Luận văn thạc sĩ khoa học: Phân lập và đánh giá khả năng phân giải carbazole của vi khuẩn trong đất nhiễm dioxin tại sân bay Biên Hòa

Xử lý sinh học khu vực ô nhiễm có chứa carbazole bằng hệ vi sinh vật là một trong những phương pháp được quan tâm nghiên cứu những năm gần đây bên cạnhcác phương pháp xử lý nhiệt, phân h

ĐẠI HỌC QUOC GIA HÀ NOI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Thị Huệ

PHAN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHAN GIẢI CARBAZOLE

CUA VI KHUAN TRONG DAT NHIÊM DIOXIN

TAI SAN BAY BIEN HOA

LUAN VAN THAC SI KHOA HOC

Hà Nội - 2023

ĐẠI HỌC QUOC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Thị Huệ

PHAN LAP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NANG PHAN GIẢI CARBAZOLE

CUA VI KHUAN TRONG DAT NHIÊM DIOXIN

TAI SAN BAY BIEN HOA

Chuyén nganh: Cong nghé sinh hoc

Mã số: 8420201.22

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYÊN HỎNG MINH

TS NGUYÊN KIM NỮ THẢO

Hà Nội - 2023

LOI CAM ON

Dé thực hiện và hoàn thành luận văn tot nghiệp này, lời dau tiên em xin gửilời cảm ơn chân thành nhất đến TS Nguyễn Hong Minh, Trung tâm Nghiên cứunguồn gen, Đại học Phenikaa, là người trực tiếp hướng dẫn, hỗ trợ, quan tâm vàtạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề

tài.

Em xin gửi lời cảm ơn đến TS Ngô Thị Thúy Hường, phòng Độc học Sinh

thái, Đại học Phenikaa va TS Nguyễn Quốc Định, Phòng Hop tác Đối ngoại, Dai

học Phenikaa đã cung cấp mẫu đất nhiễm dioxin cho nghiên cứu này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Kim Nữ Thảo — bộ môn Sinh

học Tế bào, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã giúp đỡ và chỉ

bảo để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các anh chị và các bạn sinh viên tạiTrung tâm Nghiên cứu Nguôn gen, Đại học Phenikaa đã giúp đỡ và tao mọi diéukiện về trang thiết bi, cơ sở vật chất va nguyên vật liệu cho em thực hiện khóa luận

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn tới các giảng viên trong khoa Sinh học,trường Đại học Khoa học Tự Nhiên đã trang bị cho em những kiến thức quý báutrong qua trình học tập tại trường.

Cuối cùng, em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè, nhữngngười đã luôn ung hộ, dong hành, động viên và giúp đỡ dé em có thể tập trung

nghiên cứu và vượt qua khó khăn trong quá trình học tập và hoàn thành dé tài

Hà Nội, ngày 28 tháng 2 năm 2023

Học viên Phạm Thị Huệ

MỤC LỤC

ÿ/(9E.100115 |

\/I099)5198)16)20)9681905002255 3

1.1 _ Tổng quan về carbazOle - - ¿2 +s+k£EE£EEEEEEE121121121111111211 21121 1e 4

1.1.1 Đặc điểm hóa lý và cấu trúc phân tử -¿ -¿-s2sz+cxzzxzzxee 4

1.1.2 Ung dụng của carbazOÌe +: 5c 22St2EE2EEEEE2E12E121171211211Excre 5

1.1.3 Độc tính của carbaZole - 2 1111122231111 1199951111 ng xe rrc 6 1.2 Cac con đường phân hủy carbaZOÌe - c- 5 + St *+ vs sisrrrerresek 7

1.2.1 Xử lý carbazole bằng phương pháp vật lý và hóa học - 71.2.2 Xử lý carbazole bằng biện pháp sinh học -2 -¿©22cs+cx+zs+ 8

1.3 Vi khuân phân giải carbazole cccccscsscessessesseessessessesssessessessessessesseeseessen 10

1.3.1 Quá trình phân hủy carbazole của vi sinh vật hiếu khí 101.3.2 Da dang vi khuẩn phân giải carbazole 2-2 2+5++sccxccxeẻ 121.3.3 Da dang gen chức năng tham gia phân giải carbazole ở vi khuẩn 13

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý sinh học hợp chất thơm của vi

)(98980)/68)I6)200515905000053 20CHƯƠNG 2 ~ VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 _ Vật liệu nghiên CỨU - 2c 2c 12111211111 1118111 118111111011 111g rệt 21

2.1.1 Đối tượng nghiên CHU cece csceesssessssseessesssesssesseessecsscssecssecseessecsseeses 21

2.1.2 Môi trường nuôi CAY oes ecceescessecseessessecsesssessessessesssessessessessseaees 21

2.1.3 Hóa chất và thiết Di eecceeecsseeessseeessseeessneeessneeessneessnneeeseneesens 222.2 Phuong pháp nghiên CỨU -.- c2 1332318351 1331 1395118111111 1xx 22

2.2.1 Làm giàu hệ vi sinh vật đất có khả năng phân giải carbazole 222.2.2 Đánh giá khả năng phân giải carbazole của hệ vi sinh vật 232.2.3 Đánh giá ảnh hưởng của D-glucose đến tốc độ phân giải carbazole 232.2.4 Phương pháp xác định nồng độ carbazole 2: 5z +5e+ss2 s2 232.2.5 Các phương pháp phân lập vi khuẩn phân giải carbazole 24

2.2.6 Thử nghiệm sinh hóa vi khuân -:-2¿©2¿2x+2z++2z++zxzrxeze 25

2.2.7 Các phương pháp tách chiết DNA và kiểm tra sản phẩm tách 26

2.2.8 Phương pháp phân tích trình tự 16S rDNA và dựng cây phân loại 27 2.2.9 Phương pháp phân tích MetagenomIc -.- -+ s+++sx+sx+esxsss 27

2.2.10 _ Phương pháp phân tích trình tự Whole Genome - - 27

CHƯƠNG 3 — KET QUA VÀ THẢO LUẬN - 5: St EEEeEEkerkrkerkerers 293.1 Hệ vi sinh vật phân giải carbazole làm giàu từ đất nhiễm dioxin 293.2 Khả năng phân giải carbazole của hệ vi sinh vật BIHC4-ER7 - 31

3.2.1 Đặc điểm của hệ vi sinh vật BiHC4-ER7 qua các thế hệ làm giàu 3 l3.2.2 Hệ vi sinh vật BiHC4-ER7 phân giải carbazole trong các điều kiện

dinh dưỡng khác nhau .- - 5 22 321133111331 E5E11E1EEkrrrs 323.2.3 Thành phần phân loại hệ vi sinh vật BIHC4-ER7 - - 353.3 Loài vi khuan mới Dyella sp BiH032 phân giải carbazole 37

3.3.1 Phân lập vi khuân BiH032 từ cụm hai vi khuẩn phân giải carbazole373.3.2 Định danh bang sinh học phân tử -2- 2 2222 +2 +xzxezxerxee 383.3.3 Đặc điểm sinh trưởng của Dyella sp BiH032 -5- 393.4 Loài vi khuẩn mới Mycolicibacterium sp BiH015 phân giải carbazole 40

3.4.1 Phân lập chủng BIH015 phân giải carbazole - «++ 403.4.2 Định danh chủng vi khuẩn phân giải carbazole BïiH015 41

3.4.2.1 Định danh bang sinh học phân tt esseesessessesseesesseeseeees 413.4.2.2 Đặc hình thái và sinh hoa eeceeescesceceeeeseeeeeeeeeteeeneeeneaees 41 3.4.3 Hiệu quả phân giải carbazole của Mycolicibacterium sp BIH015 43

3.4.4 Whole Genome của chủng vi khuẩn Ä⁄ycolicicbacterium sp BìH015

— 5 463.4.4.1 Phân tích tong quan bộ gen -:- +52 ++E++EtzEeEEerxerxerxersses 46

3.4.4.2 Thành phan gen tham gia chuyên hóa hợp chất hydrocarbon gây 6

MEM ooo eee 48

3.4.4.3 Phân tích thành phan gen chức năng liên quan đến con đường

chuyền hóa carbazole - 22 2 s+2E+£E++E++EESEEeEEzExrrxerreee 52

0007.501 55

KIÊN NGHỊ - S51 SE EEEEEEE121121111111111 1111111111111 1111 11 11c 56

CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIEN QUAN DEN DE TÀI - - 5-5552 57TÀI LIEU THAM KHẢO - 2-52 St SE SE ÉEEEEEEE2E12111111111111171121111111e 111 cryu 58Isi0006 0 65

DANH MỤC HÌNH

Chương 1Hình 1.1 Cấu trúc phân tử (A) — carbazole; (B) — dẫn xuất halogen của carbazole,

X: Cl, Br hoặc I với 1 < n+m < 8 vả (C) — dioxin [39] - - 555cc +<<<+xsecserss 5

Hình 1.2 Chuỗi truyền điện tử bắt đầu con đường chuyên hóa carbazole và cácprotein liên quan cua chủng Pseudomonas resinovorans CA10 [10] 14 Hình 1.3 Con đường chuyên hóa carbazole của vi khuân Gram âm P resinovoransCA10 va vi khuẩn Gram dương N aromativorans 1C177 [26] -. -s¿ 14Hình 1.4 Hệ dioxygenase chuyển hóa dioxin của chủng Sphingomonas wittichii

; 20 15

Chương 3

Hình 3.1 Kết quả làm giàu 7 hệ vi sinh vật phân giải carbazole (1) BiHC4-ER7, (2)

BIHCS-ER7, (3) BiHT3-ER7, (4) BiHT6-ER7, (5) BiHD1-ER7, (6) BiHD2-ER7 và

(7) BIH D3 -ER7 2 30Hình 3.2 Bảy hệ vi sinh vat ER7 phân giải carbazole sau 48h nuôi cấy ở 30°C 31Hình 3.3 Hệ vi sinh vật BIHC4-ER7 qua bảy thế hệ làm giàu - 32Hình 3.4 (A) Ti lệ phân giải carbazole tổng số của hệ vi sinh vật BiHC4-ER7 và

ER7-TSB trong môi trường M63-Car ở 30°C với điều kiện lắc 200 rpm; (B) Hình

ảnh môi trường nuôi cay của hệ vi sinh vat ER7-M63 tại 0; 72 và 144 giờ 33Hình 3.5 Vi sinh vật tong số trong mau BiHC4-ER7 va ER7-TSB khi cấy trải trênmôi trường M63-Car ủ ở 30°C trong 7 ngày ác ng HH re 34Hình 3.6 Ti lệ phân giải carbazole tổng số của hệ vi sinh vật BiHC4-ER7 trongmôi trường M63-Car và môi trường M63-Car có bổ sung 0,25; 0,5 và 5 g/L D-

Hình 3.7 Thành phan phân loại đến họ của vi khuẩn trong mẫu BiHC4-ER7 37Hình 3.8 Cây phân loại dựa trên trình tự 16S rDNA của chủng Dyella sp BIH032

Hình 3.9 Khuan lạc Dyella sp BiH032 trên môi trường (A) M63-Car và (B)

TSB-Car ở 30°C sau 30 ngày c1 HH TH KH HH HH 39

Hình 3.10 Cây phân loại của chủng vi khuân BiH015 phân giải carbazole dựa trên

trình tự 16S rDÌNA -LL 1111 1112301111119 11K kg kg 1k2 41

Hình 3.11 Khuan lạc chủng BIH015 trên môi trường (A) M63-Car, (B) NA-Car va

(C) TSA-Car ở 30°C sau 30 ngày và (C) tế bào BiH015 dưới kính hiển vi điện tử

quét 6 dd phong dai 107007 ố.ốẽa 42 Hình 3.12 Kha năng phân giải carbazole cua chủng Mycolicibacterium sp BiHO15

trên môi trường M63-Car sau 96h nuôi cấy -:-+©sz+2++2x+2x++zxz+zxezzxeze 44

Hình 3.13 (A) - Khả năng phân giải carbazole của chủng BIH015 trên môi trườngM63-Car có đồng thời nguồn D-glucose các nồng độ khác nhau (0; 1; 2; 5 g/L) và(B) - Đặc điểm môi trường sau 72h nuôi cấy BiH015 ở mỗi nồng độ glucose tương

Hình 3.14 Chung Mycocilibacterium sp BìH015 phân giải carbazole ở các điềukiện nhiệt độ 20, 25, 30, 35°C sau 48h nuôi cay trên môi trường M63-Car 46Hình 3.15 Tỷ lệ thành phan whole genome của chủng Mycolicibacterium sp.BiH015 được xây dung bang công cụ SEED VieWe 2: sc5s+cz+cczxerxerxee 48

Hình 3.16 Sơ đồ dự đoán con đường chuyên hóa carbazole của chủng BiH015 dựa

trên whole genome và các chu trình chuyển hóa tham chiếu . - 54

DANH MỤC BANG

Chương 2Bảng 2.1 Các mẫu đất nhiễm Dioxin được thu thập sử dụng cho phân lập vi hệ vi

sinh vật phân giải carbaZỌ€ 2c 222 11211161131 111118111111 1181111111111 11 111g rrvet 21

Chương 3

Bảng 3.1 Ký hiệu các mẫu VSV được sử dung trong nghiên cứu 29

Bang 3.2 Một số gen mã hĩa protein tham gia chuyển hĩa hydrocarbon thơm và

Kim 1081 NANG eee eee 41 39Bang 3.3 Thành phan bộ gen các chủng Mycolicibacterivm ecccccccsscsssesssesssessvessses 47Bảng 3.4 Độ tương đồng giữa 5 lồi Mycolicibacterium cĩ quan hệ gần gũi với

1000580515001 48

Bang 3.5 Các gen mã hĩa protein chức năng liên quan đến chuyển hĩa carbazole

và các hợp chất thơm khác trong bộ gen của chủng Mycolicibacterium sp BiH015

DANH MỤC CHỮ VIET TAT

TCA Tricarboxylic acid cycle - chu trinh axit tricarboxylic

dw Dry weigth — khối lượng khô

AhR Aryl Hydrocarbon Receptor

dDDH Digital DNA-DNA hybridization

ANI Average Nucleotide Identity

tRNA Transfer ribonucleic acid

rRNA Ribosomal ribonucleic acid

MỞ ĐÀU

Carbazole, một loại hydrocarbon dị vòng nito, được biết đến là chất gay 6nhiễm môi trường và gây độc sinh thái Carbazole có cả đặc điểm hóa học cáchydrocarbon thom đa vòng (Polycyclic aromatic hydrocarbons) cấu tao từ nhiềuvòng benzene hợp nhất (như pyrene, phenanthrene va anthracene) và các hợp chat

dị vòng Thêm vào đó, nguyên tử N giàu điện tử giúp carbazole dễ dàng tham gia

các phản ứng thế tạo thành các dẫn xuất đa halogen có cấu trúc phân tử và độc tính

tương tự dioxin Đặc tính khó phân hủy, ưa béo và ki nước giúp hợp chat này có khanăng liên kết linh hoạt với đất sét và chất mùn dẫn đến tồn lưu lâu dài trong đất,nước và trầm tích Do đó, việc loại bỏ carbazole và các hợp chất tương tự carbazole

được quan tâm trong xử ly môi trường.

Xử lý sinh học khu vực ô nhiễm có chứa carbazole bằng hệ vi sinh vật là một

trong những phương pháp được quan tâm nghiên cứu những năm gần đây bên cạnhcác phương pháp xử lý nhiệt, phân hủy quang học và oxi hóa hóa học tốn kém vàgiới hạn về quy mô Vi sinh vật với khả năng chuyên hóa carbazole thành các hợp

chất không độc hoặc ít độc hơn đã được ghi nhận trong nhiều báo cáo Vi sinh vật

phá vỡ cau trúc carbazole thông qua quá trình oxy hóa bên và oxy hóa góc nhờ hoạt

động của các enzyme như dioxygenase xúc tác phản ứng hydroxyl hóa carbazole

thành 3-hydroxycarbazole Quá trình phân hủy carbazole là quá trình phức tạp cần

sự tham gia của nhiều enzyme của nhiều vi sinh vật khác nhau Do đó, trong cácbáo cáo gần đây, các nhà khoa học kết hợp các chủng đơn lẻ nhằm tăng hiệu quả xử

ly carbazole Đồng thời, việc làm giàu hệ vi sinh vật tại vi tri 6 nhiễm được cũngđược quan tâm nghiên cứu nhằm chọn lọc những hệ vi sinh vật vừa có hiệu quaphân hủy carbazole và các hợp chất tương tự, vừa có khả năng thích nghi cao vớiđiều kiện bản địa

Trong chiến tranh Việt Nam, quân đội Mỹ đã tập kết và làm rò rỉ dioxin tạimột số sân bay quân sự ở miền Trung và miền Nam Theo thời gian, các sân baynày trở thành nguồn làm giàu tự nhiên cho các nhóm vi sinh vật có khả năng phangiải dioxin và các hợp chất vòng thơm tương tự dioxin, ví dụ như carbazole Do đó

chúng tôi thực hiện đề tài “Phân lập và đánh giá khả năng phân giải carbazole của

vi khuẩn trong đất nhiễm dioxin tại sân bay Biên Hòa” nhằm nghiên cứu hệ vi sinhvật phân giải carbazole hiệu quả và ôn định được làm giàu từ mẫu đất nhiễm dioxin

tự nhiên Từ đó tiến hành phân lập và đánh giá chủng vi khuẩn có khả năng khoánghóa carbazole làm nguồn carbon và năng lượng sinh trưởng trong hệ Hiệu quả phângiải carbazole theo thời gian trên môi trường tối thiểu của hệ vi sinh vật làm giàu và

chủng vi khuẩn đơn cũng được khảo sát ở quy mô phòng thí nghiệm

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu nhằm thực hiện các mục tiêu cụ thé sau:

1 Làm giàu bảy hệ vi sinh vat có kha năng phân giải carbazole ôn định từ bảy

mẫu đất nhiễm dioxin nặng tại sân bay Biên Hòa

2 Phân lập chủng vi khuẩn đơn, thuần khiết về mặt di truyền có kha năng phân

giải tốt carbazole

Chương 1 - TONG QUAN VAN ĐÈ NGHIÊN CỨU

1.1 Tổng quan về carbazole

1.1.1 Đặc điểm hóa lý và cấu trúc phân tử

Đặc tính hóa lÿ

Carbazole (Ci2H»N, dibenzopyrrole diphenylenimine, CAS No 86-74-8) là

một loại hydrocarbon thơm đa vòng (Polycyclic aromatic hydrocarbons — PAHs) di vòng nito [26] Carbazole có trọng lượng phân tử là 167,21 g/mol, nhiệt độ sôi là

355°C và nóng chảy ở 246°C Carbazole giàu điện tử với độ phân cực cao và có khả năng tan trong nước (1.2 mg/L ở 25°C) [26] Do đó carbazole khó phân hủy và tăng

tính di động so với các hydrocacbon thơm đa vòng tương đồng

Cấu trúc phân tử

Phân tử carbazole được cấu tạo từ hai vòng benzen hợp nhất hai bên của lõipyrrole (Hình 1.1A) Pyrrole của phân tử carbazole là một vòng năm cạnh trong đó

di nguyên tử N có ít nhất một cặp electron lớp vỏ hóa trị không liên kết Lai hóa

nguyên tử nito hình thành trạng thái sp”, tạo ra một quỹ đạo p được cố định bởi một

cặp electron và được định hướng song song với các quỹ đạo p của carbon tạo thành

một vòng phang Sáu electron chiếm hệ thống z Bốn trong số sáu electron là từ hailiên kết đôi và hai từ nguyên tử N Do đó, năm nguyên tử lai hóa sp? này tạo thành

đám mây a được cố định bởi sáu electron Cấu hình không gian của carbazole chứatong cộng 24 liên kết, trong đó bao gồm 15 liên kết không phải liên kết H, 15 liên

kết thơm, 15 liên kết đôi, 2 vòng 6 cạnh, 2 vòng 9 cạnh va | vòng 5 cạnh Tất cả tạothành một cấu trúc phẳng, giàu điện tử, không phân cực va rất linh hoạt Do đó,carbazole được coi là một trong những hop chất mô hình dé nghiên cứu các hợpchất thơm và tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học và quang điện [26]

Cau trúc tương đồng dioxin

Polyhalogenated carbazoles (PHCZs), tạm dịch carbazole da halogen hóa, là

nhóm các hợp chất hóa học có khung cấu trúc của carbazole và phức hợp thay thế

nguyên tử halogen, bao gồm clo, brom, iốt hoặc sự kết hợp của chúng (Hình 1.1B)

[26, 33, 41].

