Khóa luận tốt nghiệp Nông học: Xác định thành phần chất điều hòa sinh trưởng phù hợp cho quá trình nhân giống in vitro dòng mai vàng HD01 (Ochna integerrima (Lour.) Merr.)

Hiện nay, tại Việt Nam và trên thế giới, mặc dù đã có một số thành công trong nhân giống in vitro đối với cây hoa mai, nhưng mỗi dòng,mỗi giống mai lại cần phải được tinh chỉnh, tối ưu h

TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM TP HO CHÍ MINH

KHOA NONG HOC

RRR

KHOA LUAN TOT NGHIEP

XÁC ĐỊNH THÀNH PHAN CHAT DIEU HÒA SINH TRUONG

PHU HỢP CHO QUÁ TRÌNH NHÂN GIONG IN VITRO DONG

MAI VANG HD01 (Ochna integerrima (Lour.) Merr.)

SINH VIEN THUC HIEN : NGO THI HONG CAMNGANH : NONG HOC

KHOA : 2019 — 2023

Thanh phố Hồ Chi Minh, tháng 08/2023

XÁC ĐỊNH THÀNH PHAN CHAT DIEU HÒA SINH TRUONG

PHÙ HỢP CHO QUA TRÌNH NHÂN GIONG IN VITRO DONG

MAI VANG HD01 (Ochna integerrima (Lour.) Merr.)

Tac gia

NGO THI HONG CAM

Khoá luận được đệ trình dé đáp ứng yêu cầu

LỜI CẢM ƠN

Con xin cảm ơn Ba Mẹ và Gia Đình luôn bên cạnh, ủng hộ và động viên con cũng như cô găng tạo mọi điêu kiện thuận lợi đê con vững tin, an tâm thực hiện ước mơ của mình.

Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thành phó

Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện, cơ hội môi trường dé học tập và rèn luyện

Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các Thầy Cô Khoa Nông học đã giảng dạy và tạođiều kiện cho em học tập rèn luyện Những kiến thức mà Thầy Cô đã dạy sẽ là hành

trang cho các chặng đường phía trước.

Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến Thầy Bùi Minh Trí và Thầy Nguyễn CaoKiệt, đã tận tình hướng dẫn, hết lòng truyền đạt cho em những kinh nghiệm trong nghiêncứu khoa học, luôn động viên, quan tâm và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập vathực hiện khóa luận tốt nghiép

Em xin gửi lời cảm ơn đến Bộ môn Sinh Lý — Sinh Hóa đã hỗ trợ vật tư, hóa chất,thiết bị để em có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin gửi lời cảm ơn đến kỹ sư Bùi Ngọc Đức (Vườn mai Hữu Đức) đã hỗ trợnguồn giống cũng như đã chia sẻ kinh nghiệm, kiến thức về cây mai trong quá trình thựchiện khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến anh Thanh Hậu đã luôn cho em những lờikhuyên và chia sẻ kinh nghiệm cũng như kiến thức để thực hiện khóa luận, cảm ơn cácbạn Minh Kha, Nhật Tân, Thành Trung và các em Tan An, Công Hiếu, Lê Lam, HoàngTan đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Xin chân thành cảm on!

Tp Hồ Chí Minh, thang 8 năm 2023

Sinh Viên

Ngô Thị Hồng Cẩm

li

TÓM TẮT

Đề tài “Xác định thành phần chất điều hòa sinh trưởng phù hợp cho quá trình nhângiống in vitro dòng mai vàng HDO1 (Ochna integerrima (Lour.) Merr.).” đã được tiễnhành tại phòng nuôi cấy mô thuộc khu thực nghiệm Bộ môn Sinh lý — Sinh hóa, KhoaNông học, Trường Dai học Nông Lâm TP Hồ Chi Minh từ tháng 2/2023 đến thang

8/2023 Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định được nồng độ BA và NAA trên nền

môi trường MS có bổ sung nước dừa cho sự tái sinh chéi từ mô seo dòng mai vàngHDOI, xác định được nồng độ IBA phù hợp đến khả năng tạo rễ của dòng mai vàng

HD0I.

Nghiên cứu được tiến hành với 2 thí nghiệm Trong đó, thí nghiệm 1 là thí nghiệmkhảo sát nồng độ BA và NAA trên nền môi trường MS có bổ sung nước dừa đến khảnăng tái sinh chồi của dòng mai vàng HD01 từ mô sẹo, được bố trí theo kiểu hoàn toànngẫu nhiên hai yếu tố gồm 12 nghiệm thức và 3 lần lặp lại Các mức nồng độ BA gồm:

0 mg/L; 1 mg/L; 2 mg/L; 3 mg/L Các mức nồng độ NAA gồm: 0 mg/L; 0,25 mg/L; 0,5mg/L Thí nghiệm 2 là thí nghiệm khảo sát nồng độ IBA đến khả năng tạo rễ của dòngmai vàng HD01, được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố gồm 6 nghiệmthức va 3 lần lặp lại Các mức nồng độ IBA gồm: 0 mg/L; 0,5 mg/L; 1 mg/L; 1,5 mg/L;

2 mg/L; 2,5 mg/L.

Kết quả thi nghiệm dat được là ở môi trường MS + agar 7 g/L+ đường 30 g/L có

bồ sung (1 mg BA/L + 0,25 mg NAA/L) thích hợp cho việc nhân chéi mai vàng in vitro.Trong điều kiện thí nghiệm này, số chỗồi hình thành cao nhất (8,31 chdi), chiều cao cumchồi (1,94 em) và số lá (9,57 lá) ở 50 NSC

Qua các thí nghiệm cho thấy để tạo cây hoàn chỉnh, môi trường MS 1/2 + đường

30 g/L + agar 7 g/L + than hoạt tính 0,3 g/L có bổ sung IBA với nồng độ 1 mg/L cho

hiệu quả tốt nhất Kết quả chỉ ra rằng trong điều kiện này, số rễ hình thành nhiều nhất(1,97 rễ/cây) với chiều cao cây (1,82 em) và số lá (4,0 lá) ở thời điểm 50 NSC

Từ các kết quả trên, dé tài đã đề xuất được một quy trình nhân giống đối với dòng

mai vàng HDO1.

ili

MỤC LỤC

Trang T5 KTDĩiL̓cccserEacfoivEnoiftoroteoftoituitsiBtnestaBuiiBriroidtEisistoieEtitiokiiESPniiebiiytiogiiSgi0ggiosiviaidgonifrduiziofdsintSaq22evDa 1 lUỠI CAI Ủ x66166115615515 1501541358558 013813431580154H51613033E311331583881385093383g3159151805615021100E01X3ESG01VE403384GE588 1

¡oi iiiDanh peter eR II asec don ceases ces etanenetimnnsyisasoieanpentsciasianenonlstineneierionnt vil

IP)0i01J(0u vá NA" Vill Dai Sach: cáo, HINH gsrenttbiigsitGiESAIDHGRGIGGENIEIERHGISRSIIHSHIGSHERHGHENGSRIIGHREIiGSiStuNRG Vili

CF 0) OS 08 0) OR ixDog) - S—SẶ-=ẶTẶẶ—ẶĂẰẴẮ TT ẶẰẴẰ— ẪằẮẶ———— 1

NHI TEU hHI1ẾH: GUN scares scaccuss ne momseseeemascmaecmus maeusasaeas eure ERRATA 2

ee 5S8 KG“ 2

Chung Vane eee 3

TONG QUAN TÀI LIỆU -2- 2-5255 SS22E92122122522522122121221212121212121 212 xe 3

1.1 So luge cay mal Vang 1.1.1 08s v0 cv e<

1.1.2 Phân bố ở Việt Nam - 2 2+ +E+EE+EE2EEEEE 2E EEEErrerrrrrxeeT

1.1.3 Đặc điểm hình thái cây mai vàng -2-©22©222222222E22E22EzEerErrrrrrrree 4

1.1.1 Yêu cầu sinh thái cây mai vàng 2-22 +2S2E22EE22E22EE22E22222EzErcrree 4

1„1.2 (Giá trị sữ:dung›ocậy: mia VẴTĐs‹-ssssssesssssanridsnasiddESSdLangd0Esu0 0168000080080 46176617000 06 0b8015Ó 5

1.2 Nuôi cấy mô tế DAO ooo eeeeccecc ccc ccsecsessessesseesseseseesesseesssessessesessesseesessessessesseeseeseeees 5

[ONG KHI ite) eee tee ee 98 5

1.2.2 Cơ sở của nuôi cấy 01087) A1001 6

1V

1.2.2 Ưu và nhược điểm của kỹ thuật nhân giống vi/ro -2:5z55¿ 71.2.3 Các bước trong nhân giống vô tính 7 vi/r0 -2¿©-¿222+2s+22+zzz>zzsc+2 81.2.4 Một số kiểu tái sinh trong nuôi cấy i7 Vi/FO 2+ 2+5s+22++s+£xc£zsrxerxrsee 91.2.5 Một số chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô 2-5 10

122.0 NUP) GÌ đannganoibienbiebtidnoipOSD9S3900SBBSBG2ĐSIGG583/1909EG4DH/GESHiGSMBĐSEGRBSISGGBHSBHSSRBSELEIGOESSE 11 1.3 Một sô nghiên cứu liên quan đên nhân giông in vitro mai vàng và các cây cùng

HỢ bess eeeeesege tein seen seer eee ne eseceeereceearee eure ease ee een eee cerns 12

1.3.1 Một số nghiên cứu ngoài nước về nhân giống in vitro cây mai vàng 121.3.2 Một số nghiên cứu trong nước về nhân giống in vitro cây mai vàng 13

00 7 14

VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2-22¿522222+22zz25+2 14

ZL, NGL NUHE TÍEHIỂTĨ CU ccosssessdesigo18038508100.09586.0581935L30G856005980800100859800ỢH8S424G129530380883300880000 14

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2- 2-22 ++22222++EE££EE+EEtZEEerxerxrrrrrree 142.3 Điều kiện thí SS) 1) ee ee ce 14

2:4: Vat LOU srsccperccenarecer arse eee oe eee SS 252.4.1 Mẫu 161g occ ecccccecceeeseseesesseseesssssenseeiesssesssssseesussisstsessisetsiesssesseseeeseeenees 25

2.4.2 Môi trường nuôi cấy co ban sử dụng trong thí nghiệm - 252.4.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa Chat ccccecccccecsessessessessessessessessessessessessessesseeaeeaes 27

2.5 Phương phap thí ñghiỆẰ ‹:‹-:::‹‹::: ::::::sc6iz2i2c1202 1650100710 14806101 L0 G01 161300110186 58158186 2]

2.5.1 Thí nghiệm 1: Khao sát nồng độ của sự kết hợp BA va NAA đến qua tái sinhchồi dong mai vàng HDO1 (Ochna integerrima (Lour.) Merr.) từ mô seo 272.5.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ IBA đến quá trình tạo rễ

của dòng mai vàng HDO1 (Ochna integerrima (Lour.) Merr.) 29

2.6 Phương pháp xử ly và thống kê số liệu 2 22 222zzzzzszzzzzzszzszcszcse-x-3 Í

CHƯƠNG 3 scesexcorssasessesenmeremavmemnnccmmenem erm cE

KET QUA VA THẢO LUAN 2-22 22222222222222122112211221122112211 22122122 xe 32

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp BA và NAA đến quá tái sinh chồi dong mai

vàng HD0O1 (Ochna integerrima (Lour.) Merr.) từ mô sẹo - -.3⁄2

3.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA va NAA đến chiều cao cụm chỗi trong quá trìnhtái sinh chồi dong mai vàng HD01 từ mô sẹo -2-22©22255222222222z22522 323.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA va NAA đến số chồi trong quá trình tái sinh chéi

dong mat vàng HDO] TỪ THÔ S00: snsecinseieoesesssiissssEsgiSEGEku2s661662/50680000083041290038368-5830 34

3.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến số lá trong quá trình tái sinh chéi

dong mai vàng HDO1 từ m6 SẹO - 12121 12 2 TH HH HH re 37

3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ IBA đến quá trình tạo rễ của dòng mai vàng

HDO1 (Ochna inteserrima (Lout.) MERE) scissseseeendkdiilnid Sa ta 1808s100155338 1831303881488 38

3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến thời điểm hình thành rễ và chiều cao dòng

Tmaii WATE ELON, S00 VLPs conte ttn SE IE 39

3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến số lá dòng mai vàng HDO1 in vitro 413.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến số rễ và chiều dài rễ dòng mai vàng HD01

[TRIRDTTTRlÏtusencoditigBosgidiiifbbiliggsEkdtludikugaosuidtGSinboiasvBtcbssghäRaianbsatifialsoitiElfnuskautofutiftagioRossauaBlSnastiasRlasrasdiel 42

3.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến đường kính thân và trọng lượng tươi cây

{HAT VAN) THỊ VŨ HD coxecnontghc 8g atESoBixaiggikS9ost0gDxEboiditosiystlgesitilist2i10/3p80Pidg8-iniingalosiiasseriseasi 44

FEET LUA VACBIB NIGH 08A 47

IV 190/9089:70,/8.4:7 (04 48

PHU LỤC - -22-22222222122221112211122211127111222112271121222222222 re 51

VI

DANH SÁCH CHỮ VIET TAT

uM Micromole

ANOVA Analysis of Variance

BA Benzylaminopurine

BAP 6-Benylaminopurin

CRD — 2 Completely Randomized Design — 2 (hai yếu tô)

CRD Completely Randomized Design

ctv cộng tac viên

cv Coefficient of Variation

IBA Indole Butyric Acid

LLL Lan lap lai

LSD Least Significant Difference (test)

MS Murashige va Skoog

NAA 1 —Nathalene Acetic Acid

NSC Ngày sau cay

NT Nghiệm thức

PL Phụ lục

TDZ Thidiazuron

Vil

DANH SÁCH CÁC BANG

Bảng 2.1 Thành phần môi trường MS được sử dụng trong thí nghiệm (Murashige và

Ð KOOE: | 0) lcsseeenknetbenniedbibdonlgatoyetoritgtolsdiogoksgtanrepketrgilidiokruiố0002ngguEalu4glsdPegdi b0g2 egsbg8dtietekolisasgebglHbsd 26

Bảng 2.2 Bảng mã hóa tên các nghiệm thức tương ứng các nồng độ BA và NAA trongthí nghiệm tạo chồi từ mô sẹo dòng mai vàng HD01 -22©22522222222z22z2zz>z+2 28Bảng 2.3 Bang mã hóa tên các nghiệm thức và nồng độ IBA tương ứng trong thi

nghiém tao ré Cay Mai VAN NN ((-QH.H.HẬHA 30

Bang 3.1 Anh hưởng của BA va NAA đến chiều cao cụm chỗi (em) của dòng maivàng HDO1 ở ba thời điểm khác nhau - 2-2255 2S£SE£SE22E2EE2E2E22E225223222222222 e2 33Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến số chéi (chồi/cụm chéi) hình thành

ở dòng mai vàng HDOI tái sinh từ mô sẹO 555-552 5+£+sc+seseeeereerrerrerrerrrree.2

Bang 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA va NAA đến số lá (1a) hình thành trong quátrình tái sinh ch6i dòng mai vàng HD0I - 2-2252 ©52 522 2S2E2£E2E2E2EzEzzezsez 37

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến thời điểm hình thành rễ dòng mai vàng

I0 00ì 02

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến chiều cao (cm) dong mai vàng HDO1 in

‘Vitro giai đoañi từ LŨ = 50 NRCcseceeescsoexssosie1eg13095460958665990888910130)g38895pSix2Exsaiie2gssssii 40

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nông độ IBA đến số lá (lá) dòng mai vàng HD01 in vitro

trons Biai doatt từ LŨ — 5Ú NSC ciácecnnngdn nga ០ngàng án gà cá 0601669555619013683 65.01463565 58 41

