Khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus trong điều kiện phòng thí nghiệm .... từ đất cây trồng lâu năm bị tuyến trùng gây hại, 2
Tính cấp thiết của đề tài
Hồ tiêu (Piper nigrum L.) được xem là “vua của các loại gia vị” và trở thành một trong những sản phẩm nông nghiệp quan trọng nhất của Việt Nam Năm 2015, mặc dù chưa có thống kê đầy đủ, nhưng dự báo diện tích hồ tiêu cả nước đã vượt con số 100.000 ha (Theo số liệu Hiệp Hội hồ tiêu Việt Nam, 2015) Tuy nhiên, cũng như các ngành nông nghiệp khác, ngành hồ tiêu cũng phải đối mặt với các vấn đề về thiệt hại năng suất gây nên do dịch hại Do đó, bảo vệ thực vật là một trong những phần rất quan trọng trong việc nâng cao năng suất hồ tiêu vì dịch hại được xem như nguyên nhân chính làm giảm năng suất và chất lượng hồ tiêu (Trịnh Thị Thu Thủy và ctv, 2012) Bên cạnh các loại bệnh hại, tuyến trùng là dịch hại nguy hiểm trên cây hồ tiêu Theo kết quả điều tra của Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp miền Nam thì tuyến trùng xuất hiện phổ biến ở tất cả các vùng trồng tiêu trong cả nước với mức độ gây hại cao Ngoài gây hại trực tiếp đến sinh trưởng, phát triển của cây trồng, tuyến trùng còn tạo điều kiện cho các loài nấm như Pythium spp, Fusarium spp, Phytopthora spp… xâm nhiễm và gây hại cho cây trồng Việc tìm ra giải pháp để kiếm soát tác nhân tuyến trùng gây hại rất quan trọng Hiện nay, đa số nông dân thường sử dụng các loại thuốc hóa học để phòng trừ Tuy có tác dụng nhanh và hiệu quả nhưng các loại thuốc hóa học lại gây ra tác động xấu đối với môi trường, để lại tồn dư trong nông sản, tăng tính kháng của sâu bệnh làm cho việc phòng trừ trở nên khó khăn hơn Vì vậy, hiện nay, các tác nhân sinh học là một trong những hướng tiềm năng trong việc phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu Trên thế giới hiện nay có rất nhiều nghiên cứu sử dụng tác nhân sinh học để phòng trừ tuyến trùng Đặc biệt, nấm Paecilomyces sp được xem là một trong những loài nấm diệt tuyến trùng hiệu quả cao nhất (Burges H D., 1998; Butt T M và Copping L., 2000) Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về nấm Paecilomyces vẫn còn hạn chế Vì vậy, sinh viên chọn đề tài: “Phân lập và sản xuất nấm Paecilomyces sp để phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp gây hại trên cây hồ tiêu”.
Mục đích nghiên cứu
Phân lập và sản xuất được các chủng Paecilomyces sp trừ tuyến trùng hại hồ tiêu.
Nội dung đề tài
Phân lập các chủng Paecilomyces từ đất trồng cây Jatropha
Định danh bằng phương pháp khoa học hiện đại chủng nấm Paecilomyces sp
Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng nấm Paecilomyces sp thu nhận được
Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm Paecilomyces sp trong điều kiện in vitro
Đánh giá khả năng ký sinh tuyến trùng của nấm Paecilomyces sp phân lập được
Khảo sát ảnh hưởng của các loại thuốc trừ sâu, bệnh đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp
Khảo sát khả năng đối kháng của nấm Trichoderma harzianum đối với chủng nấm Paecilomyces sp phân lập được
Khảo sát môi trường nhân giống và nhân sinh khối đến sự phát triển của nấm
Đáng giá khả năng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp hại hồ tiêu trong điều kiện in vitro và trên đồng ruộng.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiệm của trường từ năm 2014 đến năm 2015.