Cấu trúc carbazole, PHCZs va dioxin có nhiều điểm tương đồng [39] Hai nhómnhất này đều có cấu trúc phẳng ổn định được hợp nhất bởi hai vòng benzen và một

Hình 1.1 Cau trúc phân tử (A) — carbazole; (B) — dẫn xuất halogen của

carbazole, X: Cl, Br hoặc I với 1 < n+m < 8 và (C) — dioxin [39].

1.1.2 Ứng dụng của carbazole

Vai trò của carbazole trong công nghiệp: Carbazole là vật liệu quang điện tử,

polyme dẫn điện và thuốc nhuộm tổng hợp [26] Carbazole và các hợp chất liênquan đến carbazole được sử dụng làm vật liệu huỳnh quang, vật liệu lân quang vàvật liệu huỳnh quang chậm kích hoạt nhiệt Một số thuốc nhuộm được tổng hợp từcarbazole như là hydron blueTM, naphtholTM, antraquinone, styryl và dioxazine.Carbazole cũng được sử dụng dé tổng hợp monome, N-vinylcarbazole, có thé đượctrùng hợp để tạo thành polyvinyl carbazole Chất tong hợp có nguồn gốc carbazole1,3,6,8-tetranitro-carbazole (NitrosanTM) được sử dụng làm thuốc trừ sâu Carbazolekết hợp với phenol, formaldehyde và chất xúc tác axit tạo thành Novalacs Polymechịu nhiệt được sản xuất bằng cách xử lý novalacs với hexamethylenetetramine

Ứng dụng trong dược pham: Carbazole và các hợp chất có nguồn gốc từ

carbazole đã được chứng minh có nhiều hoạt tính y sinh khác nhau, bao gồm: chống

khối u, chống vi khuẩn, chống nắm, chống động kinh, chống tiêu đường, chống oxyhóa, chống viêm, bảo vệ thần kinh và tác dụng chống co giật [26] Với cấu trúc đị

vòng thơm giàu điện tử, carbazole có chức năng hóa học của cả nhóm hydroxyl (cau

trúc chính), quinine và các nhóm prenyl Do đó carbazole được sử dụng làm nguyên

liệu ban đầu dé phát triển các loại thuốc mới Đồng thời các hợp chất có nguồn gốc

từ carbazole là chất trung gian trong quá trình tổng hợp một số phân tử tiên tiến.Nhiều loại thuốc dựa trên carbazole đang được lưu hành trên thị trường bao gồm

carvedilol, carprofen, carazostatin, ellipticine, ollivacine, datelliptium, alectinib,celiptium va nhiéu loai khac.

1.1.3 Độc tinh của carbazole

Theo Uy ban Châu Au (European Commission), carbazole được coi là chất

độc hai vì có khả năng tồn tai dai dang, tích lũy sinh học va gây độc tế bao [16]

Tác động với môi trường

Trong công nghiệp, các hợp chất thơm di vòng nito là một trong những loạichất gây ô nhiễm môi trường quan trọng nhất Carbazole và các dẫn xuất của nó là

các hợp chất nitơ phổ biến được tìm thấy trong đất, nước, không khí bi ô nhiễm bởi

nhựa than đá, dầu thô va creosote từ các ngành công nghiệp hóa dau và luyện cốc

Khi các hợp chất nitơ này bị đốt cháy, oxit nitơ được giải phóng vào khí quyền, gây

ra mưa axit, ô nhiễm không khí và suy giảm tầng ozon [14] Trong một nghiên cứuđược thực hiện ở Trung Quốc, carbazole được định lượng trong 6 mẫu đất bề mặt từ

các khu vực ngoại thành và 20 mẫu bụi từ các con đường trải nhựa [27] Lượng

carbazole trung bình là 7,5 ng/g khối lượng khô (dry weight — dw) trong đất và 235

ng/g dw trong bụi đường Điều này cho thấy ảnh hưởng của hoạt động con người

trong việc phát thải carbazole.

Carbazole tồn lưu lâu dài trong môi trường Carbazole được tìm thấy có niênđại khoảng 50 năm khi phân tích tram tích sông Lippe (Đức) [4] Nồng độ carbazoleđịnh lượng được trong tram tích từ 11 - 172 ng/g dw và 7 - 147 ng/g dw đối với dan

xuất benzocarbazole Một dẫn xuất carbazole khác,

1,3,6,8-tetrabromo-9H-carbazole, phát hiện trong trầm tích hồ Michigan được tích lũy ít nhất 84 năm [4].Trong các báo cáo khác, mức độ carbazole trong trầm tích biển và nước ngọt ở HyLap, Canada, Trung Quốc và Đức từ 0.3 — 312 ng/g dw [26-29] Trong lớp humic

và đất rừng (Đức), carbazole được phát hiện 0.6 - 268 ng/g dw [26]

Độc tính đối với sinh vật

Carbazole và carbazole đa halogen hóa được ghi nhận có có ảnh hưởng tiêu

cực đên nhiêu sinh vật khác nhau Sverdrup và cộng sự cho thây độc tính cao của carbazole đôi với cỏ ba lá đỏ Trifolium pretense, lùa mach Lolium perenne, và mù

tat Sinepsis alba [15] Trong nghiên cứu mới đây, nồng độ carbazole và PHCZs

được khảo sát trong 70 loại sinh vật biển Hoa Đông, Trung Quốc (East China Sea)

[14] TEQ của PHCZs trong các sinh vật này nằm trong khoảng 0,78-36 pg TEQ/g

lw Báo cáo cho thấy sự tích lũy của các hợp chất này trong lưới thức ăn của động

vật phù du-tôm-cá Trong một tiếp cận khác, sự tích lũy sinh học của carbazole và

11 PHCZs từ đất đến giun đất đã được chứng minh [43]

Carbazole được báo cáo là tác nhân gây đột biến và ung thư [16-18].Carbazole gây đột biến gen trội gây chết và hình thành đầu tinh trùng bất thường

trong tế bào mầm đực của chuột [17] Một thử nghiệm gây độc phôi trên cá ngựa

văn, carbazole cho thấy khả năng gây độc cho phôi rất cao với giá trị LC50 là 1,07

mg/l chỉ thấp hon acridine (0,7 mg/L) [3]

Độc tinh tương tự Dioxin

Độc tính tương tự 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxm (TCDD) củacarbazole và PHCZs được chứng minh dựa trên các dấu ấn sinh học trong nghiên

cứu của Chenyang J¡ và cộng sự [20] Kết quả các thử nghiệm sinh học cho thấy

hầu hết PHCZs được thử nghiệm có thể gây ra hiệu ứng chủ vận AhR giống như

dioxin, thay đổi mức độ biểu hiện của các gen hạ nguồn AhR và tương tác với AhR

theo TCDD [20].

Nhóm nghiên cứu của Mumbo cũng chứng minh độc tinh dai dang tương tựdioxin của carbazole và 3 loại clorocarbazole trong đất [35] Trong đó 3,6-

dibromocarbazole và 3-chlorocarbazole gây ra hoạt động mạnh mẽ của

ethoxyresorufin- O -deethylase trong xét nghiệm sinh học dòng tế bào u gan chuộtH4IIA [32] Nghiên cứu của Zhongkun Du và cộng sự cung cấp bằng chứng chothay PHCZs gây ra độc tính phát triển tim và thay đổi hành vi của cá ngựa van [3]

1.2 Các con đường phân hủy carbazole

1.2.1 Xử lý carbazole bằng phương pháp vật lý và hóa học

Carbazole được xử lý bằng phương pháp lắng đọng và quang phân [4]

Carbazole có áp suất hơi 10'* Pa, do đó hợp chat này có thé tồn tại trong khí quyêndưới dạng hơi và dạng hạt Sự phân chia trạng thái vật lý khí-hạt gây khó khăn khi

xử lý carbazole bằng lắng đọng khô (dry deposition) và lắng đọng ướt (wet

deposition) [7] Quang hóa có thé phân hủy hiệu quả carbazole ở pha hơi thông qua

việc hình thành gốc hydroxyl [9] Tuy nhiên biện pháp này không hiệu quả đối với

carbazole dạng hạt Trong môi trường đất, quang phân bị cản trở bởi sự hấp phụ

carbazole vào trầm tích Carbazole không bay hơi trong môi trường nước do đókhông thê sử dụng các biện pháp xử lý hơi

Carbazole có thể bị loại bỏ bằng xúc tác quang CuAlOa cố định trên

composite ZSM-12&35 được sử dụng làm chất xúc tác quang dé loại bỏ carbazole

với acetone là dung môi phan ứng [40] Sự phân hủy carbazole diễn ra song song

cùng sự hình thành tại chỗ các hợp chất oxy hóa nhiên liệu điển hình bằng ngưng tụ

aldol Quá trình sono-Fenton sử dụng siêu âm 40 hoặc 80 W ở tan số 40 KHz cũngcho thấy hiệu quả phân hủy carbazole trong nước thải [21] Carbazole có thé bị loại

bỏ bằng oxy hóa hóa học băng cách kết hợp xử lý ozon và công nghệ siêu âm [39].Quá trình ozon hóa carbazole được tăng cường bằng siêu âm hòa tan trong dung

Động vật ruột khoang

Xử lý sinh học ô nhiễm đất do PAHs, bao gồm carbazole, được hỗ trợ nhờhoạt động của động vật ruột khoang trong đất [42] Hoạt động phân hủy hợp chất

thơm có thê bị cản trở khi các lỗ đất (soil pores) có đường kính nhỏ hơn 20 nm.

Trong trường hợp này, giun đất đóng vai trò cơ bản trong việc mở rộng các lỗ rỗng

của đất và làm cho PAHs có khả năng sinh học Hơn nữa, bằng cách khuếch tán thụđộng qua lớp hạ bì và tiêu hóa, giun đất hấp thụ PAHs làm giảm nồng độ các hợp

chất này Cuối cùng, chúng cải thiện chất lượng đất thông qua việc bài tiết các chấtdinh dưỡng, kích thích sinh trưởng của vi khuan, tăng sinh khối và hoạt động enzym

của chúng [43].

Hệ vi sinh vật và chung vi sinh vật đơn phân giải carbazole

Nghiên cứu hiệu quả phân hủy carbazole bởi cộng đồng vi sinh vật đang được

quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây [25, 45] Nhóm nghiên cứu củaSalam đã thử nghiệm khả năng phân giải carbazole trên mô hình đất thu nhỏ củahỗn hợp 3 chủng vi khuẩn phân giải carbazole bao gồm Achromobacter sp chủngSLI, Pseudomonas sp SL4 va Microbacterium esteraromaticum SL6 [5] Ty lệcarbazole trong dat bị loại bỏ của hỗn hợp 3 chủng cao hon 5 — 20% từng chủngriêng lẻ Một cộng đồng vi khuẩn, chiếm ưu thế trong đó bao gồm PseudomonasSp., Comamonas sp., và Diaphorobacfer sp., phân hủy hiệu quả carbazole trong

nước thải.

Một cách tiếp cận mới trong xử lý sinh học vi sinh vật phân giải carbazole là

sử dụng các tế bào vi sinh vật cố định thay vì tế bào tự do nhăm khắc phục ảnh

hưởng của các điều kiện môi trường khắc nghiệt Nhóm nghiên cứu của Xia Wang

đã kết hợp công nghệ nano với vi sinh vật trong việc loại bỏ carbazole [44, 28] Vi

khuẩn Sphingobium yanoikuyae XLDN2-5 được cô định bang cách bao bọc các tếbao trong hỗn hợp hạt nano FeaO¿ và gellan gum [47] Các hạt nano FesOx được lắpráp thành công lên bề mặt tế bào XLDN2-5 Các tế bào Sphingobium yanoikuyaeXLDN2-5 cố định cho thấy hoạt tính phân hủy sinh học tốt và khả năng tái sử dụngcao [28] Tương tự, khả năng loại bỏ hiệu quả carbazole và độ bền trong môi trường

của tế bào có định Thalassospira profundimaris trong gellan gum cũng được chứng

minh trong nghiên cứu của Manas và cộng sự [47].

1.3 Vi khuẩn phân giải carbazole

1.3.1 Quá trình phân hủy carbazole của vi sinh vật hiếu khí

Sự phân hủy sinh học phân tử carbazole theo con đường hiếu khí chia thành

hai giai đoạn chính bao gồm: (1) quá trình trao đổi chất ngoại vi và (2) quá trình

trao đổi chất trung tâm [25, 38]

(1) Trao đổi chất ngoại vi:

Con đường trao đổi chất ngoại vi chuyển đổi carbazole thành các hợp chấttrung gian quan trọng bằng hai hoạt động chính là hoạt hóa và mở vòng thơm

Quá trình đưa oxy vào chất nền mở đầu sự phân hủy hiếu khí của hydrocarbon

thơm [38] Quá trình này vừa tăng độ tan của phân tử trong nước vừa hoạt hóa phản

ứng Nguyên tử oxy được đưa vào dưới dạng nhóm hydroxyl (-OH) và bắt nguồn từ

oxy phân tử (Oz) [38] Phan ứng oxi hóa được xúc tác bởi các enzyme oxygenase.

Hai loại enzyme oxygenase bao gồm monooxygenase và dioxygenase Enzymemonooxygenase đưa một nguyên tử oxy duy nhất vào cơ chất thơm Trong khi đó

dioxygenase đưa cả hai nguyên tử oxy vào cơ chất thơm, kích hoạt vòng thơm bằng

cách hình thành các hợp chất dihydroxy và phá vỡ cấu trúc thơm

Ba con đường mở vòng chính đã được báo cáo đối với carbazole: Dioxy hóa

bên ở vi tri carbon 3 và 4, monohydroxyl hóa ở vi trí carbon 1, 2 và 3 và oxy hóa góc ở vi tri carbon 1 và 9a [25, 38].

Dioxy hóa bên: Quá trình nay hình thành hai nhóm hydroxyl ở vi trí bên của

vòng benzen dé tạo ra cis-dihydrodiol Nhóm nghiên cứu của Grifoll đề xuất quá

trình dioxy hóa carbazole bởi vi khuan Pseudomonas cepacia F297 ở cacbon C3 vàC4 Carbazole được chuyển hóa tao ra axit 4-(3'-hydroxy-2'-indoyl)-2-oxo-3-butenoic Tuy nhiên, chủng F297 không thé sử dụng carbazole làm nguồn carbon vanăng lượng [26].

Hydroxyl hóa: Biến đổi thông qua quá trình hydroxyl hóa là một phan ứng

chuyên hóa carbazole phô biến hơn ở vi khuẩn [26] Sự chuyển đổi sinh học của

carbazole thành hydroxycarbazole được đề cập trong nhiều báo cáo [21].Aspergillus flavus VKM F-1024 đã monohydroxyl hóa carbazole ở vi trí 1, 2 va 3

10

tạo thành 1-, 2- và hydroxycarbazole [21] Sản phẩm chuyên hóa sinh học

3-hydroxycarbazole được xác định là sản phẩm chính trong khi 1-hydroxy- và hydroxycarbazole là sản phâm phụ Các dioxygenase của vi khuẩn như naphthalene

2-1,2-dioxygenase từ Pseudomonas sp NCIB 9816-4 và biphenyl dioxygenase từ

Beijerinckia sp B8/36 xúc tac quá trình oxy hóa ban đầu của carbazole thành hydroxycarbazole [26].

3-Dioxy hóa góc [26]: Khác với quá trình oxy hóa bên và monohydroxyl hóa,

quá trình oxy hóa góc dẫn đến quá trình khoáng hóa hoàn toàn carbazole tạo thành

catechol Carbazole được oxy hóa ở các nguyên tử carbon góc (C9a) và nguyên tử

carbon liền kề (C1) dé tạo ra 1-hydro-1,9a-dihydroxycarbazole Sản phẩm tiếp tục

được phân tách dé tạo thành 2'-aminobiphenyl-2,3-diol Chất trung gian này đượcchuyền thành axit anthranilic thông qua quá trình phân tách meta và quá trình thủyphân [21, 22] Axit anthranilic được chuyên đổi thành catechol bằng cách dioxy hóa

ở vi trí Cl và C2, sau đó là các phản ứng khử amin và khử carboxyl tự phat [21].

(2) Trao đổi chất trung tâm

Con đường trao đồi chất trung tâm tiếp tục chuyên đổi các chất trung gian đượctạo ra trong quá trình ngoại vi thành các axit béo và hợp chất nguyên liệu đầu vào

cho chu trình axit tricarboxylic (tricarboxylic acid cycle, TCA) [38] Catechol là

hợp chất trung gian quan trọng tạo ra ở con đường ngoại vi được ghi nhận trongphần lớn các báo cáo phân tích chất trung gian chuyển hóa carbazole Trong con

đường trung tâm, catechol được chuyền đổi thành chat trung gian của chu trình axit

tricarboxylic (TCA) thông qua quá trình phân cat ortho (P resinovorans CA10)hoặc quá trình phân cắt meta (P stutzeri OM1) [8, 25]

Trên đây cũng là quy trình chung của các con đường phân cắt hydrocarbon,hydrocarbon thơm và các hợp chất POPs Các gen mã hóa các dioxygenase vàmonooxygenase là nền tảng cho các giai đoạn phân hủy của hydrocacbon thơm

được báo cáo ở vi khuẩn bao gồm: bphAa, bphC, benA, pobA, carAa, antA, nahAa,

nahAb, nahC, nagG, poxA, etbAa, nidA, phdF, pht3, phtAa, tphA2, cmtAb, cmtC,

11

hcaE và mhpB [38] Trong đó carAa và bphC đã được chứng minh tham gia con

đường phân hủy carbazole [25, 48].

1.3.2 Da dang vi khuẩn phân giải carbazole

Vi khuẩn phân giải carbazole được tìm thấy chủ yếu từ mẫu đất, nước khu vực

ô nhiễm do rác thải, hydrocarbon, tràn dầu hoặc ô nhiễm do chất diệt cỏ Chúng cókhả năng sử dụng carbazole làm nguồn carbon, nito và năng lượng Chiếm tỷ lệ lớntrong đó là các loài sinh trưởng hiếu khí Achromobacter sp SL1, Pseudomonas sp

SL4 va Microbacterium esteraromaticum SL6 được phân lập từ đất nhiễm

hydrocarbon va kim loại nặng [7] Ralstonia sp RJGII.123 được phân lập từ đất của

nhà máy sản xuất than lâu năm [8] Pseudomonas rhodesiae KK1 được phân lập từ

đất nhiễm hắc in than đá [9] Bay chủng vi khuẩn Pseudomonas sp được phân lập

từ bùn hoạt tính của một nhà máy xử lý nước thải luyện cốc [51] Pseudomonasstutzeri OM1 được tim thấy trong bùn khu vực ô nhiễm nước thải đô thị [37] Số

khác được phát hiện từ nguồn phân lập không ô nhiễm Ching vi khuẩn

Burkholderia IMP5GC (AY914317) chịu nhiệt lên tới 70°C được phân lập từ suốinước nóng Mexico, có khả năng phân giải carbazole trên cả môi trường nước vamôi trường hai pha dầu-nước [31] Nhóm vi khuẩn phân lập từ nước biển thuộc cácchỉ Neptuniibacter, Erythrobacter, Marinobacter, Caulobacter, Hyphomonas,

Lysobacter, Sphingosinicella, Kordiimonas va Terrabacter, cing cho thay kha nang

sử dụng carbazole cho sinh trưởng [11].

Bên cạnh nhóm các vi sinh vật hiếu khi tiềm năng, chỉ số Ít các báo cáo ghinhận vi khuân phân giải carbazole ở điều kiện vi hiểu khí Ching Bacillus sp.KUKK-4 đã phân hủy 31% carbazole khi được nuôi cấy 28 ngày trong môi trườngban đầu chứa 1000 ppm carbazole ở điều kiện vi hiếu khí [67] Một cộng đồng vi

sinh vật, trong đó Pseudomonas sp., Comamonas sp., và Diaphorobacter sp chiêm

ưu thế, cho thay khả năng thích nghỉ cao và duy trì tốt hiệu quả phân giải carbazoletrong lò phan ứng yếm khí tăng cường siêu âm 70°C dé xử lý nước thải [46]

Phan lớn các vi khuẩn phân giải carbazole đã được báo cáo là các chủng Gram

âm Trong đó được bao cáo nhiêu nhat là Pseudomonas và Sphingomonas Cac vi

12

khuẩn Gram dương phân giải carbazole đã được báo cáo bao gồm: Nocardioides

aromafivorans IC177, Gordonia sp F.5.25.8 và Microbacterium esteraromaticum

SL6 [26].

1.3.3 Da dang gen chức năng tham gia phân giải carbazole ở vi khuẩn

Hệ thống CARDO ở Pseudomonas resinovorans CA10

Con đường chuyển hóa carbazole của chủng vi khuẩn Pseudomonas

resinovorans CA 10 đã được nghiên cứu chi tiết trong hai thập kỷ [8, 10, 18, 19, 25].CARDO ở Pseudomonas resinovorans CA 10 là một hệ thông dioxygenase ba thành

phần thuộc hệ thống Rieske nonheme iron oxygenase (ROS), bao gồm một terminal

oxygenase và các protein vận chuyên điện tử (Hình 1.2) [19] Hệ thống protein và

enzyme tham gia phân hủy sinh học của CA 10 bao gồm carbazole 1,9a-dioxygenaseđược mã hóa bởi car4a (terminal oxygenase), carAc (ferredoxin), và carAd(ferredoxin reductase) (Hình 1.2) [8] CarBa, carBb mã hóa các tiêu đơn vị cấu trúc

và tham gia xúc tác của enzyme cắt vòng thơm vi trí meta

(2'-aminobiphenyl-2,3-diol 1,2-dioxygenase) (Hình 1.3) [18] CarC mã hóa hợp chat hydorlase cắt meta.Các thành phần này cùng nhau chuyên đổi carbazole thành axit anthranilic và 2-hydroxy-4-pentenoate (Hình 4) 2-Hydroxypenta-2,4-dienoate được chuyển đổithành axit pyruvic va acetyl coenzym A bởi 2-hydroxypenta-2,4-dienoate hydratase (được mã hóa bởi carD), 4-hydroxy-2-oxovalerate aldolase (được mã hóa bởi

carE), va acetaldehyde dehydrogenase (được mã hóa bởi carF) Gen carDFE mã

hóa con đường phân cắt meta đã được xác định ở vùng cuối của carAd Gen antABC

mã hóa anthranilate 1,2-dioxygenase nằm trên carAa Trong số nhiều dioxygenase

của hop chất thơm được báo cáo, CARDO là dioxygenase duy nhất có thé xúc tác

quá trình cis-dihydroxyl hóa, monooxygen hóa và dioxygen hóa góc trên các hợp

chất thơm khác nhau [18]

13

| FAD, plant [2Fe2S} | Riekel2Ee2SJ | Ee*.RiekelzFe2SJ |

Hình 1.2 Chudi truyện điện tử bat đầu con đường chuyển hóa carbazole và các

protein liên quan cua chung Pseudomonas resinovorans C410 [10]

NH,

NH, NH, oe0 00,H

'aFAAÁcd spontaneously tGarBaBh 7 hntheanilic acid cH, CarF cH,

ee (a „H0 C05csA

M'm ; A "| Hồ as cou CarD E0,

Carbazolo 2-Aminabipheny!- LAS2,3-diol "9 cco

3-Hydtoxyparita- |

‡ ả-diennaic acid C=O

|

cH,

Hình 1.3 Con đường chuyền hóa carbazole của vi khuẩn Gram âm P resinovorans

CA10 và vi khuan Gram dương N aromativorans IC177 [26]

Cum gen phân giải carbazole của chung Sphingomonas sp KA1

Cum gen car ở Sphingomonas sp KA1 tương đồng <60% với cum gen car ở

Pseudomonas [25, 12] Sphingomonas sp KA1 có cum gen car (carAaBaBbCAc),

một gen ferredoxin (fdx/) và hai gen ferredoxin reductase (fdrII và ƒdr!!) CarAa ởSphingomonas sp KA1 va Pseudomonas resinovorans CA10 tương đồng hơn 55%.CarAc khác nhau giữa hai chi nay [26].

Cum gen phân giải carbazole ở Nocardioides aromaticivorans IC177

Cum gen phân hủy carbazole của vi khuẩn Gram dương Nocardioides

aromaticivorans IC177 bao gồm carAaCBaBbAcAd và carDFE [17, 23] CarAatương đồng 49% với Car⁄4a từ Sphingomonas sp KA1 CarAc tương đồng 31% với

CarAc từ P resinovorans CA10 [26] Vi tri của carC so với carBaBb trong chủng

IC177 nằm ngược lại với vị trí trong cụm gen car của Pseudomonas và

Sphingomonas [26] Dioxygenase ở IC177 có thé xúc tác đồng thời cho cả hai phảnứng hydroxyl hóa và oxy hóa góc Các gen này mã hóa các enzym phân cắt

14

carbazole thành anthranilate và 2-hydroxypenta-2,4-dienoate (HPD) (hydroxyl hóa)

va HPD thành pyruvate và acetyl coenzyme A.

Hệ thống protein va enzyme phân giải carbazole tham gia chuyển hóa dioxin và

PAHs khác

Carbazole và dioxin tương đồng về khung phân tử [33, 41] Do đó, hai nhómchất này cũng có chung một số cơ chế phân tách nhân thơm với hệ thống protein vàenzyme chức năng tương tự (Hình 1.2 và Hình 1.5) [11, 25, 34] Hai cơ chế đầu tiên

phá vỡ cấu trúc bền vững của dioxin là oxy hóa bên và oxy hóa góc [41, 34] Trong

quá trình oxy hóa bên, sự hydroxyl hóa vòng thơm xảy ra trên các nguyên tử carbon

1,2 hoặc 2,3 hoặc 3,4 Hoạt động này tương tự với con đường chuyền hóa các hợpchat thơm đa vòng (PAHs), trong đó có carbazole [11, 41] Quá trình oxy hóa gócxảy ra ở các nguyên tử carbon phụ thuộc vào cầu ether (4, 4a) nhờ các dioxygenase

[34] Hoạt động của dioxygenase dẫn đến sự phân cắt vòng phá hủy hoàn toàn cautrúc phăng và do đó dẫn đến giảm đáng kể độc tính của dioxin [11, 34]

[15, 34] Trong quá trình nay, dioxin dioxygenase đã tấn công vào vị trí góc tiếp

giáp với nguyên tử nitơ (vị tri 1 và 9a), chuyên đổi carbazole thành axit anthranilic

va catechol Chung Pseudomonas resinovorans CA 10 phan giải carbazole được báo cáo có khả năng phân hủy dibenzofuran va dibenzo-p-dioxin [10] Các gen CARDO

1,9a-dioxygenase của CA10 có thé chuyển đổi dibenzo-p-dioxin và dibenzofuranthành 2,2'3-THDE và 2,2',3-THB tương ứng Hoạt động chuyên hóa dibenzofuran

và dibenzothiophene của vi khuẩn phân giải carbazole Sphingobium yanoikuyae

XLDN2-5 được báo cáo bởi Zhonghui và cộng sự [6, 50] XLDN2-5 phân hủy dibenzofuran thành axit 2-hydroxy-6-(2-hydroxyphenyl)-6-oxo-2,4-hexadienic và sau đó thành axit salicylic thông qua con đường oxy hóa góc Trái ngược với

dibenzofuran, chủng XLDN2-5 có thé biến đổi dibenzothiophene thông qua conđường phân cắt vòng và sulfoxid hóa [50] Đặc biệt, XLDN2-5 có thé làm suy giảm

dibenzofuran và dibenzothiophene băng cách sử dụng carbazole làm chất nền khi cả

ba cơ chất này có mặt đồng thời trong môi trường nuôi cay Những kết quả này chỉ

ra rằng XLDN2-5 có phạm vi cơ chất rộng và xúc tác cho quá trình oxy hóa đadạng XLDN2-5 đã xúc tác đồng thời ba quá trình oxy hóa góc, dioxy hóa bên vàoxy hóa đơn Sphingomonas sp KA1 cũng được chứng minh có khả năng loại bỏdibenzofuran, đibenzo-p-dioxin và 2-chlorodibenzo-p- dioxin khỏi đất bị ô nhiễm[12] Vi khuẩn phân hủy carbazole Lysobacter sp OC7 cũng có thé sử dụngnaphthalene và phenanthrene làm nguồn năng lượng và carbon duy nhất [30]

