh của một chủng vi khuẩn được sử

Được chấp nhận

Kiểm tra sự kháng kháng sinh ở mức độ gen

Kháng kháng sinh có được

Kháng kháng sinh nội tại

Được chấp nhận

Kháng kháng sinh có được

Kháng kháng sinh do

nhận thêm gen

Kháng kháng sinh do đột biến gen

Không được chấp

nhận

Thường được chấp

nhận

21

của chủng vi khuẩn được xác định dựa trên các giá trị: Nồng độ ức chế tối thiểu

(MIC) và giá trị cắt vi sinh (Microbiological cut – off values) Theo EFSA, chủng

vi khuẩn mà nhạy cảm với kháng sinh thì được chấp nhận làm probiotic, giống khởi động Trong trường hợp chủng vi khuẩn kháng với kháng sinh, thì cần phải xem xét tới đặc điểm di truyền của sự kháng đó Nếu chủng vi khuẩn có tính kháng nội tại (đặc điểm vốn có ở tất cả các chủng của một loài, có tính chất ổn định và

di truyền lại cho các thế hệ tế bào nhưng không truyền từ loài này sang loài khác) hoặc do đột biến gen thể hiện khả năng thấp về chuyền ngang vẫn được chấp nhận

để làm probiotic Ngược lại chủng vi khuẩn có tính kháng kháng sinh do thu nhận nguồn gen, đây là nguy cơ nguy hiếm nhất về sự chuyền ngang và không được sử dụng làm probiotic [69]

1.3 Tình hình nghiên cứu probiotic ở nước ngoài và Việt Nam

1.3.1 Tình hình nghiên cứu probiotic ở nước ngoài

Ngày này cùng với sự quan tâm của con người đối với các sản phẩm hỗ trợ tăng cường sức khỏe đã thúc đẩy sự phát triển và kinh doanh các sản phẩm trong lĩnh vực chế phẩm sinh học Tổng thị trường bán lẻ toàn cầu cho tất cả các sản phẩm chế phẩm sinh học ước tính đạt ∼ 45,6 tỷ đô la Mỹ trong năm 2017, với tốc

độ tăng trưởng kép hàng năm được dự đoán là 7% (2017–2022) (MarketsandMarkets, 2017) Phân tích thị trường dự báo rằng thị trường toàn cầu

về men vi sinh tăng từ ∼ 1,71 đô la lên ∼ 3,56 tỷ đô la Mỹ trong giai đoạn 2016 – 2025 [70] và lĩnh vực bổ sung chế phẩm sinh học vào chế độ ăn uống, đứng thứ hai chỉ sau thực phẩm và đồ uống chứa men vi sinh, sẽ tăng từ ∼ 3,3 tỷ USD lên

∼ 7,0 tỷ USD [71]

Hiện nay Mỹ, Châu Âu, Nhật Bản và Úc là những nơi tạo thành phân khúc thực phẩm chứa probiotic lớn nhất Thị trường thực phẩm chứa probiotic toàn cầu được ước tính chiếm khoảng 3% tổng thị trường thực phẩm với Mỹ, EU và Nhật Bản là những quốc gia dẫn đầu Hơn 100 sản phẩm probiotic có sẵn trên thị trường như sữa chua, sữa bột, nước trái cây, sôcôla và các loại men vi sinh [72]

22

Các nghiên cứu đã công bố về vai trò của probiotic có lợi ích cho sức khỏe con người ví dụ như:

Năm 2006, Xiao và cs., nghiên cứu chủng Bifidobacterium longum BB536

được phân lập từ trẻ sơ sinh Chủng BB536 có khả năng sống sót cao trong thực phẩm và có khả năng tiếp cận với đường tiêu hóa cao Các nghiên cứu in vitro, in vivo và lâm sàng cho thấy sự an toàn và lợi ích sức khỏe của chúng đối với các vật chủ khác nhau Chủng BB536 có khả năng hoàn thiện môi trường đường ruột, tăng cường hệ miễn dịch và phòng chống ung thư cũng như bệnh dị ứng [73]

Năm 2007, Liong và cs., nghiên cứu tổng hợp Lactobacillus acidophilus

ATCC 4962, FOS, mannitol và inulin trên động vật có hàm lượng cholesterol trong máu cao với thời gian 8 tuần Kết quả cho thấy nồng độ cholesterol trong máu giảm [74]

Năm 2008, Ohlson và cs., đã nghiên cứu sử dụng các vi khuẩn probiotic

Lactobacillus và Bifidobacteria để sản xuất thực phẩm có tác dụng kiểm soát tăng

cân, ngăn ngừa và điều trị béo phì, giảm tích tụ mỡ, cải thiện chuyển hóa năng lượng và tăng cường độ nhạy insulin [75]

Năm 2008, West và cs., nghiên cứu chủng Lactobacillus paracasei F19 được phân lập từ niêm mạc ruột của người L paracasei F19 có ảnh hưởng tốt

đến hệ vi sinh vật đường ruột và chức năng đường ruột của người trưởng thành khỏe mạnh, trẻ em và người già F19 giúp cho trẻ ăn dặm giảm số ca nhiễm trùng thứ cấp và làm giảm việc điều trị bằng kháng sinh [76]

Năm 2009, Lemieux và cs., nghiên cứu chế phẩm probiotic gồm vi khuẩn

Lactobacillus kefiranofaciens cùng với chất mang thích hợp Chế phẩm này có

tác dụng bảo vệ chống tăng huyết áp, tăng lipid máu, tiểu đường, rối loạn cân nặng, bệnh tim mạch và ung thư ruột kết [77]

Năm 2011, Kajander và Korpela nghiên cứu việc sử dụng men vi sinh trong sản xuất chế phẩm nhằm tăng cường đặc tính trao đổi chất Chế phẩm sinh học được khẳng định là có tác dụng đặc biệt hiệu quả trong việc điều chỉnh giảm mức lysophosphatiydylcholines (LysoPC) và ceramide [78]

23

1.3.2 Tình hình nghiên cứu probiotic ở Việt Nam

Tại Việt Nam các sản phẩm probiotic đang được quan tâm và xuất hiện phổ biến trên thị trường Việt Nam đang đẩy mạnh việc nghiên cứu để sản xuất probiotic phục vụ cho con người

Năm 2013, TS Nguyễn La Anh và cs., đã thực hiện đề tài “Hợp tác nghiên

cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng từ vi khuẩn probiotics’’ Kết quả

đã tuyển chọn được 2 chủng vi khuẩn Bifidobacterium (B animalis và B bifidum)

và 2 chủng vi khuẩn Lactobacillus (L fermentum SBV2 và L casei PK2) phù hợp

để sử dụng làm chế phẩm probiotics Sản phẩm FIRI Probiotics có tác dụng hỗ trợ điều trị và ngăn ngừa suy dinh dưỡng cho trẻ em cũng như các bệnh lý về hệ tiêu hoá Sản phẩm đã được Bộ Y tế, Cục an toàn thực phẩm chứng nhận phù hợp quy định an toàn thực phẩm [79]

Năm 2020, Nguyễn Thanh Bình và cs., nghiên cứu sản xuất sinh khối

probiotic từ vi khuẩn Bifidobacterium để ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm

hỗ trợ sức khỏe Việc chế tạo thành công chức năng bao gói thông minh cho sản phẩm, theo đó phần nước pha và bột probiotics được tách biệt nhờ một bộ phận đựng riêng ngay dưới miệng hộp để đảm bảo sự ổn định của lợi khuẩn Sản phẩm

BIOFIDA chứa lợi khuẩn từ chủng vi khuẩn Bifidobacterium là sản phẩm đầu tiên

sản xuất trong nước với nguồn nguyên liệu hoàn toàn nội địa [80]

Năm 2020, Bùi Thị Việt Hà và cs., nghiên cứu thành công công nghệ sản

xuất chế phẩm probiotic từ một số loài Lactobacillus và Bacillus ứng dụng nhằm

nâng cao sức khỏe sinh sản cho phụ nữ 5 chủng vi sinh vật sử dụng có tiềm năng

làm probiotic là Lactobacillus rhamnosus H1, Lactobacillus reuteri H2, Bacillus

subtilis ANA14, Bacillus clausii ANA37, Bacillus coagulans ANA40 Các sản

phẩm nghiên cứu được gồm viên nang dạng uống, hỗ dịch (nước) đều đạt chất

lượng về độ sống của lợi khuẩn (Lactobacillus tổng số > 2x108 CFU/viên 500mg

và Bacillus tổng số >2x109 CFU/ống 5ml) và được chứng nhận đạt tiêu chuẩn của

Bộ Y tế [81]

Ở Việt Nam hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu chuyên sâu về đặc điểm kháng kháng sinh của vi khuẩn probiotics Do đó cùng với việc nghiên cứu đặc

24 tính probiotics thì nghiên cứu tính an toàn của chúng là cần thiết và cung cấp đầy

đủ thông tin về đặc điểm probiotics

Bảng 2.1: Các chủng vi khuẩn probiotic có nguồn gốc phân lập từ sữa mẹ và

phân trẻ sơ sinh

STT Tên chủng Nguồn gốc

1 Lactobacillus salivarius 1134-3 phân trẻ sơ sinh

2 Lactobacillus salivarius 1387-1 phân trẻ sơ sinh

3 Lactobacillus salivarius 1165-11 phân trẻ sơ sinh

4 Lactobacillus salivarius 1196-2 phân trẻ sơ sinh

5 Lactobacillus salivarius 1568-1 phân trẻ sơ sinh

6 Lactobacillus salivarius 1406-1 phân trẻ sơ sinh

7 Lactobacillus salivarius 1067-1 phân trẻ sơ sinh

8 Lactobacillus s plantarum 1323-1 phân trẻ sơ sinh

9 Lactobacillus plantarum lbp phân trẻ sơ sinh

10 Lactobacillus rhamnosus SH021 phân trẻ sơ sinh

11 Lactobacillus rhamnosus SH026 sữa mẹ

12 Lactobacillus rhamnosus SH027 phân trẻ sơ sinh

13 Lactobacillus rhamnosus SH028 phân trẻ sơ sinh

14 Lactobacillus paracasei SH2 sữa mẹ trẻ 6 tháng tuổi

15 Lactobacillus paracasei SH011 phân trẻ sơ sinh

16 Lactobacillus casei SD1 sữa mẹ trẻ 2 tháng tuổi

17 Lactobacillus fermentum 1242-1 phân trẻ sơ sinh

18 Lactobacillus fermentum PK1 phân trẻ sơ sinh

19 Lactobacillus s agilis 1522-1 phân trẻ sơ sinh

20 Lactobacillus agilis 1148-1 phân trẻ sơ sinh

21 Bifidobacterium animalis subsp

Box cấy vô trùng: ESCO, Singapore

Máy PCR C1000 Touch 96 Well: BIO-RAD, Mỹ

Thiết bị điện di: Bluegel, Mỹ

Pipet và một số dụng cụ thủy tinh chuyên dụng cho phòng thí nghiệm cùng một số thiết bị khác

2.1.3 Hóa chất

Hóa chất pha môi trường: peptone, cao nấm men, glucose, tween 80,

CH3COONa, triamoni citrate, K2HPO4.3H2O, MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O: Trung Quốc

Các loại kháng sinh: Erythromycin, Chloramphenicol, Trimethoprim, Rifampicin, Tetracycline, Teicoplanin, Clindamycin, Ciprofloxacin, Gentamicin, Neomycin, Ampicillin, Kanamycin, Vancomycin, Streptomycin: Sigma, Mỹ

Hóa chất tách chiết DNA: Pre-Buffer, Lysozyme, G-Buffer, Binding Buffer, Washing Buffer A, Washing Buffer B, Elution Buffer: Hàn Quốc

Hóa chất PCR: Master mix 2x, Forward Primer, Reward Primer: Hàn Quốc Hóa chất điện di: Marker (Mỹ), Loading buffer 6X (Mỹ), dung dịch đệm TBE 2X: Hàn Quốc

2.1.4 Môi trường và dung dịch đệm

* Môi trường MRS (De Man, Rogosa and Sharpe) là môi trường được dùng

để nuôi cấy, giữ giống của vi sinh vật, thành phần (g/l) gồm:

* Môi trường dịch dạ dày (pepsin 1X)

Pha môi trường dịch dạ dày pH 2.0: Chuẩn bị môi trường đệm glycine - HCl

pH 2.0 bằng cách pha dung dịch với tỷ lệ 25ml Glycine 0,2M và 17ml HCL 0,2M, sau đó đưa về 100ml bằng nước cất vô trùng

Chuẩn bị dung dịch Pepsin 10X: cân 0,3g Pepsin trong 10ml NaCL 0,5%,

lọc qua màng lọc 0,2µl, bảo quản tủ -20oC Pha môi trường dịch dạ dày nhân tạo bằng cách lấy 9ml đệm glycine HCl pH 2.0 với 1ml pepsin

* Môi trường dịch mật

Pha môi trường dịch mật: Chuẩn bị pancreatin 10X bằng cách cân 0,01g

pancreatin (Sigma) trong 1ml nước deion vô trùng Chuẩn bị dung dịch ox bile dried pure 0,3% + NaCl 0,5% bằng cách cân 0,3g ox bile dried pure + 0,5g NaCl định mức trong 100ml nước, sau đó hấp vô trùng tại 121oC/15 phút

* Dung dịch đệm photphate

Thành phần (g/l)

KCl

Na2HPO4NaCl

KH2PO4

pH

: : : : :

0,2 1,44 8,0 0,24 7,0 Dung dịch được hấp vô trùng tại tại 1210C/15 phút

80oC được hoạt hóa sang môi trường MRS lỏng nuôi cấy trong 24 giờ ở nhiệt độ

từ 30-37oC, đối với chủng Bifidobacterium nuôi trong hộp kị khí Sau đó chủng

vi sinh vật được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo [82]

Phương pháp nhân giống: nhân giống nhằm mục đích làm tăng số lượng mật độ vi sinh vật để bổ sung vào môi trường lên men Tùy theo thể tích lên men lớn hay nhỏ mà lựa chọn các cấp nhân giống thích hợp

2.2.2 Xác định mật độ tế bào

Nguyên tắc: các vi sinh vật khi được nuôi cấy trên môi trường rắn thích hợp

sẽ hình thành các khuẩn lạc và có thể quan sát được bằng mắt thường [82]

Cách làm: pha loãng mẫu đến nồng độ cần thiết, hút 0,1 ml mẫu trang cấy

vào đĩa môi trường MRS agar Mỗi nồng độ trang 2 đĩa, nuôi ở nhiệt độ và thời

gian thích hợp tùy từng với chủng, đối với chủng Bifidobacterium nuôi trong hộp

kị khí Số khuẩn lạc được tính là trung bình số khuẩn lạc của 2 đĩa, từ đó tính mật

độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Công thức: N=(M/0,1)*n (CFU/ml)

Trong đó:

N: mật độ tế bào

M: số khuẩn lạc trung bình

n: hệ số pha loãng mẫu

0,1: là thể tích mẫu đem trang cấy

2.2.3 Xác định khả năng tán máu

Nguyên tắc: môi trường thạch máu được dùng để chọn lọc đối với các tác

nhân gây bệnh nhất định bởi bổ sung các kháng sinh, hóa chất hoặc thuốc nhuộm Đây là môi trường làm giàu với mục để phân biệt vi khuẩn dựa trên các đặc tính tan máu (β-hemolysis, α-hemolysis và γ-hemolysis) [83]

29

Phương pháp: vi sinh vật được cấy trên đĩa thạch Columbia chứa 5% (w/v)

máu cừu và ủ trong 48 giờ ở 37°C Hoạt tính tan máu của các chủng vi khuẩn được xác định theo các dấu hiệu tan máu α (xung quanh khuẩn lạc xuất hiện vùng màu xanh lá cây), tan máu β (vùng không màu xung quanh khuẩn lạc) hoặc tan máu γ (không có hiện tượng tan máu trên bề mặt) trên các đĩa thạch máu Columbia

2.2.4 Đánh giá khả năng bám dính của các chủng vi khuẩn probiotic trên màng nhày ruột in vitro

* Phủ màng nhầy ruột lên đĩa vi chuẩn polystyrene 24 giếng [84]

Chất nhầy ruột lợn được xử lý bằng hóa chất và đông khô, bảo quản tại

-200C Chuẩn bị dung dịch chất nhầy nồng độ 1,5mg/ml trong dung dịch HEPES 10mM, pH 7,4 Ly tâm ở chế độ 4000g/5 phút/40C Sau đó lọc vô khuẩn bởi màng lọc 0,2µm, bổ sung 0,6ml vào các giếng trên đĩa vi chuẩn polystyrene 24 giếng Cất đĩa vào tủ lạnh 40C qua đêm

* Chuẩn bị sinh khối vi sinh vật

Lấy mẫu dịch lên men để pha loãng và trang cấy kiểm tra mật độ tế bào Pha loãng trong dung dịch NaCl 0,85% pH 4,5 Ly tâm 30ml dịch lên men ở 8000rpm/10 phút tại 40C Loại bỏ dịch phía trên, bổ sung dung dịch HEPES 10mM pH 7,4, hòa tan sinh khối và ly tâm Lặp lại bước rửa thêm 1 lần rồi hòa lại sinh khối trong dung dịch HEPES 10mM, pH 7,4

Xác định mật độ tế bào trong dịch sinh khối này bằng phương pháp trang cấy

trên môi trường MRS Đối với chủng Bifidobacterium trang cấy trên môi trường

MRS có 0,05% L-cystein, nuôi trong hộp kín có gói kị khí (AnaeroGenTM 3,5ml), nuôi 48h tại 370C

* Đánh giá khả năng bám dính của tế bào vi khuẩn trên màng nhầy

Sau khi đĩa chứa màng nhầy ruột được ủ qua đêm, rửa hai lần bằng dung dịch HEPES 10mM, pH 7,4 Tiếp đó, bổ sung 0,4ml dịch sinh khối vi sinh vật đã được chuẩn bị ở bước trên vào các giếng Mẫu đối chứng là giếng có phủ màng nhầy ruột nhưng không bổ sung vi sinh vật Ủ đĩa tại 370C trong 1h Kết thúc 1h,

30

dùng dung dịch HEPES 10mM, pH 7,4 rửa 2 lần x 0,4ml nhằm loại bỏ các tế bào không bám dính ra ngoài Bổ sung 0,4ml dung dịch HEPES 10mM, pH 7,4 + 0,1% Triton X vào các giếng, cẩn thận dùng đầu típ cọ vào đáy giếng để tách các tế bào bám dính ra ra ống nghiệm vô trùng Bổ sung thêm 0,4ml dung dịch HEPES 10mM pH 7,4 chứa 0,1% Triton X vào giếng để thu được nốt các tế bào bám dính trong giếng ra ngoài Dùng dung dịch NaCl 0,85% pH 6,5 + 0,1% TritonX để pha loãng mẫu Trang cấy trên MRS ở 370C trong 48h để kiểm tra mật độ tế bào bám

dính trên đĩa Đối với chủng Bifidobacterium trang cấy trên môi trường MRS có

0,05% L-cystein, nuôi trong hộp kín có gói kị khí (AnaeroGenTM 3,5ml)

2.2.5 Đánh giá ảnh hưởng của môi trường dạ dày đến khả năng sống sót của

vi khuẩn

Nguyên tắc: Trong dạ dày của con người pH thường thấp (khoảng 2,0 - 3,0)

và chứa nhiều enzyme tiêu hóa như pepsin giúp tiêu hóa protein Do vậy các điều kiện này ảnh hưởng đến hầu hết các nhóm vi sinh vật khi đi vào dạ dày trong đó

có nhóm vi khuẩn lactic [85]

Cách làm: Hoạt hóa chủng cần nghiên cứu Bổ sung giống vi sinh vật nghiên

cứu vào dịch dạ dày nhân tạo để ở 370C trong 120 phút Sau 0 phút, 120 phút trang

cấy để đếm mật độ tế bào Đối với chủng Bifidobacterium trang cấy trên môi

trường MRS có 0,05% L-cystein, nuôi trong hộp kín có gói kị khí (AnaeroGenTM3,5ml) Xác định khả năng sống sót của vi khuẩn bằng giá trị logarithm cơ số 10 của hiệu số mật độ tế bào ở thời điểm 0 phút và 120 phút, được ký hiệu bằng lg(ΔCFU/ml)

Công thức: Δlog(CFU) = Log(CFU No) – Log(CFU N1)

Trong đó:

N1 - là mật độ tế bào tại thời điểm 120 phút

No - là mật độ tế bào tại thời điểm 0 phút