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến số rễ (rễ/cây) dòng mai vàng HDO1 in

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến chiều dài rễ (cm), đường kính thân (mm)

và khối lượng tươi (g) dòng mai vàng HD0I int Vitro 2 22-552552255ssc5cze 44

Vili

MS Loans eee 51

Hình PL 2 Mau mô seo cây mai vàng in vitro 50 ngày sau cấy ở các nghiệm thức ở

CL HH: T xussvseabLUEĐEOIETSISLEHGILIEUIDNS0ĐĐU1ENVSos3ĐxunaWgixkpfiisleupyijgatssuils'Đui4ssrbigsvegise 51

Hình PL.3 Trọng lượng tươi cây mai vàng sau 50 ngày nuôi cấy 52

Hình PL.4 Cây mai vàng sau 50 ngày nuôi cấy -2+ 522 522222222222222z2xzzxe2 52

Hình PL.5 chiều dai rễ cây mai vàng sau 50 ngày nuôi CAY -2- 2-52 52

1X

GIỚI THIỆU

Dac van dé

Cây mai vàng (Ochna integerrima (Lour.) Merr.) là loài cây cảnh quen thuộc,

được xem như là một biểu tượng cho Tết cô truyền, đại diện cho mùa xuân Bên cạnh

đó, mai vàng cũng có nhiều đặc tính thảo được quý như vỏ của cây có thé sử dụng nhưmột loại thuốc điều hòa tiêu hóa, rễ có thể được sử dụng dé tay giun và chữa bệnh bachhuyết (Kaewamatawong và ctv, 2002) Tại Việt Nam, mai là cây cảnh phổ biến của khuvực miền Nam và miền Trung

Trong ngành trồng mai, nhiều nghệ nhân đã chọn lọc ra những cây mai đầu dong

rat đẹp Tuy nhiên, dé nhân số lượng lớn và đồng nhất các cá thé này bằng con đường

hữu tính không thể thực hiện được do đặc tính phân ly tính trạng Trong khi đó, kỹ thuậtnhân giống vô tính bao gồm nuôi cấy mô lại có ưu điểm cho phép nhân tạo ra các câycon giống hệt cây mẹ với số lượng lớn

Vườn mai của nghệ nhân Hữu Đức tại Làng mai Bình Lợi, xã Bình Lợi, huyện

Bình Chánh, Thành phó Hồ Chí Minh đã chọn lọc ra một số dòng mai nôi trội Trong

đó, dòng HDO1 là dong mai vàng có màu sắc và kích thước rất được ưa chuộng Khácvới những dòng mai thông thường, dong HDO1 có nhiều cánh, màu sắc hoa đậm, đường

kính hoa to từ 4 — 6 cm và hoa lâu rụng.

Phương pháp nuôi cấy mô đã được ứng dụng rộng rãi và trở thành công cụ nhân

giống chủ yếu cả Việt Nam và trên thế giới nhằm cung cấp một lượng lớn cây giốngđồng đều trong một thời gian ngắn Hiện nay, tại Việt Nam và trên thế giới, mặc dù đã

có một số thành công trong nhân giống in vitro đối với cây hoa mai, nhưng mỗi dòng,mỗi giống mai lại cần phải được tinh chỉnh, tối ưu hóa môi trường khoáng và chất điều

hòa sinh trưởng thích hợp với từng dòng, giống cây đó Việc tối ưu hóa các thành phần

môi trường, phối hợp với các chất điều hòa sinh trưởng như BA, NAA, IBA và nướcdừa thường được sử dụng dé hướng tới tao ra hiệu qua tai sinh cao nhat

Vì các lý do trên, đề tài “Xác định thành phần chất điều hòa sinh trưởng phù hợpcho quá trình nhân giống in vitro dòng mai vàng HDO1 (Ochna integerrima (Lour.)

Merr.)” đã được thực hiện.

Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được nồng độ của BA và NAA phù hợp đến quá trình tái sinh chéi dongmai vàng HDO1 (Ochna integerrima (Lour.) Merr.) từ mô sẹo.

Xác định được nồng độ IBA đến quá trình tạo rễ của dòng mai vàng HDO1 (Ochna

integerrima (Lour.) Merr.).

Yêu cầu đề tài

Pha hóa chất đúng nồng độ thí nghiệm

Bồ trí thí nghiệm và thu thập số liệu đúng thời gian, đảm bảo tính khách quan

Tao được cây mai vàng hoàn chỉnh.

Ghi nhận hình ảnh trong quá trình thực hiện đề tài

Giới hạn đề tài

Đề tài thực hiện nuôi cấy mô đối với dòng mai vàng HDO1 (Ochna integerrima(Lour.) Merr.) in vitro ở giai đoạn nhân chdi, tạo rễ từ tháng 2/2023 đến tháng 8/2023tại phòng nuôi cấy mô thuộc khu thực nghiệm Bộ môn Sinh lý — Sinh hóa, Khoa Nônghọc, Trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh Đối với nhóm chất điều hòasinh trưởng Auxin, đề tai chỉ sử dung NAA va IBA Đối với nhóm chất điều hòa sinhtrưởng Cytokinin, đề tài chỉ sử dụng BA

Chương 1

TONG QUAN TAI LIEU

1.1 So lược cây mai vàng

1.1.1 Phân loại khoa học

Cây mai vàng (Ochna integerrima (Lour.) Merr.) là thực vật có hoa Về phân loại maivàng thuộc về:

Tên khoa học: Ochna integerrima (Lour.) Merr.

Họ Mai (Ochnaceae) là họ thực vật có nguồn gốc từ cây hoang dã, chủ yếu là cáccây thân gỗ và thân bụi, bao gồm 27 chi và khoảng 495 loài tùy theo hệ thống phân loại

Họ Mai được tìm thay tại các khu rừng cận nhiệt đới va nhiệt đới, đặc biệt là các khu

rừng Nam Mỹ Chi lớn nhất là Ouratea (bao gồm Gomphia) với khoảng 200 loài Các

chỉ Mai sống ở các khu rừng nhiệt đới Châu Phi và Châu Á được phát hiện gần 90 loài

phong phú và đa dạng (Britannica, 2009).

Ở Việt Nam, ho Mai vàng chỉ có 4 chi là Euthemis, Gomphia, Indosinia, Ochna.Trong đó, chi Ochna phô biến nhất với 2 loài Ochna integerrima (Lour.) Merr và Ochnaserrulata, tuy nhiên vẫn còn nhiều loài mai ở Việt Nam chưa có tên khoa học

1.1.2 Phân bố ở Việt Nam

Trong tự nhiên trên lãnh thé Việt Nam, cây mai vàng mọc hoang dai ở rất nhiều

nơi, khu vực phân bố chủ yếu kéo dai từ Huế trở vào Nam Cây mai có thé phát triển

3

được ở những vùng đất có điều kiện thé nhưỡng khác nhau, như vùng núi cao, đồngbằng hoặc ven biển, có những loài còn phát triển được ở những vùng dat cát ven biểnnhư cây mai biển vùng Cam Ranh — Khánh Hòa (Thái Văn Thiện, 2008).