Những nghiên cứu này đã chứng minh tính linh hoạt của hoạt động

dioxygenase trong quá trình biến đổi các hợp chất có cấu trúc phăng tương tựcarbazole (dioxin) và cấu trúc thơm (PAHs) Các vi khuẩn sở hữu hệ dioxygenase

phân hủy chất ô nhiễm có phạm vi cơ chất rộng và nhiều loại khả năng oxy hóa

khác nhau sẽ là một lợi thế lớn cho xử lý sinh học trong môi trường tự nhiên

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý sinh học hợp chất thơm của vikhuẩn

Trên thực tế, xử lý sinh học chỉ hiệu quả tại khu vực có điều kiện môi trườngthích hợp cho sự phát triển và sản xuất enzyme chức năng phân giải chất ô nhiễm

16

của vi sinh vật Các yếu tố phi sinh học và sinh học (như pH, nhiệt độ, khả năngcung cấp chất dinh dưỡng và khả dung sinh học của các chất ô nhiễm) có thé khácnhau giữa các địa điểm hoặc khác nhau giữa các thời điểm của cùng địa điểm do

những biến động môi trường Các yếu tố này ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất xử

lý sinh học bằng cách ức chế hoặc thúc đây mối tương tác chất gây ô nhiễm — visinh vật phân giải chất ô nhiễm

Chat dinh dưỡng

Nguồn dinh dưỡng trong môi trường bị ô nhiễm do hydrocarbon là một trong

các yếu tố ảnh hưởng lớn đến hiệu quả xử lý sinh học [42] Bên cạnh nguồn carbon

dễ sử dụng, vi sinh vật cần các khoáng chất như nitơ, phốt pho, kali và sắt để phát

triển và thực hiện các chuyên hóa Vi vậy việc bổ sung các chất dinh dưỡng thích

hợp ở vùng ô nhiễm nghèo dinh dưỡng (như khu vực ô nhiễm dioxin sân bay Biên

Hòa, sân bay Đà Nẵng) là cần thiết để kích thích sự phát triển của các vi sinh vật tựnhiên, nhằm tăng cường khả năng xử lý sinh học các chất ô nhiễm [19] Trong cácbáo cáo của Jin và cộng sự, khả năng phân hủy sinh học hydrocarbon dầu mỏ trên

môi trường biên bị ức chế do hàm lượng nitơ và phốt pho thấp [19] Mặt khác, thừa

dinh dưỡng cũng có thé ức chế quá trình xử lý sinh học các chat ô nhiễm [22] Ảnh

hưởng tiêu cực của mức độ dinh dưỡng cao đối với sự phân hủy sinh học của chấthữu cơ gây ô nhiễm được ghi nhận trong nhiều báo cáo [22]

Nông độ oxy

Phần lớn xử lý sinh học ô nhiễm PAHs, trong đó có carbazole, được nghiêncứu trong điều kiện hiếu khí [25] Trong quá trình này, oxi vừa là đồng chất nềntham gia phản ứng, vừa là yếu tố giới hạn tốc độ phản ứng [42] Oxy cần thiết chohoạt động của cả enzyme mono và dioxygenase trong quá trình oxy hóa ban đầu của

các vòng thơm Đối với xử lý in situ các chat gây ô nhiễm, đôi khi oxy có thé được

thêm vào từ nguồn bên ngoài Việc bổ sung oxy từ bên ngoài có thê được thực hiệnbăng cách thoát nước, xới đất, bô sung các chất giải phóng oxy hoặc bơm không khí

vào khu vực bị ô nhiễm [42] Trong một nghiên cứu, quá trình xử lý sinh học nội tại

tăng cường của các hợp chất BTEX trong tầng ngậm nước bằng cách sử dụng

17

magnesium peroxide giải phóng oxy đã được báo cáo [42] Trong thử nghiệm xử lý

sinh hoc in situ tầng ngậm nước 6 nhiễm do phenol, BTEX va PAHs, natri nitratđược dan qua tang ngậm nước dưới dang nguồn oxy nhờ các giếng bom [42]

pH

pH đóng một vai trò quan trọng trong các quá trình phân hủy sinh học PAHs

[42] Phần lớn vi sinh vật thường hoạt động bình thường với pH và các điều kiệngần trung tính (6,5—7,5) Tuy nhiên, nhiều khu vực 6 nhiễm do hợp chất thơm có độ

pH nằm ngoài vùng trung tính Quá trình lọc một số vật liệu như than đá có thé tạo

ra môi trường axit do quá trình oxy hóa sulfure Các điều kiện axit hoặc kiềm tao ra

các điều kiện bất lợi cho các hoạt động của vi sinh vật, từ đó làm giảm sự phân hủy

sinh học của PAHs tại các địa điểm đó

Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự phân hủy sinh học của PAHs, bao gồm ca

carbazole [42] Nhiệt độ thay đổi theo từng khoảng thời gian trong năm và mỗi thời

điểm trong ngày Khi nhiệt độ tăng dẫn đến tăng độ tan của pAHs, do đó làm tăngkhả dụng sinh học của các phân tử PAHs Đồng thời, nhiệt độ tăng làm nồng độ oxyhòa tan giảm, dẫn hết giảm hoạt động trao đôi chất của các vi sinh vật hiếu khí Ởnhiệt độ cao, một số chất ô nhiễm có thể chuyên hóa thành các hợp chất mới độchơn [23].

1.5 Mục tiêu nghiên cứu

Carbazole không tồn tại đơn lẻ trong tự nhiên Hợp chất này được phát hiệnngẫu nhiên trong các mẫu phân tích hydrocarbon gây ô nhiễm và thuốc trừ sâu, hoặcđược phát hiện với vai trò là chất trung gian khi phân tích PAHs, polychlorinateddioxin và polychlorinated biphenyls (PCB) Sự tương tác giữa các cơ chat này trongmôi trường là yếu tố quan trọng dé lựa chọn phương thức xử lý chat 6 nhiễm dich

Vì vậy, trong các báo cáo gần đây, các nhà khoa học kết hợp các chủng vi khuẩnđơn lẻ nhằm tích hợp khả năng phân giải của từng chủng giúp tăng hiệu quả xử lý

carbazole Đồng thời, việc làm giàu hệ vi sinh vật tại vị trí ô nhiễm được cũng được

quan tâm nghiên cứu nhăm chọn lọc những hệ vi sinh vật vừa có hiệu quả phân hủy

18

carbazole và các hợp chất tương tự, vừa có khả năng thích nghỉ cao với điều kiện

bản địa.

Môi trường tích tụ nguồn ô nhiễm lâu dài thúc day quá trình thích nghi của

hệ vi sinh vật bản địa, trở thành nguồn nguyên liệu lý tưởng cho việc tìm kiếm vàsàng lọc nguồn gen tiềm năng Trong chiến tranh Việt Nam, quân đội Mỹ đã tập kếtdioxin tại một số sân bay quân sự ở miền Trung và miền Nam Theo thời gian, cácsân bay này trở thành nguồn làm giàu tự nhiên cho các vi sinh vật có khả năng phân

giải dioxin và các hop chất liên quan Do đó, đây là nguồn nguyên liệu tiềm năng

cho việc nghiên cứu quan xã vi sinh vật có tính đặc trưng cao, đồng thời là nguồn

phân lập hiệu quả đối với các chủng vi sinh vật có khả năng khoáng hóa và đồng

chuyên hóa carbazole Thêm vào đó, con đường chuyển hóa phức tạp hơn củadioxin cùng sự phối hợp của hệ thong enzyme da dang va linh hoạt trở thành cơ hộicho việc phát hiện và nghiên cứu con đường chuyền hóa carbazole mới Bước quantrọng nhất trong quá trình này là hiểu được cộng đồng vi sinh vật tự nhiên, sứcmạnh tong hợp của hệ với môi trường và các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phanhủy sinh học và biểu hiện gen chức năng Việc tăng sinh mật độ quan thé các nhóm

vi sinh vật này có tiềm năng lớn trong công cuộc xử lý sinh học và phục hồi môi

trường các vùng ô nhiễm.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát triển hệ vi sinh vật định hướng phân giải

carbazole từ hệ vi sinh vật tự nhiên trong đất nhiễm dioxin bằng phương pháp nuôi

cấy làm giàu Môi trường khoáng nghèo dinh đưỡng bồ sung carbazole nồng độ caolàm nguồn carbon duy nhất được sử dụng làm áp lực chọn lọc Quá trình này giúpkích thích sự thích nghỉ và thay đổi thành phần di truyền của hệ vi sinh vật tự nhiênsang các nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải carbazole và các nhóm sử dụng cáchợp chất trung gian trong quá trình chuyên hóa carbazole Trên cơ sở đó, các chủng

vi khuẩn sở hữu con đường chuyền hóa carbazole hoan chỉnh, có khả năng phân giảicarbazole làm nguồn carbon cho sinh trưởng khi hoạt động đơn lẻ được phân lập.Khả năng phân hủy carbazole của hệ vi sinh vat và chủng vi khuẩn đơn khảo sát ởquy mô phòng thí nghiệm cũng được báo cáo.