Thiết bị - hóa chất - vật liệu nghiên cứu
Kính hiển vi quang học
Que đục lỗ thạch 5mm
Mẫu đất được thu thập từ các vườn trồng cây Jatropha bị tuyến trùng gây hại
Rễ cây hồ tiêu bị nhiễm tuyến trùng thu nhận tại vườn tiêu thuộc tỉnh Bình Phước
2.2.2.1 Các môi trường sử dụng
2.1.1.1.1 Môi trường phân lập ban đầu PDA (Potato D - Glucose Agar)
Dịch chiết khoai tây 1000 ml
Cách chuẩn bị dịch chiết khoai tây: Cân 200 g khoai tây đã được gọt vỏ, sau đó thái nhỏ thành hình vuông Đong vào cốc thủy tinh 1 lít nước cất, thêm khoai tây đã thái ở trên vào đun sôi trong 20 phút Để nguội, dùng bông thấm nước lọc phần dịch, gạn bỏ phần xác khoai tây thu được dịch chiết khoai tây Sau đó đem bảo quản lạnh ở 4 o C
2.1.1.1.2 Môi trường thử nghiệm hoạt tính chitinase, protase sử dụng chitin và casein làm cơ chất (Nguyễn Thị Hồng Thương, 2000 -2001)
2.1.1.1.3 Môi trường Sauboraud + Khoáng chất
2.1.1.1.5 Môi trường Malt agar (Nguyễn Đức Lượng, 2006)
Chuẩn bị dịch chiết malt: Lấy 250g malt nghiền nhỏ, hòa vào 1 lít nước cất Dùng đũa thủy tinh khuấy đều và gia nhiệt từ từ, có khuấy, đến 45 – 50 o C, giữ ở nhiệt độ này 30 phút Sau đó, nâng nhiệt độ lên 65 – 68 o C, có khuấy, giữ ở nhiệt độ này cho đến khi quá trình đường hóa xảy ra hoàn toàn (kết quả là không thấy màu xanh xuất hiện khi thử dịch chiết với dung dịch lugol) Lọc tách bã qua vải thô hoặc bông thấm nước, đem hấp phần dịch trong 121 o C, 30 phút, lấy ra để lắng Lọc tách hết tủa lần nữa, pha loãng để dịch có hàm lượng chất khô hòa tan khoảng 6 - 8 độ Brix
Thêm 2% agar vào dịch chiết malt, đun khuấy đều cho đến khi agar tan hết Phối môi trường vào các dụng cụ chứa, hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 o C, 15 phút
2.1.1.1.6 Môi trường thử nghiệm hoạt tính chitinase, protase sử dụng chitin và casein làm cơ chất (Nguyễn Thị Hồng Thương, 2000 - 2001)
Môi trường được hấp khử trùng ở điều kiện 121 o C, 1 atm trong 30 phút
2.1.1.1.7 Môi trường Sabourand + khoáng chất
Môi trường được hấp khử trùng ở điều kiện 121 o C, 1 atm trong 30 phút
2.1.1.1.8 Môi trường cảm ứng sử dụng để nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme chitinase:
Bổ sung dịch vỏ tôm huyền phù 1% đến 1 lít pH: 6 - 7
Môi trường được hấp khử trùng ở điều kiện 121 o C, 1 atm trong 30 phút Chuẩn bị dịch huyền phù chitin 1%: Lấy 5g chitin hòa tan trong 50 ml HCl đậm đặc, khuấy liên tục trong thời gian 3 phút ở 40 o C Sau đó chitin được kết tủa tạo thành huyền phù bằng cách thêm từ từ 500 ml nước lạnh (5 o C) Dịch huyền phù được thu lại bằng cách lọc qua giấy lọc Huyền phù được rửa với nước cất nhiều lần cho đến pH khoảng 7 Sau đó bảo quản lạnh dịch huyền phù
Môi trường được hấp khử trùng ở điều kiện 121 o C, 1 atm trong 30 phút
2.1.1.1.10 Môi trường WA khảo sát khả năng kí sinh tuyến trùng trên đĩa petri
Nước cất 1000 ml Môi trường được hấp khử trùng ở điều kiện 121 o C, 1 atm trong 30 phút
2.1.1.1.11 Môi trường CMB (Complete Media)
NH4NO30,7 g Glucose 10 g Yeast extract 5 g Nước cất 1000ml
2.1.1.1.12 Môi trường SDAY1 (Sabourand dextrose Yeast)
Glucose 40g Pepton 10g Yeast extract 2g Nước cất 1000ml
2.1.1.1.13 Môi trường SDAY3 (Sabourand dextrose Yeast bổ sung khoáng)
Pepton 10g Yeast extract 2g Nước cất 1000ml
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phân lập nấm Paecilomyces sp.bản địa từ đất
Thu mẫu
Mẫu đất để phân lập nấm ký sinh tuyến trùng được thu thập ở các vườn trồng cây Jatropha có biểu hiện bị tuyến trùng gây hại (vàng lá) và không sử dụng bất kỳ một loại thuốc trừ sâu, bệnh nào Thu mẫu đất ở phần gốc cây gần rễ nơi có tuyến trùng Meloidogyne gây hại và đem về phòng thí nghiệm để phân lập.
