Luận văn thạc sĩ khoa học phân lập và tuyển chọn các chủng lactobacillus spp có hoạt tính probiotic để sản xuất thực phẩm chức năng nhằm nâng cao sức khỏe sinh sản cho phụ nữ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thanh Hiền PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG Lactobacillus spp CĨ HOẠT TÍNH PROBIOTIC ĐỂ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG NHẰM NÂNG CAO SỨC KHỎE SINH SẢN CỦA PHỤ NỮ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thanh Hiền PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG Lactobacillus spp CĨ HOẠT TÍNH PROBIOTIC ĐỂ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG NHẰM NÂNG CAO SỨC KHỎE SINH SẢN CỦA PHỤ NỮ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Bùi Thị Việt Hà Hà Nội - 2020 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa học thạc sĩ chuyên ngành Vi sinh vật học mình, trước hết em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Thị Việt Hà – Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQGHN) tin tưởng, tận tình bảo, hướng dẫn em suốt trình thực hoàn thành luận văn Trong thời gian học tập trường em xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo môn Vi sinh vật học, Phòng Sinh học Nano ứng dụng – KLEPT, Khoa Sinh học Khoa Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQGHN) nhiệt tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt trình học tập thực luận văn Ngoài ra, em xin chân thành cảm ơn ủng hộ giúp đỡ anh chị, em sinh viên bạn bè phịng thí nghiệm Hóa sinh Vi sinh môi trường suốt thời gian em thực đề tài Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp tạo điều kiện, quan tâm, động viên góp ý cho em suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 12 năm 2019 Học viên Nguyễn Thanh Hiền MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .i i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Probiotic .3 1.1.1 Khái niệm probiotic 1.1.2 Probiotic phổ biến – Lactobacillus spp 1.2 Vai trò vi khuẩn probiotic 1.2.1 Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa 1.2.2 Khả chống ung thư yếu tố đột biến 1.2.3 Tác động biểu mô ruột 1.2.4 Kích thích hệ thống miễn dịch 1.2.5 Cải thiện việc sử dụng lactose người không dung nạp lactose 1.2.6 Làm giảm cholesterol huyết hạn chế bệnh liên quan đến tim mạch .8 1.2.7 Khả chống dị ứng 1.2.8 Phòng ngừa điều trị viêm nhiễm phụ khoa phụ nữ .9 1.3 Cơ chế kháng khuẩn âm đạo cân hệ vi sinh đường sinh dục phụ nữ sử dụng thực phẩm chức probiotics .11 1.3.1 Sinh H2O2 .11 1.3.2 Sinh axit lactic .11 1.3.3 Sinh tổng hợp chất kháng khuẩn 12 1.4 Tổng quan chung sức khỏe sinh sản phụ nữ 13 1.5 Một số loại thực phẩm chức probiotics thương mại dùng cho người 14 1.5.1 Một số loại thực phẩm chức probiotics dành riêng cho phụ nữ thương mại Thế giới 14 ii 1.5.2 Một số thực phẩm chức probiotics thương mại nước hỗ trợ sức khỏe cho người .15 1.6 Vi khuẩn probiotic sữa mẹ 16 1.7 Bảo quản chế phẩm probiotics chứa Lactobacillus spp phương pháp đông khô 17 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên liệu, thiết bị dụng cụ thí nghiệm 18 2.1.1 Nguyên liệu 18 2.1.2 Phương pháp lấy mẫu sữa mẹ 18 2.1.3 Thiết bị .18 2.1.4 Dụng cụ 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phân lập, tuyển chọn định danh chủng Lactobacillus spp mẫu sữa mẹ 20 2.2.2 Đánh giá số tính chất & hoạt tính probiotic chủng vi khuẩn tuyển chọn điều kiện in-vitro .23 2.2.3 Nghiên cứu số điều kiện nhân giống in-vitro chủng vi khuẩn tuyển chọn 25 2.2.4 Nghiên cứu công thức phối trộn làm tăng mật độ sống sót sau q trình đông khô chủng tuyển chọn 26 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Tỉ lệ Lactobacillus spp L reuteri khu vực nông thôn khu vực thành thị số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam kết tuyển chọn chủng Lactobacillus spp có hoạt tính probiotic định hướng vào sản xuất chế phẩm probiotics giành riêng cho phụ nữ 29 3.1.1 Tỉ lệ Lactobacillus spp L reuteri khu vực nông thôn khu vực thành thị số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam 29 3.1.2 Kết phân lập tuyển chọn chủng Lactobacillus spp từ sữa mẹ 30 3.1.3 Kết định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn từ mẫu sữa mẹ 32 iii 3.2 Kết đánh giá số tính chất, hoạt tính điều kiện nhân giống chủng vi khuẩn tuyển chọn điều kiện in-vitro .34 3.2.1 Kết đánh giá số tính chất hoạt tính probiotic chủng vi khuẩn tuyển chọn điều kiện in-vitro .34 3.2.2 Kết nghiên cứu số điều kiện nhân giống in-vitro chủng vi khuẩn tuyển chọn 43 3.3 Nghiên cứu công thức phối trộn để nâng cao tỉ lệ sống chủng tuyển chọn sau đông khô 45 3.3.1 Mật độ tế bào chủng vi khuẩn tuyển chọn trước đông khô 45 3.3.2 Mật độ sống chủng vi khuẩn tuyển chọn sau đông khô .46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 iv DANH MỤC BẢNG Bảng Thử nghiệm công thức phối trộn sinh khối chủng probiotic 27 với chất bảo vệ 27 Bảng Tỉ lệ Lactobacillus spp L reuteri sữa mẹ khu vực thành thị khu vực nông thôn số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam 29 Bảng Lượng axit lactic sinh chủng L reuteri Lactobacillus spp 30 Bảng Đặc điểm chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn .33 Bảng Số đo vòng kháng khuẩn chủng tuyển chọn với loại kháng sinh 40 Bảng Khả ức chế vi khuẩn nấm có hại 42 Bảng Mật độ sống sót sau đông khô chủng L rhamnosus SMH1 .46 Bảng Mật độ sống sót sau đơng khơ chủng L reuteri SMH2 .47 v DANH MỤC HÌNH Hình Hình thái sinh vật Lactobacillus tế bào biểu mô âm đạo (ảnh nhuộm Gram) [64] Hình Tương tác vi sinh vật đường ruột [35] Hình Các chủng vi khuẩn probiotic chế chống lại bệnh ung thư [29] Hình Cơ chế hoạt động probiotic thúc đẩy cân nội môi liên quan đến khả ứng dụng bệnh viêm ruột [102] .7 Hình Thiết kế thí nghiệm 19 Hình Máy đông khô vi khuẩn 28 Hình Đường cong sinh trưởng lượng axit lactic sinh theo thời gian chủng L rhamnosus SMH1, L reuteri SMH2 chủng đối chứng .34 Hình Khả chịu muối mật chủng L rhamnosus SMH1, L reuteri SMH2 chủng đối chứng L reuteri VTCC 910087 36 Hình Khả chịu axit chủng chủng L rhamnosus SMH1, L reuteri SMH2 chủng đối chứng L reuteri VTCC 910087 37 Hình 10 Khả sinh H2O2 chủng L rhamnosus SMH1, L reuteri SMH2 chủng đối chứng L reuteri VTCC 910087 38 Hình 11 Khả nhạy cảm với kháng sinh chủng ĐC L reuteri VTCC 910087 (Hình 6A), chủng L reuteri SMH2 (Hình 6B) L rhamnosus SMH1 (Hình 6C) 40 Hình 12 Khả tạo màng biofilm chủng L rhamnosus SMH1, L reuteri SMH2 chủng ĐC L reuteri VTCC 910087 41 Hình 13 Khả phát triển chủng L rhamnosus SMH1, L reuteri SMH2 chủng đối chứng L reuteri VTCC 910087 điều kiện nuôi lắc nuôi tĩnh 43 Hình 14 Khả phát triển mức nhiệt độ khác chủng L rhamnosus SMH1, L reuteri SMH2 chủng đối chứng L reuteri VTCC 91008744 vi MỞ ĐẦU Viêm nhiễm phụ khoa hay viêm phụ khoa thuật ngữ dùng để bệnh nữ giới gây tình trạng viêm nhiễm quan sinh dục như: âm đạo, cổ tử cung, tử cung, buồng trứng, vòi trứng, phần phụ, vùng xung quanh Tỉ lệ mắc bệnh viêm nhiễm phụ khoa nữ giới chưa quan hệ tình dục lần thấp có lớp màng trinh bảo vệ giúp ngăn chặn vi khuẩn xâm nhập vào bên