19

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Chương 2 — VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vat liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng 07 mau đất nhiễm dioxin, ký hiệu lần lượt, FC2-PL4,FC3-PL5, FT2-PL3, FT3-PL6, T1.1-D, T1.2-D và T1.3-D Bảy mẫu đất bề mặt

được lấy ở độ sâu 10-20 em vào tháng 11/2020 từ các lô trồng cỏ Vetiver, lô đối

chứng của thí nghiệm ngoài trời tại khu Pacer Ivy, phía Tây Nam sân bay Biên Hòa

và từ lô trồng cỏ Vetiver của thí nghiệm trong nhà (lấy đất nhiễm từ khu Pacer Ivy)(Bảng 2.1) Đây là khu đất bị nhiễm dioxin rất nặng do một lượng lớn chất diệt cỏ

bị tràn ra môi trường trong quá trình thu hồi và dồn gom các thùng chất diệt cỏ sauchiến dịch Ranch Hand để chuyên về Mỹ Mẫu được sử dụng dé thực hiện thí

nghiệm nuôi cấy làm giàu sau 48h bảo quản tại 4°C ké từ thời điểm lấy mẫu thực

nghiệm.

Bảng 2.1 Các mẫu đất nhiễm Dioxin được thu thập và sử dụng cho nghiên cứu

STT | Tênmẫu | TEQ (ppt) Mô tả

1 | FC2-PL4 1154 Đất không trồng cỏ, thí nghiệm ngoài trời

2 | FC3-PL5 1921 Đất không trồng cỏ, thí nghiệm ngoài trời

3 FT2-PL3 647 Dat trồng cỏ Vetiver, thi nghiệm ngoài trời

4 FT3-PL6 577 Đất trồng cỏ Vetiver, thí nghiệm ngoài trời

5 T1.1-D 467 Đất trồng cỏ Vetiver, thí nghiệm trong nha

6 T1.2-D 449 Đất trồng cỏ Vetiver, thi nghiệm trong nhà

7 T1.3-D 345 Đất trồng cỏ Vetiver, thí nghiệm trong nha2.1.2 Môi trường nuôi cay

- Carbazole stock: carbazole sử dụng trong các thí nghiệm được bồ sung dướidạng dung dịch cô đặc nồng độ 100 mg/mL trong dung môi DMSO Dung dịch

được bảo quản trong lọ thủy tỉnh tối màu ở 26°C

- Môi trường M63-Car: g/L: KH¿zPO¿ - 136, 1 mL MgSO¿a 1M, FeSOa.7HaO — 0,0005; (NH4)2SO4 — 2, Carbazole — 0,2.

21

- Môi trường TSB-Car: g/L: casein peptone- 3,4; KHzPO¿a — 0,5; glucose — 0,5;

NaCl - 1, soya peptone - 0,6; carbazole — 0,2.

- Môi trường BHI (Brain Heart Infusion Broth) (M210, Himedia, Ấn Ðộ)

2.1.3 Hóa chất và thiết bị

Trong nghiên cứu này, hóa chất và thiết bị được cung cấp bởi Trung tâmNghiên cứu nguồn gen, trường Đại học Phenikaa

Hóa chất

- Carbazole (CAS No 86-74-8, Sigma)

- Dung môi: Dimethyl] sulfoxide (DMSO), dichloromethane (DCM)

- Các hóa chất sinh học phan tử: PowerSoil® DNA Isolation Kit (MO BIO

Laboratories, Inc.), E.N.Z.A Bacterial DNA kit (Omega, Mỹ), Taq polymerase GoTaq (Promega, Mỹ), Master mix (Promega, Mỹ), thang chuẩn ADN (300 bp-10 kb)(Thermo Scientifics, Mỹ).

- Các hóa chat thử nghiệm sinh hóa: Các loại kháng sinh của hãng Sigma,

huyết tương thỏ đông khô NK-COAGULASE TEST (Việt Nam), API 20NE kít

(bioMérieux).

Các hóa chất nuôi cấy vi sinh vật đều là hóa chat tinh khiết của các hãngSigma, Merck, Việt Nam và Trung Quéc.

Thiết bi

- May quang phé UV/Vis Spectrophotometer Jenway (Model 6850, Anh)

- Tủ an toàn sinh học cấp II Telstar, nồi hấp khử trùng Autoclave (ModelKTR-40L, Nhật Bản), tủ lắc 6n nhiệt DAIHAN (Model LSI-3016A), tủ 4m 6n nhiệtDAIHAN (Model LIB-080M, Hàn Quốc), tủ hút, máy PCR Mastercycler proS của

hang Eppendorf (Đức), hệ thống điện di của hãng Cleaver Scientific (Mỹ), ban soi

UV Benchtop Variable Transilluminator (Mỹ) và một số thiết bị chuyên dụng khác

2.2 Phuong pháp nghiên cứu

2.2.1 Làm giàu hệ vi sinh vật đất có khả năng phân giải carbazole

Một gam mỗi mẫu đất được lắc đều trong 10 mL NaCl 0.9 % với tốc độ 200

rpm ở 30°C trong 20 giờ để khuếch tán đều tế bào vi sinh vật trong dung dịch Chất

22

rắn kích thước lớn trong mẫu được loại bỏ bằng cách để lắng tự nhiên trong 20 phút

ở 30°C Sau đó, 5 mL dung dịch được chuyền sang 15 mL môi trường khoáng Car Đây được ký hiệu là mẫu làm giàu lần 1 (ERO1) Sau 7 ngày nuôi cấy trongđiều kiện lắc 200 rpm ở 30°C, 5 mL dịch của bình làm giàu lần 1 được chuyền tiếp

M63-sang 15 mL môi trường M63-Car mới (ER02) Mẫu được làm giàu 7 lần đến khimôi trường có màu nâu cho thấy sự phân hủy của carbazole Hệ vi sinh vật trongmẫu làm giàu từ lần 1 đến lần 7 được ký hiệu lần lượt từ ER01 đến ER07 Mẫuđược bảo quản ở -80°C trong glycerol 15% có b6 sung carbazole 0.1 g/L

2.2.2 Đánh giá khả năng phân giải carbazole của hệ vi sinh vật

Hỗn hợp tế bào được hoạt hóa lần lượt trong 20 mL môi trường M63-Car và

TSB-Car, với tốc độ lắc 200 vòng/phút ở 30°C trong 72 giờ Tế bào thu được saukhi ly tâm 8000 vòng/phút trong 15 phút được rửa bằng DMSO 20% Sau đó, tế bào

được bổ sung vào 20 mL môi trường M63-Car với mật độ ODeoo = 0.1 Bình nuôi

cấy (bình Erlen 100mL) được lắc 200 vòng/phút ở 30°C Nong độ carbazole tổng sốđược xác định tại thời điểm 0; 72 và 144 giờ Kết quả của thí nghiệm được đánh giá

từ dãy số liệu của ít nhất 3 lần lặp lại thí nghiệm độc lập Độ tin cậy được đánh giábang kiểm định student’s t-test

2.2.3 Đánh giá ảnh hưởng của D-glucose đến tốc độ phân giải carbazole

Hệ vi sinh vật được kiểm tra khả năng phân giải carbazole trong môi trường

M63-Car bé sung D-glucose các nồng độ 0,25; 0,5 và 5 g/L Nồng độ carbazole

tổng số được theo dõi theo thời gian trong 432 giờ

2.2.4 Phương pháp xác định nồng độ carbazole

Carbazole tổng số trong môi trường được tách chiết với dung môi hữu cơ

dichloromethane tỉ lệ 1:1 (v/v) lặp lại 3 lần ở 30°C Sau khi cô khô sản phẩm tách, mẫu được bảo quản ở 4°C Mẫu chứa carbazole được hòa tan trong dung môi

DMSO Nồng độ carbazole trong môi trường được xác định dựa trên phương pháp

đo độ hấp thụ tại bước sóng 261 nm (A261) bằng UV-Vis

23

2.2.5 Các phương pháp phân lập vi khuẩn phân giải carbazole

- Phương pháp pha loãng cấy trải: 1 mL dịch thé của mẫu làm giàu lần 7 đượcpha loãng bậc 10 bằng dung dich NaCl 0.9% đến 10 Bồ sung Tween80 vào dung

dich pha loãng nồng độ 10°, lắc ở 200 rpm, 30°C trong 4 giờ Sau đó, 100mL dịch

tế bào được cấy trải trên môi trường M63-car U đĩa môi trường ở các nhiệt độ25°C, 30°C, 37 °C và các pH 5-6-7-8-9-11 U đĩa đến khi xuất hiện vòng phân giảicarbazole xung quanh vùng sinh trưởng của vi sinh vật trong khoảng 7-14 ngày.

- Phương pháp cấy ria ba pha: Hệ vi sinh vật được nuôi cấy tĩnh trong môi

trường M63 bồ sung 1000 ppm carbazole trong 7 ngày Toàn bộ sinh khối được thu

lại bằng cách ly tâm 10000 rpm trong 10 phút Tế bào sau đó được ria 3 pha trên

môi trường M63-Car, ủ 30°C Sinh khối vùng phân giải carbazole được thu trực tiếp

từ đĩa thạch, lắc với 0.001% Tween80 trong 4 h Pha loãng dung dich đến 107 vàcấy trải trên môi trường M63 bổ sung 500 ppm carbazole, ủ 30°C Các đĩa vi sinh

vật được nuôi cây 25-30 ngày đến khi quan sát thấy vòng phân giải carbazole

- Phương pháp nuôi cấy xen kẽ: Vi sinh vật trên môi trường TSB-Car được ủxen kẽ giữa 28°C và 37°C Mỗi nhiệt độ nuôi cay trong 36 h, thực hiện liên tục trong

216 giờ.