Phân lập
Cân 10 g đất và cho vào 90 ml cất đã khử trùng, lắc đều mẫu trong khoảng
20 phút Chuẩn bị 3 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nước cất và được đánh số từ 1 đến 4 Dùng micropipette hút 1ml dung dịch đất trong bình tam giác, cho vào ống nghiệm thứ 1, lắc đều Hút 1ml từ dung dịch ở ống nghiệm thứ 1 cho vào ống nghiệm thứ 2, lắc đều Hút 1ml dung dịch ở ống nghiệm thứ 2 cho vào ống nghiệm thứ 3, lắc đều Từ ống nghiệm thứ 3 hút 1ml dung dịch cho vào ống nghiệm thứ 4, lắc đềuvà ủ ở nhiệt độ phũng Sau khi lắc kỹ, dựng micropipet hỳt 100 àl (1/10 ml) dung dịch của các nồng độ pha loãng trên rồi nhỏ vào đĩa petri chứa môi trường (PDA) đã chuẩn bị Dùng que cấy vô trùng trang đều dung dịch trên bề mặt thạch, đậy kín nắp hộp và đánh dấu nồng độ lên nắp Đặt úp nắp hộp xuống dưới để tránh đọng nước Mỗi nồng độ làm 3 đĩa lặp lại
Hình 2.1 Phương pháp pha loãng dung dịch đất
- Kiểm tra đĩa cấy hàng ngày, khi các tản nấm phát triển từ những đĩa cấy, chọn các tản nấm có đặc điểm của nấm Paecilomyces spp thì tiến hành làm thuần
Làm thuần mẫu nấm phân lập được
Sau khi cấy truyền các mẫu nấm có trong mẫu cấy ban đầu, tiến hành làm thuần các mẫu nấm từ các mẫu nấm cấy truyền bằng cách cấy đỉnh sợi nấm sang môi trường dinh dưỡng PDA Dùng que cấy dẹp đã khử trùng, lấy một miếng thạch nhỏ chứa phần đỉnh của sợi nấm cấy sang môi trường PDA Cách chọn đỉnh đầu sợi nấm để làm thuần được tiến hành như hình 3.2
Hình 2.2 Cấy đỉnh sinh trưởng sợi nấm để làm thuần (Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam)
Quan sát hình thái bằng phương pháp phòng ẩm
- Chuẩn bị các đĩa petri có đặt bông gòn thấm, giấy lọc, lame và lamelle đã được hấp khử trùng lên đĩa petri
- Đổ nước cất vô trùng lên giấy lọc để tạo độ ẩm
- Dùng dao mổ vô trùng cắt một miếng thạch hình vuông khoảng 6mm từ đĩa thạch PDA cho lên lame
- Dùng que cấy lấy một ít sinh khối nấm mốc cấy lên miếng thạch, cấy lên cả mặt trên và mặt dưới của miếng thạch
- Dùng que gắp, gắp lame đậy lên bề mặt khối thạch
- Đậy nắp đĩa petri lại và để ở nhiệt độ phòng
- Sau 48h, tiến hành nhuộm bằng thuốc nhuộm lactophenol và quan sát tế bào dưới kính hiển vi quang học
Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái nấm sợi (Agrios, 2005)
Quan sát đại thể nấm sợi
Quan sát hình thái đại thể các chủng nấm bằng việc mô tả đặc điểm tản nấm của chúng khi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng Các chủng nấm phân lập được sẽ được cấy điểm trên tâm đĩa môi trường PDA và được ủ 2 tuần
Quan sát mô tả các đặc điểm: Kích thước tản nấm để biết tốc độ phát triển; dạng sợi nấm; màu sắc tản nấm mặt trước và mặt sau; màu sắc của môi trường do sắc tố nấm sợi tạo ra; thời gian hình thành bào tử…trong thời gian nuôi ủ
Quan sát hình thái vi thể nấm sợi dưới kính hiển vi (phương pháp phòng ẩm)
Quan sát hình thái vi thể các chủng nấm phân lập được bằng phương pháp tiêu bản phòng ẩm
Chuẩn bị một đĩa môi trường PDA và một đĩa petri vô trùng nuôi cấy chứa: mảnh giấy lọc, hai thanh đũa tre đặt trên giấy lọc, lame và lamelle đặt lên trên hai thanh đũa tre
Sử dụng dao mổ vô trùng cắt một khối thạch (1cm x 1cm) từ đĩa môi trường PDA chuyển sang đặt lên lame đã chuẩn bị trong đĩa nuôi cấy Dùng dây cấy đã khử trùng, lấy sinh khối nấm Paecilomyces cấy vào 4 mặt bên của khối thạch
Sau đó đậy lamelle lên trên khối thạch Nhỏ nước cất vô trùng cho ướt toàn bộ giấy thấm trong đĩa Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi sợi nấm mọc đều và hình thành bào tử xảy ra (thường là 2 – 3 ngày)