tử cung Đối với nữ giới quan hệ tình dục, đặc biệt thời kì mang thai, sinh nở nguy mắc bệnh viêm phụ khoa cao Viêm nhiễm phụ khoa coi bệnh nhiễm trùng phổ biến đặc biệt nước nhiệt đới có Việt Nam Nhiều thống kê từ 2004 đến cho thấy, tỉ lệ viêm nhiễm phụ khoa phụ nữ độ tuổi sinh đẻ mức cao, chiếm đến 90% [1] Nếu không điều trị điều trị không cách, không đầy đủ gây nên biến chứng vơ sinh, chửa tử cung, sảy thai, ung thư cổ tử cung biến chứng cho thai nhi thai chết lưu, dị tật bẩm sinh, trì độn trí tuệ coi vấn đề lớn quan tâm thiệt hại bệnh gây lớn Mặc dù nhiễm trùng đường sinh dục có triệu chứng khác nhau, lúc phụ nữ dễ dàng nhận Trên thực tế việc chẩn đốn chí cịn khó khăn bác sĩ có kinh nghiệm Các trường hợp nhiễm trùng nặng bác sĩ định điều trị kháng sinh phổ rộng với liều cao nên gây tác dụng phụ chán ăn, mệt mỏi, ảnh hưởng tới sinh hoạt tình dục… điều trị tái lặp dẫn tới tình trạng kháng thuốc kháng sinh, vấn đề cộm thách thức Để phòng ngừa hỗ trợ điều trị bệnh nhiễm trùng đường sinh sản, nhiều nghiên cứu cho thấy việc sử dụng chế phẩm probiotics chứa chủng lợi khuẩn Lactobacillus spp hiệu Các sản phẩm probiotics dành cho phụ nữ bắt đầu sử dụng phổ biến dạng sản phẩm chức hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân nhiễm trùng đường âm đạo tiết niệu Các sản phẩm thương mại bán nhiều thị trường Việt Nam phần lớn hàng nhập từ Mỹ, Anh, Nhật Bản với giá thành cao Việt Nam chưa có dịng sản phẩm nghiên cứu phát triển dành riêng cho phụ nữ Sản phẩm nhập ngoại chưa hoàn toàn phù hợp với điều kiện thu nhập thấp người dân Việt Nam, đặc biệt phụ nữ vùng nơng thơn miền núi Trong đó, 80% phụ nữ Việt Nam bị mắc bệnh phụ khoa Chính vậy, việc nghiên cứu sản xuất số chế phẩm probiotics từ Lactobacillus spp phân lập sữa mẹ bà mẹ cho bú Việt Nam có đặc tính ưu việt việc ức chế vi sinh vật gây viêm nhiễm phụ khoa việc làm cần thiết, có ý nghĩa cộng đồng ý nghĩa thực tiễn cao Dựa nhu cầu tính cấp thiết vấn đề nêu nên thực đề tài “Phân lập tuyển chọn chủng Lactobacillus spp có hoạt tính probiotic để sản xuất thực phẩm chức nhằm nâng cao sức khỏe sinh sản cho phụ nữ” Hiện nay, cịn tài liệu cơng bố liên quan đến xuất Lactobacilli Lactobacillus reuteri sữa mẹ Việt Nam Chính thế, nghiên cứu thực để điều tra xuất nhóm vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus spp loài L reuteri sữa mẹ, xác định mối liên hệ có có mặt L reuteri sữa mẹ bà mẹ vùng nông thôn thành thị miền Bắc Việt Nam nghiên cứu đặc tính probiotic chủng Lactobacillus spp tuyển chọn để hướng tới việc sản xuất chế phẩm probiotics dành cho phụ nữ Mục tiêu đề tài: - Xác định tỉ lệ Lactobacillus spp L reuteri có sữa mẹ bà mẹ sống khu vực nông thôn thành thị số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam tuyển chọn chủng Lactobacillus spp có hoạt tính probiotic tốt - Xác định cơng thức phối trộn để nâng cao mật độ sống sót sau q trình đơng khơ chủng tuyển chọn CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Probiotic 1.1.1 Khái niệm probiotic Theo ngơn ngữ Hy Lạp, probiotic có nghĩa “dành cho sống” có số nghĩa khác theo thời gian Khái niệm sử dụng lần Lilley Stillwell vào năm 1965 để mô tả chất tiết loại vi sinh vật kích thích phát triển loại vi sinh vật khác Do vậy, khái niệm có nghĩa ngược lại hồn tồn với “antibiotic – kháng sinh” Tuy nhiên, việc sử dụng khái niệm probiotic khơng tồn sau Sperti sử dụng để mô tả chất chiết xuất từ mơ kích thích phát triển vi sinh vật năm 1971 Mãi đến năm 1974, Parker sử dụng probiotic để vi sinh vật vi khuẩn hay