- Sang lọc bằng kháng sinh: Vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường dich thé

TSB-Car bổ sung nồng độ 50 pg/L các kháng sinh: gentamicine, kanamycine,

tetracycline và ampicilline ở 200 ppm trong 48 h Vi sinh vật sau đó được sang lọc

bang phương pháp pha loãng cấy trải

- Sang lọc bằng Fe?*: Phương pháp sử dụng môi trường M63-Car có sửa đổi:loại bỏ thành phần Mg”, tăng Fe?” lên 5 mM và carbazole stock (100 mg/mL) được

bổ sung trực tiếp vào môi trường sao cho tạo thành các hat lớn trong nước Nuôi lắc

vi sinh vật trong môi trường ở 120 rpm, 30°C đến khi xuất hiện các cụm tế bào.Cum tế bào được thu lại và cay ria 3 pha trên M63-Car

Vi sinh vật có vòng phân giải carbazole (thu được ở tất cả các phương pháp)được tinh sạch nhiều lần trên môi trường M63-Car và TSB-Car đến khi thu được

24

chủng thuần khiết Cuối cùng độ thuần được xác định lại bang cách giải trình tự 16S

rDNA.

2.2.6 Thử nghiệm sinh hóa vi khuẩn

Hình thái khuẩn lạc và tế bào

Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường M63-car và TSB-car bằng phươngpháp cấy ria 3 pha Hình thái khuẩn lạc được quan sát trên đĩa thạch sau 14 ngày ủ ở

30°C Đặc điểm tế bào được quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét JEOL5410 Nhật Bản với độ phóng đại 5000 lần

LV-Đánh giá khả năng sử dụng các nguồn đường:

Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường dịch thé TSB1/5-car, lắc 200 rpm ở

30°C trong 72h Tế bào được thu lại bằng cách ly tâm 10000 rpm trong 10 phút.Rửa tế bao bằng 20% DMSO vô trùng 4 lần liên tiếp dé loại bỏ hoàn toàn carbazoletrong môi trường Tế bào được hòa tan trở lại trong môi trường khoáng M63, chuẩn

dung dịch về ODsoo=1 Khả năng sử dung carbohydrate của chủng vi khuẩn được

khảo sát trên môi trường M63 bổ sung 2% các nguồn đường: glucose, sucrose,sorbitol, manitol, lactose và fructose 1% vi khuân (ODsoo=l) được bổ sung vào 10

mL môi trường M63 đã có các nguồn đường khác nhau, lắc 200 rpm 6 30°C Kết

qua được đánh giá bang cách đo mật độ tế bào (ODsoo) sinh trưởng sau 24h nuôicây

Thử nghiệm API-20NE

Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường dịch thé TSB1/5, lắc 200 rpm ở 30°Ctrong 72h Dịch nuôi cay được chuẩn về ODooo=1 Thử nghiệm được thực hiện theo

hướng dẫn của bộ kit API-20NE.

Kiểm tra độ nhạy kháng sinh

Độ nhạy kháng sinh của vi khuẩn được đánh giá bang phương pháp khuếchtán trên đĩa thạch Các kháng sinh thử nghiệm bao gồm: penicillin (10 UD),ampicillin (100 ug), gentamycin (10 pg), kanamycin (100 pg), streptomycin (10 ug), tetracillin, optochin (5 ug), bacitracin, chloramphenicol (30 yg), rifampicin (30

ug), ofloxacin (5 ug), polymyxin B (300 IU), oxacillin (1 pg).

25

Vi khuẩn được nuôi cay trên môi trường BHI, lắc 200 rpm ở 30°C Sau 72 h,

điều chỉnh mật độ tế bào về ODaoo = 1 2% dịch tế bào (OD 1) được phối trộn vào

môi trường thạch TSB Các đĩa giấy kháng sinh được đặt trên đĩa thạch đã có vi

khuẩn kiểm định Ủ đĩa ở 30°C trong 5 ngày Vòng ức chế sinh trưởng quanh vị trí

đĩa giấy kháng sinh cho thấy độ nhạy kháng sinh của vi khuẩn

The nghiệm hoạt tính coagulase

Thử nghiệm coagulase được thực hiện trên huyết tương thỏ đông khô Vikhuẩn kiểm định được nuôi cấy trên môi trường BIH trong 48 h, sử dung làmnguyên liệu đầu vào cho thí nghiệm Đối chứng dương là chủng Pseudomonas

aureus làm đông tụ huyết tương, đối chứng âm là nước cất vô trùng Quy trình thí

nghiệm và đánh giá kết quả được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất

(NK-COAGULASE TEST, Việt Nam).

2.2.7 Các phương pháp tách chiết DNA và kiểm tra sản phẩm tách

Phương pháp tách chiết DNA hệ gen vi khuẩn

Chung vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường TSB ở 200 rpm, 30°C trong 72

h Ly tâm 10000 rpm trong 10 phút thu tế bao DNA tổng số của chủng vi khuẩnđược tách chiết bằng kit tách thương mại E.N.Z.A Bacterial DNA kit (Omega, Mỹ)

Quy trình được thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit.

Phương pháp tách chiết DNA metagenome

Phương pháp được sử dụng dé tách chiết metagenome của hệ vi sinh vật phân

giải carbazole được làm giàu từ mẫu đất tự nhiên 5 mL dịch nuôi cấy làm giàuđược ly tâm 10000 rpm trong 15 phút thu tế bào Rửa tế bào 4 lần băng 20% DMSO

vô trùng đề loại bỏ carbazole còn lại trong môi trường DNA metagenome của hệ vi

sinh vật được tách chiết bằng kit tách thương mại PowerSoil® DNA Isolation Kit

(MO BIO Laboratories, Inc.) Quy trình được thực hiện theo hướng dan của bộ kit.

3’) Chu trình nhiệt: biến tính ADN 6 95°C trong 3 phút, phản ứng khuếch đại gen

được thực hiện trong 30 chu trình, với mỗi chu trình nhiệt được cài đặt như sau:

95°C trong 30 giây dé biến tính tách mạch ADN, 56°C trong 15 giây dé gắn mồi,72°C trong | phút giây dé khuếch đại gen, giữ 72°C trong 5 phút [54]

Phương pháp điện di gel agarose

Sản phẩm tách chiết DNA được diện di trên gel theo mô tả của Sambrook và

Russell [55] Mẫu DNA được chạy trên gel agarose 1%, nhuộm với chất nhuộm axit

nucleic Redsafe Bang DNA được quan sát dưới ánh sang UV320.

2.2.8 Phương pháp phân tích trình tự 16S rDNA và dựng cây phân loại

Chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường TSB-Car ở 200 rpm, 30°C

trong 72 giờ Ly tâm 10000 rpm trong 10 phút thu tế bao DNA tổng số của chủng

vi khuẩn được tách chiết bằng kit tách thương mại E.N.Z.A Bacterial DNA kit(Omega, Mỹ) DNA được giải trình tự toàn bộ hệ gen trên hệ thống Hi-seq bởi công

ty Macrogen, Hàn Quốc Kết quả sau khi xử lý được chú giải bằng Prokka Trình tự

16S rDNA của các chủng vi khuẩn được BLAST trên cơ sở dữ liệu EzBioCloud.Cây phát sinh loài Neighbor-Joining được xây dựng trên thư viện 16S rDNA, sử dụng công cụ MEGA11, giá tri bootstrap 1000.

2.2.9 Phương pháp phân tích Metagenomic

Trình tự DNA metagenome trong nghiên cứu được xác định bang Illumina

V3-V4 16S MiSeq tại Macrogen, Hàn Quốc Da dạng VSV được chú thích bằng

công cụ QI1ime2.

2.2.10 Phương pháp phân tích trình tự Whole Genome

Lắp ráp và chú thích bộ gen

- Lap ráp bộ gen bằng GALAXY (Version 0.73, Australia): Dữ liệu thô và

trình tự sau tinh sạch được đánh giá chất lượng bằng FastQC Tinh sạch trình tự

bang công cụ Trimmomatic Lắp ráp hệ gen De novo bang công cụ SPAdes Kiểmtra chất lượng lắp ráp bằng công cụ QUAST Loại bỏ các contig dưới 200bp băngcông cụ Filter sequencing by length Kiểm tra độ toàn vẹn hệ gen bằng công cụ

Busco.

27

- Chú thích hệ gen: Hệ gen được chú thích bang Prokka Các chú thích chức

năng được thực hiện bởi Rapid Annotation using Subsystem Technology (RAST,

version 2.0) với cơ sở dit liệu SEED [56]; biểu đồ hệ gen được biểu diễn bằng

SEEDViewer; công cụ eggNOG-mapper v2 dựa trên cơ sở dữ liệu eggNOG [57] va Công cụ DDBJ Fast Annotation and Submission (DFAST) [58].

So sánh bộ gen (Comparative genome analysis)

Mỗi quan hệ di truyền giữa chủng phân lập và các chủng có độ tương đồng

cao nhất (theo trình tự 16S rDNA) được tiếp tục đánh giá dựa trên whole genome

bang chỉ số Average Nucleotide Identity (ANI) va digital DNA-DNA hybridization(dDDH) Ngưỡng phân loại loài đối với giá tri ANI nằm trong khoảng tương đồng95-96% Giá trị dDDH > 70% cho thấy các chủng có thể được gán cho cùng mộtloài và các giá trị dưới 70% cho thấy các chủng thuộc về các loài khác nhau

ANI được xác định bằng công cụ Orthologous Average Nucleotide Identity(orthoANI, version 5.0) [59] và dDDH được xác định bằng Genome-To-Genome

Distance Calculator (GGDC) (http://ggdc.gbdp.org) Cơ sở dữ liệu Whole genome

của các chủng tham chiếu được lấy từ hệ thống NCBI và BV-BRC version 3.28.5

(Bioinformatics Resource Centers, Chicago).

Phân tích gen chức năng

Gen chức năng liên quan đến con đường chuyền hóa carbazole và các hợp chất

liên quan được tham khảo từ KEGG Cac gen được BLAST trên cơ sở dt liệu NCBI Cơ sở dữ liệu gen độc lực được tham khảo từ Virulence factor database

(VFDB) Định danh gen kháng kháng sinh bằng công cụ ABRicate

28