Khi khảo sát nguồn gốc, các nhà khoa học của Viện Nghiên cứu Rau quả và TrườngĐại học Nông nghiệp I đã nhận thấy giống mai vàng này đã có cách đây khoảng 800năm, được phân bố rải rác khắp vùng rừng Yên Tử, thuộc loài cây thân gỗ, thường xuấthiện chủ yếu ở 3 khu vực: khe núi dọc theo chùa Hoa Yên; rừng thuộc chùa Vàng Danh

(Uông Bi); rừng tại dãy núi thuộc xã Tràng Luong, Bình Khê (Đông Triều) Theo những

nghiên cứu gần đây của Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, cây mai vàng Yên Tử

va cây mai vang mién Nam déu cùng thuộc một loài (tên khoa hoc là Ochna

integerrima) Đây là loài mai có 5 cánh và có nụ màu xanh Cánh hoa có mau vàng tươi

rất sáng và có mùi thơm nhẹ đặc trưng rat dé chịu (Dang Van Dong va ctv, 2013)

1.1.3 Đặc điểm hình thái cây mai vàng

Cây mai vàng (Ochna integerrina (Lour.) Merr.) là cây đa niên, có thể sống trên

một trăm năm, gốc to rễ lồi lõm, thân xù xì, cành nhiều nhánh, lá mọc xen Cây mai

vàng là một loài cây hoang đại, chiều cao có thé từ 3 — 8 m, lá đơn, mép lá có răng cưa,

màu xanh bóng Cụm hoa mau vang có dạng chùm ở nách lá, lá đài thường năm cánh

với màu xanh nhạt bóng Số lượng hoa có thé dao động từ 5 — 9 cánh, màu vàng Dé hoa

có nhiều khía, bầu có từ 5 - 10 múi, mỗi múi có 1 noãn, quả nhỏ màu xanh, khi chínchuyền sang màu đen xếp quanh dé hoa

Cây mai là cây có hoa đa niên, trong tự nhiên hoa tự rụng lá khi nhiệt độ xuống

thấp và ra hoa vào mùa xuân khi tiết trời ấm áp Thời gian nở hoa tự nhiên có thể kéodài cho đến tháng 3 — 4 âm lịch nếu thời tiết lạnh (Thái Văn Thiện, 2008)

1.1.1 Yêu cầu sinh thái cây mai vàng

Cây mai không kén đất trồng Các loại đất thịt, đất cát pha, sét pha, đất phù sa, đất

đỏ bazan, thậm chí đất có lẫn đá sỏi vẫn trồng mai được Cây mai thích hợp những nơi

có khi hậu nóng ẩm, nhiệt độ từ 25°C - 30°C là tốt nhất, mai có thé chịu được nhiệt độ

cao hơn trong nhiều ngày, thậm chí nhiều tháng, nhưng với những vùng có khí hậu mát

lạnh dưới 10°C thì mai sinh trưởng kém.

Cây mai là loài cây ưa sáng, ưa nắng suốt ngày Ở nơi đầy đủ ánh sáng suốt cảngày cây sẽ sinh trưởng và phát triển tốt, cây sẽ hình thành nhiều nụ hoa hơn Bình quânthời gian chiếu sáng cho cây mai sinh trưởng phát triển tốt khoảng 2.000 giờ mỗi năm.

Ở những nơi bị khuất nắng, cây sẽ kéo đài thời gian sinh trưởng hơn Ánh sáng đầy đủ

làm quá trình đồng hóa của cây diễn ra tốt, giúp cây xúc tiễn quá trình phân hóa mầm

hoa mạnh mẽ (Thái Văn Thiện, 2008) Thời gian nhận ánh sáng được 6 tiếng trở lên mớiđảm bảo Những nơi thiếu ánh sáng thì cây sinh trưởng kém, ra hoa ít (Trương Hoàng

Giang, 2011).

1.1.2 Giá trị sử dụng cây mai vàng

Cây mai vàng không những có giá trị tinh thần tốt đẹp mà còn là một vị thuốc hay,một loại thực phẩm độc đáo

Cây mai vàng được trồng phô biến ở vườn nhà của người dân miền Trung và Nam

bộ nước ta Có thê làm cây cảnh trồng chậu hoặc bonsai tùy vào sở thích của người chơi

mai Đặc biệt vào dịp Tết cổ truyền lượng tiêu thụ của cây mai được đây mạng hơn vì

đây là mặt hàng cây cảnh chủ đạo Vào dịp này giá của một cây mai vàng dao động từ

vài triệu cho đến vài chục triệu có trường hợp lên đến hàng trăm triệu tùy thuộc vào thé,dang và độ tuôi của cây

Mai vàng là loài cây chiếm tỉ lệ lớn trong diện tích trồng hoa, cây kiếng tết ở Thànhphố Hồ Chí Minh Với mô hình trồng mai vàng ở huyện Bình Chánh đã có hon 100 hộtrồng mai với diện tích trên 270 ha, thu nhập trên 2 tỷ đồng/ha/năm (Sở Nông Nghiệp

và Phát triển Nông thôn Thành phố Hồ Chí Minh, 2018)

1.2 Nuôi cấy mô tế bào

1.2.1 Khái niệm

Nuôi cấy mô tế bao thực vật là phương pháp nuôi cấy in vitro mô hoặc tế bào đãtách rời ra khỏi cơ thé thực vật trong môi trường thích hợp dé tế bào trở lại trạng thái

chưa phân hóa có khả năng phân chia tế bảo và biệt hoá thành mô, cơ quan, phát triển

thành cây con mới Tất cả mọi tế bào của một cơ thé thực vật đều có tính toàn năng,nghĩa là chứa bộ gene giống nhau, do đó tat cả các tế bao của một cơ thé đều có khảnăng tổng hợp những loại protein — enzyme giống nhau và nếu tế bào được nuôi dưỡng

trong môi trường thích hợp đều có thể phát triển thành cây nguyên vẹn đặc trưng choloài và ra hoa, kết quả bình thường (Nguyễn Quang Thạch, 2009).

1.2.2 Cơ sở của nuôi cấy mô thực vật

1.2.2.1 Tính toàn năng của tế bào

Haberlandt (1902) lần đầu tiên cho rằng bắt kỳ tế bào của một cơ thể sinh vật đa

bào đều có khả năng tiềm tàng dé phát triển thành một cá thé hoàn chỉnh Do là tính toàn

năng của tế bào Đặc tính này được sử dụng rộng rãi trong nuôi cay mô tế bào thực vật,

mô và cơ quan thực vật hay nuôi cấy tế bào trần trên các môi trường nhân tao in vitro.Trong điều kiện thích hợp (môi trường có bồ sung chất điều hòa sinh trưởng thích hợp),những tế bào này sẽ được kích thích dé phân hóa, phát sinh hình thái, tái sinh phôi hoặc

phát sinh cơ quan và sau cùng là thành cơ quan hoàn chỉnh.

1.2.2.2 Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào

Cơ thé thực vật trưởng thành là một thé thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chứcnăng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên tất cả cácloại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào ban đầu (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu tiên,

tế bao hợp tử tiếp tục phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêngbiệt (chuyên hóa) Sau đó từ các tế bảo phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thànhcác tế bảo chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau

Sự phản phân hóa tế bào (Cell Differentation) là sự chuyên hóa các tế bao phôisinh thành các tế bao mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau và trong một

số trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, các tế bao vẫn có thé trở về dạng tế baophôi sinh và phân chia mạnh mẽ, quá trình này gọi là phản phân hóa tế bào

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa (De-Differentation) là một quá trìnhhoạt hóa, ức chế các gene Trong quá trình phát triển cá thể, có một số gene được hoạthóa (mà vốn trước nay bi ức ché) dé cho ra tính trạng mới, còn một số gene khác bị đìnhchỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúcphân tử DNA của mỗi tế bào, điều này khiến quá trình sinh trưởng và phát triển của thực

vật được hài hòa.

Mặc khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thê thường bị ức chế bởi các

tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạođiều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gene của tế bào

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật là kết quả của quátrình phân hóa và phản phân hóa tế bào (Bùi Bá Bồng, 1995)

1.2.2 Ưu và nhược điểm của kỹ thuật nhân giống in vitro

- Giúp tạo ra các cây con hoàn chỉnh từ những tế bảo hoặc mô thực vật đã đượcchuyên đổi gen từ đó tạo ra các loài tốt hơn

- Cho phép chọn lọc được các đối tượng thực vật có các tính trạng tốt dé sản xuất

các dược phẩm sinh học

- Giúp cứu phôi của một số loài cây khó phát triển và sinh trưởng trong điều kiện

tự nhiên góp phần bảo tồn các giống cây quý hiếm có nguy cơ tiệt chủng hiện nay

(Nguyễn Văn Ây, 2019)

- Cây nuôi cấy mô chưa hoàn thiện về mặt cấu trúc nên trong giai đoạn thuần

dưỡng (in vitro) khả năng sông sót còn giới hạn (Nguyễn Văn Ay, 2019)

1.2.3 Các bước trong nhân giống vô tinh in vitro

1.2.3.1 Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trước khi tiễn hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cân thận các cây mẹ (cây cho

nguồn mẫu nuôi cấy) Các cây nay cần sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạnsinh trưởng mạnh Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế

độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu sẽ làm giảm tỷ lệ mẫunhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro (Mai Xuân Lương, 2005).1.2.3.2 Tạo vật liệu khởi đầu

Giai đoạn khử trùng mẫu dé đưa vào nuôi cay in vitro Giai đoạn này cần đảm baocác yêu cau: ty lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tổn tại và sinh trưởng tốt Về mặtnguyên tắc thì các tế bào sông đã phân hóa đều có kha năng phản phân hóa dé trở lại

trạng thái trẻ hóa và tái lập khả năng phân chia (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy

Tiên, 2006) Các mô thực vật thường được sử dụng dé nuôi cấy là:

- Đỉnh sinh trưởng thân, rễ

Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc rất nhiều vào cách lấy và xử lý mẫu Ngoài

ra còn tùy thuộc vào mục đích đối với từng loại cây khác nhau dé nuôi cay cho phù hợp

Khi lẫy mẫu cần chọn đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất làđỉnh chéi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chéi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh

lá Kohter (1975) đã kết luận rằng sử dụng chổi ngọn dé nhân nhanh in vitro đối vớimăng tây là thích hợp Trong khi đó, Morel và ctv (1952) cho rằng sử dụng mầm đối vớikhoai tây hay chỗi nách, chéi đỉnh ở dứa là tối ưu cho kỹ thuật nhân nhanh in vitro

Mau cần phải khử trùng trước khi đưa vào nuôi cấy dé loại bỏ các vi sinh vật bámtrên và bên trong bề mặt mẫu cấy Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệsống cao, đồng thời chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ giúp đạt được tốc độ tăng

trưởng nhanh Các chất khử trùng thường sử dụng là: HgCl› 0,1% xử lý trong 5 - 10

phút, NaOCl hoặc Ca(OCDD; 5 - 7% xử lý trong 15 - 20 phút, HaOa, dung dịch Br (Duong Công Kiên, 2003).

1.2.3.3 Nhan nhanh

Mục đích của giai đoạn này là kích thích sự phát sinh hình thái và tăng nhanh số

lượng chỗi trên một đơn vị mẫu cấy trong một thời gian nhất định thông qua các conđường: hoạt hóa chéi nách, tạo chéi bat định và tạo phôi vô tính

Vật liệu khởi dau in vitro được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bồ sung

chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin dé tái sinh nhiều chéi từ một chồi nuôicấy Van dé là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp dé cóhiệu quả cao nhất Chế độ nuôi cấy thường là 25 - 27°C và 16 giờ chiếu sáng/ngày,

cường độ ánh sáng 2000 - 4000 lux, ánh sáng tim là thành phan quan trọng dé kích thíchphân hóa chổi (Weiss và Jaffe, 1969).

1.2.3.4 Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Kết thúc giai đoạn nhân nhanh cây, chúng ta có được một số lượng chồi lớn, nhưng

chưa hình thành cây hoàn chỉnh vì chưa có bộ rễ Vì vậy cần chuyền từ môi trường nhân

nhanh sang môi trường tạo rễ Tach các chdi riêng thường sẽ được cấy vào môi trường

có bổ sung chat điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin Mỗi chồi khi ra rễ là trở thànhmột cây hoàn chỉnh Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyên từ môitrường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều hòa sinh

trưởng Đối với các phôi vô tính chỉ cần cây chúng trên môi trường không có chất điều

hòa sinh trưởng hoặc môi trường có chứa cytokinin nồng độ thấp thì phôi phát triển

thành cây hoàn chỉnh (Dương Công Kiên, 2003).

1.2.4 Một số kiểu tái sinh trong nuôi cấy in vitro

Nhờ vào tính toàn năng, khả năng phân hóa và tái phân hóa của tế bào mà mỗi bộ

phận (rễ, thân, lá, hoa, cuống hoa, chồi nách), kể cả tế bào đơn bội (hạt phấn, noãn chưa

thụ phan) của cây đều có thé tái sinh thành cây mới hoàn chỉnh Sau đây là một số kiểutái sinh trong nuôi cấy in vitro mà hiện nay đã được áp dụng rộng rãi và mang lại nhiềuthành công cho công tác giống cây trồng (Vũ Văn Vụ, 2009)

- Nuôi cây tái sinh cơ quan

- Nuôi cấy tái sinh đỉnh sinh trưởng

- Nuôi cấy tái sinh thông qua con đường tạo mô sẹo

- Nuôi cấy lớp mỏng tế bào

- Nuôi cấy tạo phôi vô tính

- Nuôi cấy tế bảo trần (Protoplast)

- Nuôi cây tê bào đơn bội

1.2.5 Một số chat điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là những chất với liều lượng rất thấp gây ra

phản ứng sinh học cao, có vai trò điều tiết các quá trình sinh lý, trao đổi chất của cơ thé

thực vật Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là nhân tô quan trọng hàng đầu trong việcxác định chiều hướng phát triển của mẫu cấy trong nuôi cay mô tế bảo thực vật Các loại

chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bao bao gồm

auxin, cytokinin, gibberellin, acid abscisic và ethylen Phổ biến là nhóm auxin, cytokinin

(Nguyén Dire Luong, 2006)

1.2.5.1 Auxin

Auxin là một trong những chat điều hòa sinh trưởng được sử dung thường xuyêntrong nuôi cay mô tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của

môi trường dinh dưỡng dé kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bao và

điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử dụng với các

cytokinin.

Auxin có tác dung tốt đến các quá trình sinh trưởng của tế bao, hoạt động của tangphát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật, sự sinhtrưởng của quả và tạo quả không hạt Kích thích sự sinh trưởng giản dài của tế bào đặcbiệt là theo chiều ngang làm tế bào phình ra

Một số Auxin thường được dùng trong nghiên cứu là indole — 3 — acetic acid (IAA),

indole —3— butyric (IBA), 2,4 — dichlorophenoxyacetic acid (2,4 —D), Naphthaleneacetic acid (NAA) Riêng JAA là auxin tự nhiên, NAA, IBA và 2,4 — D là các auxin nhân tạo.

Các auxin nhân tạo thường có hoạt tính mạnh hon, do cấu trúc phân tử khá bền vững

nên auxin nhân tạo ít bị oxy hóa bởi các enzyme.

10

Việc sử dụng loại, nồng độ Auxin còn tùy thuộc vào mục đích của thí nghiệm, khảnăng tổng hợp nội sinh của mẫu (Bùi Trang Việt, 2000) Theo Bùi Chí Hữu (2007), khi

xử lí auxin nồng độ từ 0,1 đến 5,0 mg/L sẽ giúp tế bào kéo dài và hình thành rễ ở mẫu

cấy Kết quả nghiên cứu của Butenko (1968) cho thấy NAA có tác dụng tạo rễ mạnh

hơn các auxin khác (Nguyễn Đức Thành, 2000)

1.2.5.2 Cytokinin

Mô phân sinh ngọn rễ là nơi tổng hợp chủ yếu các Cytokinin tự do cho cả cơ thểthực vật, sau đó di chuyền trong mạch gỗ tới chéi Cytokinin nội sinh và sự phân bao có

mối tương quan rat chặt chẽ, nó cần thiết cho giai đoạn khởi đầu của quá trình phân bảo,

làm tăng tốc độ phân chia tế bào và định hướng sự phân hóa tế bào trong nuôi cấy mô

tế bào thực vật Cytokinin giúp tế bào gia tăng kích thước và sinh tổng hợp protein, acidnucleic, chlorophyll Do đó, cytokinin ảnh hưởng đến hoạt động sinh lý của cây.Cytokinin tác động trên cả sự phân nhân và phân chia tế bào chất Trong thân và rễ,cytokinin cản sự kéo dài, nhưng kích thích sự tăng rộng tế bào Cytokinin cũng kíchthích sự gia tăng kích thước tế bào lá trưởng thành Cytokinin cảm ứng sự hình thànhchồi, loại bỏ ưu thế ngọn và hạn chế sự phát triển của rễ (Bùi Trang Việt, 2000)

Các loại cytokinin thường được ding trong nuôi cấy là 6-(2-furfuryl)-aminopurin

(Kinetine), 6-(4-hydoxy-3-methylbut-2enyl)-aminopurin (Zeatine), 6-Benylaminopurin

(BAP) Hoạt tính của BAP là cao nhất dưới tác động của nhiệt độ cao

Cytokinin có tác dụng kích thích sự tao chi trực tiếp hoặc gián tiếp trên thực vậtnguyên vẹn cũng như trên mô thực vật nuôi cấy in vitro Tác dụng này hiệu quả hơn khiphối hợp Cytokinin với auxin ở một tỷ lệ thích hợp (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy

Công bo đâu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cây mô thuộc vê Van Overbeek

và ctv, (1954) Sau đó, tác dụng tích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cay mô,

11

tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận Nước dừa đã được xác định là rất giàu

các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993) Nướcdừa đã sử dụng dé kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây Nước dừa

thường được lấy từ quả của các giống và cây chọn lọc để sử dụng tươi hoặc sau bảo

quản Nước dừa thường được sử dụng ở nồng độ từ 5 - 20% Tồn dư protein trong nướcdừa không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng có thểdẫn tới kết tủa dung dịch khi bảo quản lạnh

Nước dita chứa 94% là nước và một số thành phần như acid amin, acid hữu co,acid nucleic, vitamine, đường don alcohol, một số hợp chất có hoạt tính auxin, đặc biệt

là các cytokinin Chất khoáng và các chất khác thúc đầy sự tăng trưởng, sinh trưởng của

tế bào nuôi cấy (Yong và ctv, 2009) Nước dừa đã được sử dụng đề kích thích phân hóa

và nhân nhanh chỗi ở nhiều loại cây (Tran Văn Minh, 2002)

1.3 Một số nghiên cứu liên quan đến nhân giống in vitro mai vàng và các cây cùnghọ

1.3.1 Một số nghiên cứu ngoài nước về nhân giống in vitro cây mai vàng

Đối với loài Ochna serrulata L., chất điều hòa sinh trưởng BAP được cho là thích

hợp nhất cho quá trình nhân chéi sau đó là Kinetin và MAP Quá trình nhân nhanh chồi

in vitro là tối ưu nhất trên môi trường MS có bồ sung 2,0 mg/L BAP và 0,25 mg/L IBA.Các chéi được tạo rễ thành công trên môi trường MS bán rắn với 2% sucrose có chứa

1,0 mg/L IBA (Goel và ctv, 2008).

Các nhà khoa học An Độ đã thành công tạo chồi cây mai tứ quý (Ochna serrulata)

in vitro trên môi trường MS bổ sung 2,0 mg/L benzyl adenine (BA) va 0,25 mg/L

indol-3- butyric acid (IBA); và nuôi cấy chéi trên môi trường MS bỗ sung 2% sucrose + 1,0mg/L IBA cho rễ hình thành nhiều và phát triển mạnh nhất

Kết qua của Ma và ctv (2011) đã nhân giống thành công cây mai vàng (Ochnaintegerrima (Lour.)) nhằm tạo chỗi và phôi vô tính từ vật liệu lá và chéi in vitro; kết quacho thấy nồng độ Thidiazuron cao từ 10,0 — 15,0 uM TDZ có thé hình thành phôi vôtính va tạo chéi bat định trong khi nồng độ 5,0 uM TDZ chỉ có thể tạo ra các chỗồi batđịnh Môi trường có bồ sung 0,5 uM NAA và 8 uM IBA kết hợp 1g than hoạt tính phù

hợp ra rễ nhanh chóng trong vòng 1 tháng.

12

1.3.2 Một số nghiên cứu trong nước về nhân giống in vitro cây mai vàng

Nghiên cứu của Trần Nguyên Văn (2013) đã tiến hành xây dựng được quy trìnhnhân nhanh giống in vitro cây mai giao Thủ Đức tại Quy Nhơn

Tại Việt Nam, theo Lâm Ngọc Phương và Mai Vũ Duy (2013) sử dụng vật liệu là

thân và chồi ngọn cây mai 4 tuần tuôi dé vô mẫu, kết quả tạo chéi mai in vitro với môitrường MS bồ sung BA (4 mg/L) cho số chéi cao nhất, tạo rễ trên môi trường 1/2 MS

bổ sung NAA (6 mg/L) cho rễ hình thành nhiều và phát triển bình thường

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Nhã (2018) đã chỉ ra rằng môi trường khoáng 1/2 MSkết hợp dé tối 2 tuần giúp kích thích sự ra rễ của chồi mai in vitro

Nghiên cứu của Hồ Thị Cam Nguyên và ctv (2019) cho thấy qui trình nhân giốngmai từ đoạn cành và búp chỗi có kết quả là môi trường MS bồ sung cả BA va NAA vớinồng độ tương ứng 1,5 mg/L và 0,5 mg/L thích hợp dé tái sinh chồi mai in vitro từ mẫuban đầu Môi trường MS bồ sung 2 mg/L kinetin và 4 mg/L BA được nghiên cứu thích

hợp nhất dé nhân số lượng chéi đạt 3,4 chồi/mẫu, và có hiện tượng tạo cụm chéi từ mẫu

búp chồi ban đầu Nghiên cứu cũng cho thấy môi trường nền 1/2 MS thích hợp cho chồimai in vitro sinh trưởng, phát triển

Qua các nghiên cứu cho thay việc nhân giống in vitro mai vàng có tiềm năng ứng

dụng cao, nhưng phạm vi của các nghiên cứu này cũng chỉ ở mức phòng thí nghiệm, do

vậy cần tìm ra qui trình nhân giống có tính khả thi hơn, có thể đưa ra sản xuất đại tràphục vụ cho nhu cầu thị trường và phục vụ công tác bảo tồn các giống mai quý

13

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến quá trình tái sinh

chéi dong mai vàng HDO1 (Ochna integerrima (Lour.) Merr.) từ mô sẹo.

Thí nghiệm 2: Khao sát ảnh hưởng của nồng độ của IBA đến quá trình tạo rễ của

dòng mai vàng HDO1 (Ochna integerrima (Lour.) Merr.).

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 02 năm 2023 đến tháng 08 năm 2023 Các thínghiệm được tiễn hành tại phòng cấy mô thuộc Khu thực nghiệm Bộ môn Sinh Lý —Sinh Hóa, Trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chi Minh

2.3 Điều kiện thí nghiệm

Đề tài được thực hiện tại phòng cấy mô thuộc Khu thực nghiệm Bộ môn Sinh Lý

— Sinh Hóa, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Điều kiện tại phòng nuôi cấy mô:

- Cường độ chiếu sáng: 2500 + 500 lux

- Thời gian chiếu sáng: 10 giờ/ngày

- Am độ của phòng nuôi cấy mô được duy trì trong khoảng 70 - 80%

- Nhiệt độ phòng nuôi cây mô được duy trì ở 25°C + 2°C

14

2.4 Vật liệu

2.4.1 Mẫu giống

Mau mô seo từ lá của dòng mai vàng HD01 được cung cấp từ vườn mai Hữu Đứctại Lang mai Binh Lợi, xã Bình Lợi, huyện Bình Chánh, Thành phố Hồ Chí Minh.2.4.2 Môi trường nuôi cấy cơ bản sử dụng trong thí nghiệm

Môi trường nuôi cấy dùng trong thí nghiệm là môi trường MS (Murashige vàSkoog, 1962) Môi trường được bổ sung thêm 30 g/L đường, 7,0 g/L argar và các chấtđiều hòa sinh trưởng BA, NAA và nước dừa cho thí nghiệm 1, bổ sung chất điều hòasinh trưởng IBA và than hoạt tính cho thí nghiệm 2 Môi trường nuôi cấy được điềuchỉnh về pH 5,6 Môi trường được hấp khử trùng ở 121°C, 1 atm duy trì trong 20 phút.Thể tích môi trường: 50 mL/chai tam giác

23

Bảng 2.1 Thành phần môi trường MS được sử dụng trong thí nghiệm (Murashige và

+ Chất điều hòa sinh trưởng bé sung được sản xuất từ hãng Duchefa Biochemie

(Hà Lan): 6 - benzyle amino purine (BA), 1 - Naphthalene acetic acid (NAA), indole —

3 — butyric (IBA), Thidiazuron (TDZ).

+ Nước Javen (San pham gia dung thuộc hiệu Select, Việt Nam)

+ Dịch chiết bổ sung: Nước dừa sử dung nước dừa từ giống diva Xiêm Xanh Bến

Tre (chọn lay nước từ những quả non, pH = 5,6 — 5,8)

trường bồ sung NAA với nồng độ là 0,25 mg/L và TDZ với mức nồng độ là 0,2 mg/L.

Và đưa vào điều kiện tối trong khoảng 60 ngày dé cảm ứng mô sẹo Sử dụng mô sẹo cómau xanh, chặt, khô và được phân thành các cụm nhỏ với đường kính khoảng 0,5 em

cấy tiếp vào bình tam giác có chứa môi trường MS bồ sung BA va NAA với các nồng

độ khác nhau.

Hình 2.1 Mẫu mô sẹo cây mai vàng

Bảng 2.2 Bảng mã hóa tên các nghiệm thức tương ứng các nồng độ BA và NAA trongthí nghiệm tạo chồi từ mô seo dòng mai vàng HDO1

BINI | BIN2 | B4N1 | B2N1 | B2N2 | B3NI | B2N3 | B4N2 | B2N3

B4NI | B3N1 | BINI | BIN2 | B3N2 | B4N2 | B3N2 | B3N3 | B4N3

B2NI1 | B2N2 | B2N2 | B4N1 | BINI | BIN3 | B3N1 | BIN3 | B3N3

BIN2 | BINS | B2N1 | B2N3 | B3N2 | B3N3 | B4N2 | B4N3 | B4N3

28

Qui mô thí nghiệm 1

- Số nghiệm thức: 12

- Số lần lặp lại của một nghiệm thức: 3

- Số chai/ nghiệm thức: 5

- Số mẫu/chai: 3

- Tổng số chai cho mỗi nghiệm thức trong 3 lần lặp lại: 5 x 3 =15

- Tổng số chai trên toàn thí nghiệm: 15 x 12 = 180

- Tổng số mau cho mỗi nghiệm thức: 15 x 3 = 45

- Tổng số mau: 45 x 12 = 540

Môi trường nền: MS + 100 ml/L nước dừa + 7g/L agar + 30g/L đường

2.5.1.3 Chi tiêu va phương pháp theo dõi

Theo dõi phản ứng tạo chéi của cây mai vàng HDO1 sau khi cấy đối với 15 mẫu/ô

cơ sở ở tat cả các chỉ tiêu Các mẫu được theo đõi 10 ngày/lần, trong vòng 50 ngày trong

phòng tăng trưởng.

- Số chồi/mẫu (chéi): đếm số chồi phát sinh trên mỗi mẫu cấy

- Số lá/mẫu (1a): đếm số lá phát sinh trên mỗi mẫu cấy

- Chiều cao cụm chồi (cm): dùng thước có chia vạch đo chiều cao từ vị trí chồiphát sinh cho đến đỉnh ngọn cao nhất

2.5.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ IBA đến quá trình tạo rễ

của dòng mai vàng HDO1 (Ochna integerrima (Lour.) Merr.).

vòng 3 tuần Sau 3 tuần chuyển các mẫu sang môi trường MS 1/2 bổ sung IBA với các

nông độ khác nhau tương ứng với các nghiệm thức.

Hình 2.2 Mẫu chồi cây mai vàng trước khi cho vào môi trường tạo rễBang 2.3 Bảng mã hóa tên các nghiệm thức và nồng độ IBA tương ứng trong thi

nghiệm tạo rề cây mai vàng

Nghiệm thức Nông độ IBA (mg/L)

- Tổng số chai cho mỗi nghiệm thức trong 3 lần lặp lại: 3 x 5 = 15

- Tổng số mẫu cho mỗi nghiệm thức: 15 x 3 = 45

- Tổng số chai trên toàn thí nghiệm: 15 x 6 = 90

- Tổng số mẫu: 45 x 6 = 270

Môi trường nền: MS 1/2 + agar 7 g/L + đường 30 g/L + than hoạt tính 0,3g/L

Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi:

Theo dõi khả năng tạo rễ của cây mai vàng HDO1 sau khi cấy đối với 15 mẫu/ô cơ

sở cho tất cả các chỉ tiêu Các mẫu được theo dõi 10 ngày/lần, trong vòng 50 ngày

-Thời điểm xuất hiện rễ (ngày sau cấy): được tính từ khi cấy đến khi có 50 % sốmẫu cấy hình thành rễ

- Chiều cao của cây (cm): dùng thước có chia vạch đo chiều cao từ mặt thạch chođến đỉnh ngọn

- Số lá (1á): đếm tổng số lá phát sinh trên mỗi mẫu cấy

- Số rễ (rễ): đếm tổng số rễ hình thành trên mỗi mẫu cấy

- Chiều dai rễ (cm): dùng thước có chia vạch đo từ gốc đến đầu chóp rễ dai nhất

tai thời điểm 50 ngày sau cay

- Đường kính thân (mm): dung thước kẹp đo từ vị trí các gốc 1 cm và tính trungbình tại thời điểm 50 ngày sau cấy

- Khối lượng tươi (g): được cân và tính khối lượng trung bình được ghi nhận tạithời điểm 50 ngày sau cấy

2.6 Phương pháp xử lý và thống kê số liệu

Nhập số liệu thông qua Google sheet online, kết quả được tính trung bình bằngphần mềm Excel 2016 và phân tích phương sai (ANOVA), trắc nghiệm phân hạngDuncan trên phần mềm R 4.0.2 ở mức ý nghĩa 0,01 hoặc 0,05

31

Chương 3

KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN3.1 Khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp BA và NAA đến quá tái sinh chồi dòng

mai vàng HD01 (Ochna integerrima (Lour.) Merr.) từ mô seo.

Đối với nuôi cây mô tế bảo thực vật nói chung, nhóm cytokinin đóng vai trò chínhtrong sự hình thành chổi và cơ quan, đồng thời kích thích chồi nách phát triển và sựphân chia tế bao (Nguyễn Bảo Toàn, 2004) Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị ThủyTiên (2002), BA rất có hiệu qua trong vai trò kích thích tạo chồi bên và tác dụng nay trởnên hiệu quả hơn khi phối hợp với auxin ở một tỷ lệ thích hợp Sự kết hợp của hai chấtđiều hòa sinh trưởng này tránh được ưu thé ngọn của cây con được nuôi cấy ở giai đoạn

đầu và gia tăng phát triển nhiều chồi mới

3.1.1 Anh hưởng của nồng độ BA và NAA đến chiều cao cụm chồi trong quá trìnhtái sinh choi dòng mai vàng HD01 từ mô sẹo

Kết quả Bảng 3.1 cho thấy:

Tại thời điểm 10 NSC và 20 NSC, số chéi ở các nghiệm thức chứa các nồng độ

BA kết hợp NAA chưa hình thành do thời gian còn ngắn

Tại thời điểm 30 NSC, xét theo yếu tổ nồng độ BA, mô sẹo được cấy trong môi

trường được bô sung BA với nồng độ 1 mg/L đạt chiều cao cao nhất (0,81 cm) va sự

khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với các nồng độ còn lại Xét theo yếu tố nồng độNAA, mô sẹo được cấy trong môi trường được bổ sung NAA với nồng độ 0,25 mg/Lđạt chiều cao là 0,44 cm, sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với 2 nồng độ còn lại.Xét sự tương tác giữa các nồng độ BA va NAA, mô sẹo được cay trong môi trường được

bổ sung BA với nồng đội mg/L và NAA với nồng độ 0,25 mg/L đạt chiều cao chỗi (1,18

cm), sự khác biệt có ý nghĩa thông kê so với các nghiệm thức còn lại.