Mẫu quan sát được chuẩn bị bằng cách lấy lamelle ra khỏi khối thạch đặt lên một lame sạch có sẵn một giọt Cotton blue Quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần và mô tả đặc điểm: Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn; hình dạng cuống bào tử; đặc điểm hình dạng, màu sắc, kích thước bào tử
Chủng nấm sau khi làm thuần được tái nhiễm lại trên tuyến trùng cái và phân lập lại theo quy tắc Koch (Agrios, 2005)
2.5.1 Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của Paecilomyces sp
Các dòng vi nấm có khả năng ký sinh tuyến trùng nhờ hoạt động của các enzyme ngoại bào như: chitinase và protease Do vậy, để đảm bảo chủng nấm
Paecilomyces có khả năng ký sinh với tuyến trùng phải tiến hành định tính hệ enzyme chitinase, protease trên môi trường cảm ứng
2.5.1.1 Xác định hoạt tính enzyme chitinase
Nguyên tắc: Khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung chitin 1% làm chất cảm ứng, nấm sợi sinh enzyme chitinase phân giải chitin thành các dạng có cấu trúc mạch ngắn hơn là N–acetyl– D–glucosamine Các dạng đơn phân này không cho phản ứng màu với thuốc thử Lugol Do đó sau khi nhỏ thuốc thử Lugol, độ lớn của phần môi trường trong suốt bao quanh nấmphản ảnh khả năng sinh tổng hợp chitinase
Thực hiện: Chuẩn bị môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme chitinase, hấp khử trùng ở 121 o C trong 15 phút Dùng các đĩa petri vô trùng đã hấp ở 121 o C trong
15 phút, cho môi trường từ bình vào 2/3 đĩa Dùng khoan thạch có đường kính 5mm ấn nhẹ lên bề mặt nuôi cấy nấm rồi đặt sang giữa đĩa petri chứa môi trường cảm ứng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày Cho thuốc thử Lugol vào, để yên 10 phút rồi sau đó đổ Lugol đi và tráng lại bằng nước cất cho sạch và tiến hành đo đường kính vòng phân giải và đường kính nấm
2.5.1.2 Xác định hoạt tính enzyme protease
Nguyên tắc: Khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung casein 1% , nấm sợi sẽ sinh enzyme protease phân giải casein thành các amino acid Các dạng amino acid được tạo thành sẽ không phản ứng với thuốc thử TCA 5 %, chỉ có casein mới tạo tủa trắng đục với TCA 5 %
Thực hiện: Chuẩn bị môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme protease, hấp khử trùng ở 121 o C trong 15 phút Dùng các đĩa petri vô trùng đã hấp ở 121 o C trong
15 phút, cho môi trường từ bình vào 2/3 đĩa Dùng khoan thạch có đường kính 5mm ấn nhẹ lên bề mặt nuôi cấy nấm rồi đặt sang giữa đĩa petri chứa môi trường cảm ứng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày Cho thuốc thử TCA 5 % vào, để yên 10 phút rồi sau đó đổ thuốc thử đi và tráng lại bằng nước cất cho sạch và tiến hành đo đường kính vòng phân giải và đường kính nấm
2.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến sự phát triển của của nấm
2.5.2.1 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp
Nguyên tắc: Tùy thuộc vào pH khác nhau mà sự tăng trưởng của nấm cũng thay đổi Sự thay đổi của pH tức là sự thay đổi của ion H + có trong môi trường sẽ làm thay đổi trạng thái điện tích của thành tế bào, điều này làm ảnh hưởng khả năng thẩm thấu của tế bào vi sinh đối với những ion nhất định; làm thay đổi trạng thái điện ly các phân tử của chất dinh dưỡng, từ đó làm giảm khả năng sử dụng dinh dưỡng của vi sinh vật Bên cạnh đó, pH ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme có mặt trên thành tế bào Điều này, quyết định đến sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường.Tiến hành khảo sát ở các pH: 5, 6, 7, 8 công thức cụ thể như sau:
Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên
Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường PDA Mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa