Thực hành công nghệ enzyme Đề tài khảo sát các Đặc tính của chế phẩm enzyme pectinase công nghiệp

 Xác định được pH, nhiệt độ hoạt động tối ưu cho chế phẩm enzyme pectinase.. - Pectinase có tác dụng làm tăng hiệu suất chất chiết, làm trong và lọc dịch quả rất dễ dàng, do đó làm tăng

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ ENZYME

ĐỀ TÀI KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM ENZYME PECTINASE CÔNG NGHIỆP

GVHD: Nguyễn Thị Nam Phương

Sinh viên thực hiện: Nhóm 3

LTH MSSV: 2008190334

1 MỤC ĐÍCH

 Xác định được thông số động học của enzyme pectinase (Vmax, KM)

 Xây dựng phương trình động học Michaelis - Menten

 Hiểu được ý nghĩa của các thông số động học

 Xác định được pH, nhiệt độ hoạt động tối ưu cho chế phẩm enzyme pectinase

2 CƠ SỞ LÝ THUYẾT

- Pectinase là enzyme xúc tác sự thủy phân pectin, sản phẩm tạo thành của quá trình này là acid galacturonic, galactose, arabinose, methanol đây là nhóm ezyme được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chỉ đứng sau protease và amylase

- Pectinase có tác dụng làm tăng hiệu suất chất chiết, làm trong và lọc dịch quả rất dễ dàng, do đó làm tăng hiệu suất sản phẩm nên pectinase thường đươc ứng dụng trong sản xuất rượu vang, nước trái cây và nước uống không có cồn, nước trái cây cô đặc, mứt nhừ, mứt đông, nước giải khát, sản xuất cà phê và cà phê hòa tan,…Không những vậy, các chế phẩm pectinase còn được ứng dụng trong việc trích ly các hợp chất dược liệu, hợp chất tạo màu, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi,…

- Hiện nay, hệ thống enzyme pectinase được chia thành 2 nhóm chính: hydrolase và transeliminase với đặc điểm chung nhất là làm giảm độ nhớt của dung dịch pectin và làm giảm phân tử lượng của các sản phẩm tạo thành

- Cũng như các loại enzyme khác, enzyme pectinase cũng nhạy cảm với sự thay đổi của nhiệt độ và pH môi trường Nhiệt độ, pH của môi trường ở mỗi mức độ khác nhau sẽ có mức độ ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của enzyme khác nhau Và mỗi loại enzyme sẽ có ngưỡng nhiệt độ, pH tối

ưu khác nhau mà tại đó enzyme hoạt động cao nhất

- Ngoài ra, còn nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến hoạt động của các chế phẩm enzyme như các ion kim loại, ánh sáng, sóng siêu âm, phương thức

và thời gian bảo quản enzyme

3 HÓA CHẤT - DỤNG CỤ - THIẾT BỊ

3.1.Hóa chất

7 Potasium sodium tartrate

(KNaC4H4O6·4H2O)

10 Đệm Hydrochloric acid - Potassium

Chloride

0.1 M

pH = 1 và pH = 2

100 mL

12 Đệm acid citric - Na2HPO4 PH = 3, 4, 5 300 mL

3.2.Dụng cụ

STT TÊN DỤNG CỤ Quy cách

2 Cốc thủy tinh 100, 250, 500, 1000 mL

9 Bình định mức 50, 100, 250, 500 mL

11 Đũa thủy tinh

14 Micropipette

15 Đầu típ

16 Quả bóp cao su

17 Đũa thủy tinh

3.3.Thiết bị

STT TÊN THIẾT BỊ Quy cách

2 Bể ổn nhiệt

5 Máy khuấy từ

8 Máy đo quang phổ Vùng UV - VIS

3.4.Cách pha hóa chất

- Pha dung dịch đệm acid citric - Na2HPO4 (Đệm citrate):

 Dung dịch acid citric 0.1M: Hòa tan 10.504g acid citric (C6H8O7) bằng nước cất → Định mức đến 500mL → Dung dịch A

 Dung dịch Na2HPO4 0.2M: Hòa tan 71.7g Na2HPO4.12H2O bằng nước cất → Định mức đến 500mL → Dung dịch B

 Dung dịch đệm acid citric - Na2HPO4 (Đệm citrate) có pH khác nhau phụ thuộc vào số mL dung dịch A và B với tổng thể tích 100 mL

Acid citric 0.1M (Dung dịch A)

Na 2 HPO 4 0.2M (Dung dịch B)

pH

- Pectine 1%: Cân 1g peptin cho vào cốc rồi hòa tan bằng nước ấm → Định mức đến 100mL

- Pectinase 2%: Cân 2g pectinase cho vào cốc rồi hòa tan trong 200mL dung dịch đệm citrate pH=5

- Thuốc thử DNS 1%:

 Cân 5g DNS cho vào cốc rồi hòa tan bằng nước cất ở 50oC → Định mức đến 200mL → Dung dịch A

 Cân 8g NaOH cho vào cốc rồi hòa tan bằng nước cất → Định mức đến 50mL → Dung dịch B