32

Bang 3.1 Ảnh hưởng của BA va NAA đến chiều cao cụm chỗi (em) của dòng maivàng HD01 ở ba thời điểm khác nhau

Thời điểm Nông độ NAA (mg/L)

— Nong d6 BA Trung binh

Ghi chú Trong cùng một nhóm, các giá trị trung bình có cùng ky tự theo sau thể hiện sự khác biệt không

có ý nghĩa trong thông kê So liệu được chuyên đôi theo công thức (x +0.5 “1/2 ns: sự khác biệt không

có ý nghĩa trong thông ké;*:khac biệt có ý nghĩa với œ=0.05;**:sự khác biệt có ý nghĩa với œ=0.01;***%: sự khác biệt có ý nghĩa với œ<0,001.

Tại thời điểm 40 NSC, xét theo yếu tố nồng độ BA, mô sẹo được cấy trong môitrường được bổ sung 1 mg BA/L đạt chiều cao cao nhất là 1,01 em, sự khác biệt rất có

ý nghĩa thống kê so với ba nồng độ còn lại Xét theo yếu tố nồng độ NAA, mô sẹo đượccấy trong môi trường được bồ sung 0,25 mg NAA/L đạt chiều cao cao nhất (0,57 cm),

33

sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nồng độ còn lại Xét sự tương tác giữa cácnồng độ BA va NAA, mô sẹo được cấy trong môi trường có bồ sung 1 mg BA/L kết hợp0,25 mg NAA/L đạt chiều cao chồi (1,38 cm), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với

các nghiệm thức còn lại.

Tại thời điểm 50 NSC, xét theo yếu tố nồng độ BA, mô sẹo được cấy trong môitrường được bồ sung 1 mg BA/L đạt chiều cao cao nhất (1,45 cm), sự khác biệt rất có ýnghĩa thống kê so với 3 nồng độ còn lại Xét yếu tố nồng độ NAA khác nhau, mô sẹo

được cấy trong môi trường được bé sung 0,25 mg NAA/L cho kết quả cao nhất 0,78 cm

Xét sự tương tác giữa hai yếu tổ trên, mô sẹo được cấy trong môi trường được bổ sung

1 mg BA/L và 0,25 mg NAA/L đạt kết quả cao nhất là 1,94 cm, sự khác biệt có ý nghĩa

thông kê so với nghiệm thức còn lại

3.1.2 Anh hướng của nồng độ BA va NAA đến số chdi trong quá trình tái sinh chồidong mai vàng HD01 từ mô sẹo.

Khi phối hợp cùng với auxin thì cytokinin sẽ kích thích sự phân chia tế bào và điều

khiến sự phát sinh hình thái Số chồi phát sinh từ mô seo trong các nghiệm thức là mộttrong những chỉ tiêu hiệu quả trong quá trình nhân giống Điều này đã thê hiện qua kếtquả thí nghiệm, khi tat cả các nghiệm thức được bổ sung các nồng độ khác nhau của BA

và NAA đều có khả năng phát sinh chéi

Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy:

Tại hai thời điểm 10 NSC và 20 NSC, các nghiệm thức sử dụng môi trường được

bồ sung các nồng độ BA va NAA khác nhau chưa hình thành chồi do thời gian còn ngắn

Tại thời điểm 30 NSC, xét theo yếu tô nồng độ BA, mô sẹo được cay trong môitrường có bổ sung 1 mg BA/L đạt 4,96 chỗi và khác biệt rất có ý nghĩa thong kê so vớicác nồng độ BA còn lại Xét theo yếu tố nồng độ NAA, mô seo được cấy trong môi

trường có bồ sung 0,25 mg NAA/L cho số chồi cao nhất là 3,67 chồi, sự khác biệt rất có

ý nghĩa thống kê so với các mức NAA còn lại Xét sự tương tác giữa các yếu tố nồng độ

BA va NAA, mô sẹo được cay trong môi trường có bồ sung 1 mg BA/L kết hợp với 0,25

mg NAA/L đạt kết qua cao nhất là 7,87 chồi, sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với

các nghiệm thức còn lại.

34

Bang 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến số chồi (chồi/cụm chồi) hình thành

ở dòng mai vàng HD01 tai sinh từ mô seo

mm! Nông độ BA Nông độ NAA (mg/L) Trung bình

CV(%) = 8,15; Fa = 186,51***;Fn= 108,65***;Fpen = 23,82***

Ghi chú Trong cùng một nhóm, các giá trị trung bình có cùng ký tự theo sau thể hiện sự khác biệt không

có ý nghĩa trong thống kê Số liệu được chuyển đổi theo công thức (x +0.5)^1/2.***:sự khác biệt có ý

nghĩa với a<0,001

Tại thời điểm 40 NSC, xét theo yếu tổ nồng độ BA, mô sẹo được cấy trong môitrường bồ sung 1 mg BA/L dat số chồi cao nhất là 5,27 chi, sự khác biệt rất có ý nghĩathống kê so với 3 nồng độ còn lại Xét theo yếu tố nồng độ NAA, mô sẹo được cấy trong

môi trường bổ sung 0,25 mg NAA/L dat số chỗồi cao nhất (3,89 chồi), sự khác biệt rất

có ý nghĩa trong thống kê so với nồng độ NAA còn lại Xét sự tương tác giữa hai yếu tốtrên, mô sẹo được cấy trong môi trường bồ sung 1 mg BA/L kết hợp với 0,25 mg NAA/L

35

đạt kết quả cao nhất là 8,25 chỗi, sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm

thức còn lại.

9

B1N1 B2N1 B3N1 B4N1 B1N2 B2N2

` _

II

3

Hình 3.1 Chéi mai vàng in vitro sau 50 ngày nuôi cấy ở các nghiệm thức khác nhau

Tại thời điểm 50 NSC, xét theo yếu tổ nồng độ BA, mô sẹo được cấy trong môitrường bổ sung 1 mg BA/L đạt số chéi cao nhất (5,39 chồi), sự khác biệt rất có ý nghĩathống kê so với các nồng độ BA còn lai Mô seo được cấy trong môi trường không bésung chất điều hòa sinh trưởng BA va NAA (DC), không có sự tái sinh chéi từ mô sẹo.Tuy nhiên việc bổ sung 1 mg/L đến 3 mgBA/L vào môi trường nuôi cấy số chỗi trungbình thấp hơn từ 5,39 còn 2,39 chồi Khi thay đổi các yếu tố nồng độ NAA khác nhau,

mô sẹo được cay trong môi trường bổ sung 0,25 mg NAA/L đạt kết quả cao nhất 4,08chéi Xét sự tương tác giữa hai yếu tố trên, ở nghiệm thức bé sung 1 mg BA/L và 0,25

mg NAA/L đạt kết quả cao nhất là 8,31 chồi, sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so vớinghiệm thức còn lại Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Hồ Thị Cẩm Nguyên vàctv (2019) trên mẫu đoạn thân nuôi cấy trong môi trường 1,5 mg BA/L + 0,5 mg NAA/Lđạt số chéi cao nhất (3,2 chỗi) tái sinh từ mẫu cấy ban đầu So sánh với kết quả của Mai

Vũ Duy và Lâm Ngọc Phương (2013), hệ số nhân chi trong nghiên cứu này đạt cao

hơn (8,31 so với 2,3), từ đó chứng minh được việc sử dụng kết hợp 2 loại chất điều hoasinh trưởng BA và NAA cho kết quả tốt hơn so với việc chỉ sử dụng BA

Qua kết quả thu được cho thấy, việc kết hợp giữa 1 mg BA/L và 0,25 mg NAA/L

là môi trường cho phép việc nhân nhanh chéi cây mai vàng trong điều kiện thí nghiệm

Cụm chồi phát triển nhanh, góp phan nâng cao hệ số nhân giống

36