nấm men mà thêm vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể sinh vật đường ruột sinh vật chủ Định nghĩa liên quan đến việc sử dụng probiotic vào hệ vi sinh đường ruột bao gồm “các chất phụ khác” cho probiotic nghĩa rộng bao gồm kháng sinh Trong việc nỗ lực cải thiện định nghĩa, năm 1989 Fuller định nghĩa lại probiotic chất (có bổ sung vi sinh vật sống) ảnh hưởng có lợi cho sinh vật chủ cách cải thiện cân vi khuẩn đường ruột sinh vật chủ Định nghĩa sửa đổi nhấn mạnh cần thiết probiotic [38] Hiện nay, chế phẩm probiotics hiểu chế phẩm có chứa vi sinh vật sống, đưa vào thể lượng đầy đủ có lợi cho sức khỏe, đặc biệt hệ tiêu hóa [80], [48], [82] Trên thực tế, thể người bao gồm vi khuẩn có lợi có hại Vi khuẩn có lợi thường khơng gây bệnh giúp kìm hãm vi khuẩn có hại, giúp cải thiện tiêu hóa hấp thu dinh dưỡng tăng cường khả miễn dịch Probiotics coi an toàn để tiêu thụ gây tương tác vi khuẩn & sinh vật chủ tác dụng phụ không mong muốn trường hợp gặp [31], [90], [32] Khi vi khuẩn có hại thể lấn át vi khuẩn có lợi, lúc cần sử dụng chế phẩm sinh học probiotics để lấy lại cân khu hệ vi sinh vật thể 1.1.2 Probiotic phổ biến – Lactobacillus spp Lactobacillus spp thường xem loại probiotics phổ biến Lactobacilli chi vi khuẩn Gram dương, kị khí vi hiếu khí, hình que, khơng hình thành bào tử [57] Chúng phần nhóm vi khuẩn lactic (tức là, chúng chuyển đổi đường thành axit lactic) Mơi trường sống chủ yếu có chứa carbohydrate (lớp chất nhầy người động vật, chất thải thực phẩm lên men hay hư hỏng) Ở người, chúng tạo thành phần quan trọng hệ vi sinh vật số vị trí thể, chẳng hạn hệ tiêu hóa, hệ tiết niệu hệ thống sinh dục Ở phụ nữ châu Âu, loài thuộc chủng Lactobacillus spp thường phần hệ vi sinh vật âm đạo [53], [36] Hình Hình thái sinh vật Lactobacillus tế bào biểu mô âm đạo (ảnh nhuộm Gram) [64] L reuteri loài vi khuẩn Gram dương, chúng tìm thấy ruột động vật có vú, chim, sữa mẹ dịch âm đạo người Chúng loài probiotic ứng dụng từ lâu có khả sinh reuterin - chất có khả ức chế phát triển số vi khuẩn Gram âm Gram dương có hại với nấm men, nấm động vật nguyên sinh [126] L reuteri giúp thể chống lại nhiều bệnh nhiễm trùng thông thường, thúc đẩy sức khoẻ tổng thể trẻ em người lớn Với đặc tính hữu ích vốn có lồi này, việc tuyển chọn L reuteri nghiên cứu để sản xuất thực phẩm chức probiotics định có tiềm việc bảo vệ sức khỏe người nói chung cho sức khỏe sinh sản phụ nữ nói riêng 1.2 Vai trị vi khuẩn probiotic Việc trì ổn định hệ vi khuẩn đường ruột có vai trị quan trọng bảo vệ sức khỏe phịng ngừa bệnh tật Vai trị vi khuẩn probiotic giúp cho hệ VSV đường ruột khỏe mạnh, ngăn cản thâm nhập phát triển VSV gây bệnh, tăng cường đề kháng tự nhiên với bệnh truyền nhiễm đường tiêu hóa Vai trị thể số biểu cụ thể sau 1.2.1 Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa Sự sống sót vi khuẩn probiotic phần khác đường tiêu hóa thường khác lồi Khi tập trung khoang ruột, chúng tạo nên cân tạm thời hệ sinh thái đường ruột, thay đổi nhận thấy vài ngày sau bắt đầu tiêu thụ chế phẩm probiotics, phụ thuộc vào công dụng liều lượng chủng vi khuẩn Kết với tiêu thụ thường xuyên vi khuẩn probiotic định cư cách tạm thời ruột, chấm dứt tiêu thụ số lượng vi sinh vật probiotic giảm xuống Điều cho tất loại vi khuẩn probiotic [115] Vi khuẩn probiotic tạo chất đa dạng gồm có axit hữu gồm axit béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu acetate, propionate butyrate, axit lactic, hydrogen peroxide (H2O2) chất diệt khuẩn ức chế khuẩn Gram (+) Gram (-) Cụ thể hợp chất làm giảm pH khoang ruột gây ảnh hưởng đến q trình điều hịa hoạt động trao đổi chất vi khuẩn đường ruột thông qua việc cản trở hoạt động tiết enzyme tạo độc tố vi khuẩn gây hại đường ruột [107], [93], [70], [119] Hình Tương tác vi sinh vật đường ruột [35] Chú thích: Các mầm bệnh độc tố vi sinh vật gây hại kết dính vào màng nhầy, cụ thể thụ thể đường ruột phá hủy Khi thể bổ sung vi khuẩn probiotic, phản ứng miễn dịch kích thích hoạt động kháng thể tế bào chủ tăng lên Vi khuẩn probiotic cạnh tranh chất dinh dưỡng quan trọng với mầm bệnh Loại trừ cách cạnh tranh/ ngụy trang: vi khuẩn probiotic khóa thụ thể bên đường ruột làm cho mầm bệnh khơng bám vào được, loại trừ mầm bệnh Sự tập hợp vi khuẩn probiotic gây cản trở gắn kết tăng sinh mầm bệnh Các vi khuẩn probiotic ngăn chặn bám dính vào đường ruột cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sống sót VSV gây bệnh phổ biến Salmonella Shigella Cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, tăng cường vi khuẩn có lợi giảm số lượng vi khuẩn gây hại mang mầm bệnh Cuối điều chỉnh thành phần phân bố vi khuẩn đường ruột [115] 1.2.2 Khả chống ung thư yếu tố đột biến Nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn probiotic làm giảm nguy ung thư ruột kết ung thư bàng quang Ngồi cịn có tác dụng khử chất độc gây ung thư có thể làm chậm phát triển khối u bướu Cơ chế nghiên cứu kết luận sau [29] + Nhờ gắn kết phân hủy chất gây ung thư + Sản xuất hợp chất kháng ung thư: sinh axit yếu có lợi cho đường ruột axit butyric có vai trò giảm tạo chất gây ung thư đường ruột kích thích tế bào niêm mạc ruột bị tổn thương màu lành phục hồi chức + Điều hịa enzyme nitroreductase, ß-glucuronidase (các enzyme có khả chuyển chất tiền sinh ung thư thành chất gây ung thư trực tràng) + Ức chế khối u chế đáp ứng miễn dịch Tuy nhiên, vấn đề cịn giới hạn mơ hình in-vitro in-vivo, việc mở rộng người để dự phòng ung thư cịn vấn đề tranh cãi Hình Các chủng vi khuẩn probiotic chế chống lại bệnh ung thư [29] 1.2.3 Tác động biểu mô ruột Vi khuẩn probiotic xem phương tiện phân phát phân tử kháng viêm cho đường ruột Cụ thể đẩy mạnh báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm, tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn ngừa tiêu chảy táo bón Vi khuẩn probiotic giúp đẩy mạnh liên kết chặt tế bào biểu mơ; giảm việc kích thích tiết & hậu bị viêm gây lây nhiễm vi khuẩn đẩy mạnh việc tạo phân tử phịng vệ chất nhầy [102] Hình Cơ chế hoạt động probiotic thúc đẩy cân nội môi liên quan đến khả ứng dụng bệnh viêm ruột [102] Vi khuẩn probiotic hỗ trợ điều hịa cân nội mơi tế bào chủ Vi khuẩn probiotic gây số phản ứng có lợi cho tế bào chủ, bao gồm: ngăn chặn tác động vi khuẩn gây bệnh cách sản xuất chất kháng khuẩn (Antibacterial substance) cạnh tranh với mầm bệnh để liên kết với tế bào biểu mô; xác định cân khả miễn dịch cần thiết khả miễn dịch phòng vệ mức cách tăng khả miễn dịch bẩm sinh (innate immunity), điều chỉnh tăng sản xuất cytokine chống viêm ức chế sản xuất cytokine tiền viêm; thúc đẩy cân nội môi tế bào biểu mô ruột cách tăng tỉ lệ sống, chức rào cản phản ứng bảo vệ bên tế bào chất (survival, barrier function and cytoprotective responses) DC, dendritic cell; IL, interleukin; M, Mcell; Hsp, heat shock protein [102] 1.2.4 Kích thích hệ thống miễn dịch Thực phẩm chức probiotics góp phần cải thiện hệ thống miễn dịch thể, giúp tăng cường hàm lượng globulin Sự hấp thụ thực phẩm chức probiotics người ốm trẻ nhỏ cải thiện rõ rệt sức đề kháng thể, giúp tăng cường hiệu