 Cân 150g muối Potasium sodium tartrate (KNaC4H4O6·4H2O) cho vào cốc rồi hòa tan bằng nước cất → Định mức đến 150mL→ Dung dịch C

 Cho lần lượt dung dịch B và C vào dung dịch A → Bổ sung nước cất cho đủ 500 mL rồi bảo quản dung dịch trong chai thủy tinh sẫm màu

→ Chuẩn lại DNS 1% bằng cách thêm 3 giọt phenolphtalein → Nhỏ từ

từ dung dịch HCl 0.1N cho tới khi mất màu hồng của phenolphtalein (Nếu dùng hết 5 - 6 mL HCl 0.1N là được)

- Pha dung dịch đệm acetate pH = 5.5: Cân 13.6g sodium acetate hòa tan trong 25 mL nước cất ở 50oC → Cho từ từ 2.5 mL acetic acid đặc → Định mức bằng nước cất đến 50 mL

- D-galacturonic acid 1%: Cân 1g D-galacturonic acid hòa tan bằng nước cất

và định mức đến 100mL

- Đệm Hydrochloric acid - Potassium Chloride: Cân 0.745g KCl → Thêm 0.2mL HCl → Điều chỉnh pH → Thêm nước cất cho đủ 10 mL

- Dung dịch đệm phosphate (pH 6, 7, 8):

 Dung dịch NaH2PO4 0.2M: Cân 27.8g NaH2PO4 cho vào cốc rồi hòa tan bằng nước cất → Định mức đến 500mL → Dung dịch a

 Dung dịch Na2HPO4 0.2M: Cân 71.7g Na2HPO4.12H2Ocho vào cốc rồi hòa tan bằng nước cất → Định mức đến 500mL → Dung dịch b

 Dung dịch đệm phosphat có pH khác nhau phụ thuộc vào số mL dung dịch a và số mL dung dịch b với tổng thể tích là 200ml

NaH 2 PO 4 0.2M

(Dung dịch a)

Na 2 HPO 4 0.2M (Dung dịch b)

4 NỘI DUNG THỰC HÀNH

4.1 Xác định hoạt tính enzyme pectinase bằng phương pháp so màu

 Phương pháp so màu: Dựa trên việc so sánh cường độ màu của dung dịch nghiên cứu với cường độ màu của dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định

 Nguyên tắc: Enzyme Pectinase + pectin → Acid galacturonic → Thêm thuốc thử DNS (dinitrosalicylic acid) → Đo mật độ quang ở bước sóng 575nm Dựa vào đồ thị đường chuẩn glucose với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu

 Hoạt tính enzyme pectinase được đo bởi lượng đường khử được cắt ra từ pectin bằng phương pháp dinitrosalicylic acid (DNS) Một đơn vị hoạt độ enzyme pectinase là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1mol acid D-galacturonic từ pectin trong một phút ở 37oC, pH=5.5

 Cách tiến hành:

 Xây dựng đường chuẩn D-galacturonic acid ở 5 nồng độ khác nhau (0,

1, 2, 3, 4, 5) bằng cách pha dd D-galacturonic acid 1% với nước cất theo tỷ lệ tương ứng Sau đó, thêm lần lượt vào mỗi ống 3ml thuốc thử DNS:

Hóa chất Đơn vị Các ống nghiệm

D-galacturonic acid 1% mL 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Nước cất mL 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5

Lắc đều và để yên 20 phút

Đo OD tại λ=575nm

- Dùng phần mềm Microsoft Excel để vẽ đường chuẩn với trục tung y là giá trị đo OD ở bước sóng 575nm, trục hoành x là nồng độ D-galacturonic acid, hệ số tương quan R2, đồ thị có dạng đường thẳng y= ax + b

 Xác định hoạt tính enzyme pectinase: Lấy 0,5 ml enzymepectinase 2% + 0.5 ml pectin 1% → Thêm 0.5ml đệm acetate 0.1M → Để yên ở

37oC trong 60 phút → Thêm 3ml thuốc thử DNS 1% → Đun sôi trong

15 phút (để thuốc thử hiện màu) → Đo OD ở bước sóng 575 nm → Xác định hoạt độ enzyme pectinase

 Một đơn vị hoạt tính enzyme pectinase được đo bởi 1µmol galacturonic acid giải phóng trong 1 phút trên 1mL

4.2 Xác định thông số động học của enzyme pectinase

- Tiến hành thí nghiệm:

 Lập đường chuẩn D-galacturonic acid: Ghi nhận đường chuẩn ở 4.1

 Xây dựng đồ thị Lineweaver - Burk: Chuẩn bị 12 ống nghiệm và tiến hành xác định thông số động học enzyme pectinase như sau:

Hóa chất Đơn vị Các ống nghiệm

0 1 2 3 4 5

Đệm citrate pH = 5.0 mL 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0

Để yên ở 37oC trong 30 phút Dùng giấy nhôm bịt kín các đầu ống nghiệm rồi đun cách thủy trong 3 phút

Làm nguội rồi lọc lấy dịch

Hóa chất Đơn vị Các ống nghiệm

0’ 1’ 2’ 3’ 4’ 5’