số vắc xin vắc xin thương hàn [113] Những cải thiện hệ miễn dịch vi khuẩn probiotic trình bày theo cách sau: tăng cường hoạt động đại thực bào, nâng cao khả thực bào sinh vật hay hạt carbon; tăng khả sản xuất kháng thể thường IgM, IgA interferon (nhân tố kháng vi rút không đặc hiệu); tăng cường khả định vị kháng thể bề mặt ruột thường IgA [113] 1.2.5 Cải thiện việc sử dụng lactose người không dung nạp lactose Sự khơng dung nạp đường lactose (có nhiều sữa) xảy phổ biến nhiều người, gây đầy hơi, khó tiêu hấp thu thực phẩm có chứa đường lactose Nhiều nghiên cứu cho thấy số chủng vi khuẩn lên men axit lactic sản phẩm sữa lên men cải thiện triệu chứng kháng đường lactose thể cách cung cấp lactase cho dày đường ruột Sử dụng thực phẩm có chứa chủng vi khuẩn probiotic giúp cải thiện rõ rệt khả tiêu hóa đường lactose [88] 1.2.6 Làm giảm cholesterol huyết hạn chế bệnh liên quan đến tim mạch Vi khuẩn probiotic biết có vai trị sản xuất axit hữu cơ, làm giảm axit béo, có tác dụng làm giảm nồng độ cholesterol huyết thanh, làm giảm huyết áp cao [73, 109] Các nghiên cứu vi khuẩn Lactobacilli Bifidobacterium khơng sinh axit hữu mà cịn trực tiếp sử dụng lipid thành phần cholesterol máu [83] 1.2.7 Khả chống dị ứng Thực phẩm chức probiotics góp phần chống lại số dị ứng thể cung cấp nhiều chất quan trọng cho thể (ví dụ axit folic, niacin, riboflavin, vitamin B6 B12) [76], [75], [114] 1.2.8 Phòng ngừa điều trị viêm nhiễm phụ khoa phụ nữ Việc sử dụng thực phẩm chức probiotics chứa lợi khuẩn phổ biến rộng rãi tồn giới Ngồi vai trị kể trên, thực phẩm chức probiotics giành riêng cho phụ nữ cịn góp phần phịng ngừa điều trị viêm nhiễm phụ khoa Các nghiên cứu in-vitro số chủng Lactobacillus spp ức chế gắn kết Gardnerella vaginalis với biểu mô âm đạo tạo H2O2, axit lactic chất kháng khuẩn ức chế phát triển vi khuẩn gây nhiễm trùng âm đạo Các thử nghiệm lâm sàng cho thấy đặt viên nén chứa L acidophilus âm đạo - 12 ngày hay uống L acidophilus L rhamnosus GR-1 L fermentum RC-14 tháng giúp chữa trị làm giảm tái phát nhiễm khuẩn âm đạo đồng thời giúp gia tăng lượng Lactobacilli âm đạo phục hồi hệ vi sinh âm đạo khỏe mạnh cách thường xuyên dùng thuốc tạm thời (axit axetic) không điều trị [34] Mastromarino cộng tiến hành nghiên cứu xác định hiệu viên nén đặt âm đạo chứa Lactobacillus điều trị nhiễm khuẩn âm đạo việc khôi phục hệ vi sinh vật âm đạo khỏe mạnh 39 phụ nữ ghi tên vào thử nghiệm lâm sàng đánh giá hiệu tác động viên nén Lactobacillus lên vi sinh vật âm đạo so sánh với nhóm sử dụng giả dược Sản phẩm định dùng liên tục ngày Các số lâm sàng, điểm số Gram âm đạo triệu chứng so sánh với người lần khám đầu tiên, người hoàn thành điều trị tuần sau Sau hồn thành điều trị, tất bệnh nhân nhóm sử dụng Lactobacillus (n = 18) khơng nhiễm khuẩn âm đạo, cho thấy hệ vi sinh vật âm đạo khỏe mạnh (83%) ngưỡng trung gian (17%) Ngược lại, có bệnh nhân khơng nhiễm khuẩn âm đạo, hệ vi sinh vật âm đạo khỏe mạnh (12%) số 16 phụ nữ điều trị giả dược (p < 0,001) Hai tuần sau hoàn thành điều trị, việc điều trị thành công với 61% số bệnh nhân điều trị Lactobacillus so với 19% số bệnh nhân điều trị thành công điều trị giả dược (p < 0,05) Trong nhóm điều trị, tổng số bệnh nhân có triệu chứng cường độ triệu chứng nhiễm khuẩn âm đạo đặc biệt viêm âm đạo giảm đáng kể hai lần theo dõi Các liệu cho thấy bổ sung chủng Lactobacillus ngoại sinh lựa chọn khơi phục lại hệ vi sinh vật âm đạo khỏe mạnh sử dụng điều trị viêm nhiễm âm đạo phụ khoa [60] Chế phẩm probiotics chứa loài L rhamnosus L reuteri bác sĩ định hỗ trợ điều trị nhiễm khuẩn âm đạo kê đơn dạng thực phẩm chức sử dụng qua đường uống với kháng sinh metronidazole (thuốc thuộc nhóm kháng sinh nitroimidazole, hoạt động cách ngăn chặn tăng trưởng vi khuẩn động vật nguyên sinh Kháng sinh có hiệu xử lý với nhiễm khuẩn protozoa đường âm đạo) Kết cho thấy số lượng Lactobacillus phát nhiều đáng kể bệnh nhân điều trị metronidazole kết hợp với probiotic so với bệnh nhân điều trị với metronidazole ngày [105] Theo nghiên cứu vi khuẩn âm đạo phụ nữ lồi Lactobacillus chiếm đa số vi sinh vật có lợi âm đạo phụ nữ khỏe mạnh Các loài G vaginalis, Prevotella, Atopobium, Sneathia Megasphaera thường gặp phụ nữ nhiễm khuẩn âm đạo điều trị tinidazole (Tinidazole thuốc kháng sinh nhóm nitroimidazole Thuốc hoạt động cách ngăn chặn tăng trưởng vi khuẩn sinh vật đơn bào) Khi kết hợp điều trị kháng sinh kèm với chế phẩm probiotics có chứa chủng L reuteri RC-14 L rhamnosus GR-1 sử dụng qua đường uống, số lượng L iners L crispatus gia tăng mạnh âm đạo phụ nữ với khả phục hồi cân nội mô dẫn đến việc sử dụng kết hợp chế phẩm probiotics kháng sinh điều trị nhiễm khuẩn âm đạo đem lại hiệu cao Điều chứng tỏ khả khơi phục cân nội mơi có liên quan đến việc sử dụng kết hợp chế phẩm probiotics với điều trị kháng sinh việc nhiễm khuẩn âm đạo [55] Trong nghiên cứu khác “Tác động chế phẩm Probiotic SYNBIO đặt âm đạo việc thúc đẩy sức khỏe âm đạo phụ nữ” cho thấy việc sử dụng chế phẩm probiotics Lactobacillus dạng viên nang đặt âm đạo làm gia tăng vi khuẩn có lợi, giúp chúng chiếm tồn âm đạo Việc sử dụng chế phẩm sinh học probiotics dạng thuốc đặt âm đạo thực 35 phụ nữ khỏe mạnh nghiên cứu Maria cộng Mỗi phụ nữ kiểm tra ba lần trình nghiên cứu Người tình nguyện hướng dẫn nhận sử dụng thuốc đặt SYNBIO (L rhamnosus IMC 501 L paracasei IMC 502) ngày trì ngày Các miếng gạc âm đạo thu thập lần, lần cách ngày sau sử dụng SYNBIO để xác định số lượng lactobacilli có mặt, giá trị pH chẩn đoán viêm nhiễm phụ khoa dựa vào thang điểm Nugent phụ thuộc hình thái vi khuẩn tiêu nhuộm Gram (quan sát 10 hiển vi trường) chẩn đoán xác định viêm nhiễm phụ khoa đạt từ đến 10 điểm [69] Khi đánh giá khả dung nạp điều trị dựa phân tích loại xuất tác dụng bất lợi, kết cho thấy thuốc đặt âm đạo probiotic dung nạp tốt tác dụng phụ báo cáo Điểm số Nugent ngưỡng trung gian ghi chép lại 40% phụ nữ lần khám thứ điểm 10 ngưỡng trung gian trở lại bình thường vào ngày thứ (kết thúc điều trị) 20% phụ nữ tham gia SYNBIO góp phần làm tăng đáng kể lượng Lactobacilli lần khám thứ Các kỹ thuật sinh học phân tử cho thấy diện hai chủng có nguồn gốc từ SYNBIO 100% phụ nữ khám lần 34% đến thăm khám lần Khơng có thay đổi đáng kể ghi nhận độ pH lần thăm khám Sản phẩm SYNBIO an toàn cho việc sử dụng hàng ngày phụ nữ khỏe mạnh hữu ích để khơi phục trì hệ vi khuẩn âm đạo khỏe mạnh [103] 1.3 Cơ chế kháng khuẩn âm đạo cân hệ vi sinh đường sinh dục phụ nữ sử dụng thực phẩm chức probiotics 1.3.1 Sinh H2O2 H2O2 chất oxy hóa mạnh Các nghiên cứu cho thấy chất giống O2- hay OH- có khả gây tổn thương cao tham gia vào phản ứng Fenton Chúng gây tổn thương cấu trúc chức đại phân tử tế bào protein, ADN, lipid…dẫn đến gây chết mạnh vi khuẩn [86] Một số chủng Lactobacillus tìm thấy có tác dụng ức chế phát triển VSV gây bệnh âm đạo ống nghiệm cách sản xuất tạo H 2O2 Mastromarino nhóm cộng nghiên cứu L salivarius FV2 L gasseri 335 phân lập từ âm đạo người phát thấy chúng sản xuất lượng lớn H 2O2 ức chế tăng trưởng G vaginalis [60] McLean Rosenstein chứng