Dùng giấy nhôm bịt kín các đầu ống nghiệm rồi đun cách thủy trong 15 phút

Làm lạnh đến nhiệt độ phòng

Đo OD tại λ=575nm

Chú ý: Ống 0 là ống kiểm chứng, các ống khác là ống nghiệm

- Lượng sản phẩm tạo thành được xác định dựa vào đường chuẩn D-galacturonic acid và qua đó, xây dựng đồ thị của phương trình Lineweaver

- Burk, rồi từ đó xác định được thông số động học Km và Vmax của enzyme pectinase

4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzyme pectinase

- Tiến hành thí nghiệm: Chuẩn bị 7 ống nghiệm và tiến hành như sau:

Hóa chất Đơn Các ống nghiệm

Để yên ở 37oC trong 10 phút

Giữ ở nhiệt độ 25oC 30oC 37oC 40oC 45oC 50oC 55oC

Để yên trong 30 phút

Bịt đầu ống nghiệm bằng giấy nhôm, lắc đều rồi đun ở 100oC trong 15 phút

Để nguội ở nhiệt độ phòng

Đo OD tại λ=575nm

4.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme pectinase

- Tiến hành thí nghiệm:

 Chuẩn bị 7 ống nghiệm với các dung dịch đệm pH tương ứng từ 1 - 8

đã được chuẩn bị ở 3.4.

 Tiến hành như sau:

vị

Các ống nghiệm

Dung dịch đệm với các khoảng

pH khác nhau

Để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng

DNS 1% mL 3.0

Bịt đầu ống nghiệm bằng giấy nhôm rồi đun cách thủy trong 15 phút

Để nguội ở nhiệt độ phòng

Đo OD tại λ=575nm

5 KẾT QUẢ

5.1 Xác định hoạt tính enzyme pectinase bằng phương pháp so màu

HđPe = X V K 1000 t v 194 (UI/mL)

- Trong đó:

 X là lượng acid D-galcturonic được suy ra từ đường chuẩn (mg)

 V là tổng thể tích hỗn hợp enzyme phản ứng (mL)

 v là thể tích dịch lọc đem phân tích (mL)

 K là độ pha loãng của mẫu

 t là thời gian phản ứng (phút)

 194 là hệ số chuyển đổi đơn vị

 HđPe là hoạt độ enzyme pectinase (UI/mL)

- Tổng thể tích hỗn hợp enzyme phản ứng (V) = Thể tích dịch lọc đem phân tích (v) = 1.5mL

- Thời gian phản ứng là 60 phút nên t=60

- Từ đường chuẩn D-galacturonic acid ta có:

5.2 Xác định thông số động học của enzyme pectinase

- Đồ thị Lineweaver-Burk:

- Hằng số Michaelis Menten (Km) đặc trưng cho ái lực giữa enzyme pectinae

và cơ chất pectin Khi Km càng nhỏ thì ái lực của enzyme và cơ chất càng lớn (vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác càng lớn) Dựa vào mối tương quan giữa vận tốc phản ứng của enzyme và nồng độ cơ chất xây dựng phương trình Lineweaver-Burk có dạng y = … x + …., từ đó tính được

Km= … (mg/ml) và Vmax= … (mg/ml/phút)

5.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzyme pectinase

- Đồ thị ảnh hưởng nhiệt độ:

- Hoạt tính enzyme tăng nhẹ từ … đến ….°C, tăng nhanh từ … đến ….°C, từ

….đến……°C hoạt tính enzyme giảm nhẹ, từ … đến ….°C, hoạt tính enzyme giảm mạnh và từ ……°C thì enzyme gần như mất hoạt tính Vậy hoạt tính enzyme tối ưu ở ……°C (……UI/g)

- Có thể thấy, đa số enzyme bị mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70°C và phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40-50°C

5.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme pectinase

- Đồ thị ảnh hưởng pH :

- Hoạt tính enzyme tăng dần khi pH …… từ … đến … và đạt giá trị lớn nhất

ở pH … (….UI/g) Sau đó hoạt tính enzyme giảm mạnh khi pH … từ … đến … , đặc biệt ở pH từ … đến … thì enzyme gần như mất hoạt tính

6 NHẬN XÉT VÀ KẾT LUẬN

…

………

………

………

………

… ………

………

… ………

………

… ………

………

… ………

………

………

………

…

………

………

7 TÀI LIỆU THAM KHẢO

[7.1] Lê Thanh Mai và cộng sự (2009) Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men

[7.2] Hiền, đ T., & trang, h P P (2019) Bước đầu nghiên cứu tạo enzyme pectinase dạng bột từ aspergillus niger và khảo sát một số đặc

tính của chế phẩm. Tạp chí khoa học đại học mở thành phố hồ chí minh-kỹ thuật và công nghệ, 14(1), 27-38.

[7.3] Đỗ Thị Hiền (2021) Giáo trình “Kiểm nghiệm các chế phẩm enzyme” Trường đại học Công nghiệp Thực phẩm thành phố Hồ Chí

Minh