minh L acidophilus 48101 phân lập từ âm đạo phụ nữ khỏe mạnh sản xuất lượng lớn H2O2 ức chế tăng trưởng Bacteroides spp., Prevotella bivia G vaginalis lập từ gạc âm đạo phụ nữ nhiễm khuẩn âm đạo [62] Mặc dù có nhiều nghiên cứu chứng minh Lactobacilli sản xuất H2O2 bảo vệ cho đường sinh dục nữ khỏi nhiễm trùng quan điểm cho H2O2 yếu tố kháng khuẩn sản xuất Lactobacillus phổ biến nghiên cứu in-vitro khác lại chứng minh H 2O2 tạo Lactobacillus nguyên nhân gây ức chế tác nhân gây bệnh Các Lactobacillus sản xuất H2O2 làm tăng khả hoạt động chuỗi peptide kháng khuẩn vật chủ (muramidase lactoferrin) hoạt tính kháng khuẩn tế bào biểu mơ [11] 1.3.2 Sinh axit lactic Không giống với H2O2, tác dụng ức chế vi khuẩn gây bệnh đường âm đạo axit lactic chứng minh rõ ràng Axit lactic nồng độ sinh lý (ví dụ: 110 mM) chí pH 4,5 làm giảm 106 lần khả tồn 17 loại vi khuẩn 11 khác gây viêm nhiễm âm lại khơng ảnh hưởng đến khả tồn bốn loài Lactobacillus spp âm đạo nghiên cứu in-vitro Đáng ý hoạt tính kháng khuẩn axit lactic có cường độ lớn chất axit hóa đến pH 4,5 axit chlohydric axit axetic [70] Ngoài ra, gần điều kiện exvivo, axit lactic sử dụng đơn lẻ khơng kết hợp với bacteriocin có hiệu kháng vi khuẩn gây viêm nhiễm đường sinh dục nữ [30] Một số nghiên cứu chứng minh axit lactic có tác dụng chống lại bệnh vi khuẩn gây bệnh nhiễm trùng qua đường tình dục (Sexually Transmitted Infections- STIs) khơng phải H2O2 Axit lactic sinh L crispatus L gasseri làm bất hoạt Chlamydia trachomatis [67] Neisseria gonorrhoeae [45] Axit lactic sản xuất L crispatus chứng minh có tác dụng ức chế N gonorrhoeae G vaginalis mơ hình niêm mạc âm đạo lợn [20] Tóm lại, nghiên cứu in-vitro ex-vivo cho thấy axit lactic sản sinh chủng probiotic thuộc chi Lactobaciilus có khả trì hệ vi sinh vật âm đạo bảo vệ vi khuẩn chống lại bệnh nhiễm trùng qua đường tình dục 1.3.3 Sinh tổng hợp chất kháng khuẩn Bacteriocin có chất protein chuỗi peptide sản xuất vi khuẩn để ức chế phát triển chủng vi khuẩn tương đồng chủng vi khuẩn có liên quan chặt chẽ với chủng Chúng tương tự yếu tố diệt nấm men paramecium, chúng đa dạng cấu trúc, chức sinh thái học Các ứng dụng bacteriocin thử nghiệm để đánh giá ứng dụng chúng kháng sinh phổ hẹp [28] Bacteriocin lần André Gratia phát năm 1925, có hàng ngàn loại bacteriocin nghiên cứu Ông tham gia vào trình tìm kiếm cách để tiêu diệt vi khuẩn, điều dẫn đến phát triển kháng sinh phát bacteriophage, tất vài năm Ông gọi chất kháng khuẩn phát colicine chất có khả giết chết E coli [44] Việc sản xuất chất kháng khuẩn số Lactobacillus tìm thấy với vai trị ức chế tăng trưởng G vaginalis, ống nghiệm Aroutcheva cộng kiểm tra 22 chủng Lactobacillus nhận thấy 80% số chủng sản xuất loại độc tố ức chế phát triển G vaginalis [15] Trong nghiên cứu khác, Simoes cộng phát thấy tăng trưởng 28 trường hợp (78%) số 36 trường hợp lâm sàng nhiễm G vaginalis bị ức chế vi khuẩn L acidophilus chủng nhạy cảm với bacteriocin sinh vi khuẩn [89] 12 ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thanh Hiền PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG Lactobacillus spp CĨ HOẠT TÍNH PROBIOTIC ĐỂ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG NHẰM... NHẰM NÂNG CAO SỨC KHỎE SINH SẢN CỦA PHỤ NỮ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Bùi Thị Việt Hà Hà Nội - 2020 LỜI CẢM ƠN Để. .. chung sức khỏe sinh sản phụ nữ 13 1.5 Một số loại thực phẩm chức probiotics thương mại dùng cho người 14 1.5.1 Một số loại thực phẩm chức probiotics dành riêng cho phụ nữ thương